基于PMA-qPCR方法檢測獸用消毒劑對非洲豬瘟病毒的滅活效率

楊 悅，邵 靚，張鵬飛，陳弟詩，陳婉婷，王 印，3，*，羅 燕，3，楊澤曉，3，姚學(xué)萍，3，任梅滲，3

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 611130； 3.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的一種豬急性和烈性傳染病。強毒株可引起豬的高死亡率，達(dá)90%以上[1]。由于該病的嚴(yán)重危害性與病原致病機理的復(fù)雜性，且無有效疫苗進行防控，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。目前針對ASFV疫情，我國建立了以清洗消毒為預(yù)防手段，以隔離封鎖和精準(zhǔn)剔除為控制手段的一整套生物安全防控體系。其中，清洗消毒是防疫于未然的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但目前防控中常見消毒劑濫用、錯用等問題，導(dǎo)致消毒效果不佳，養(yǎng)豬場防疫能力低下，且缺乏科學(xué)的消毒效果評估體系，阻礙了防控手段技術(shù)的更新，是疫情未得到有效控制的重要原因之一。

本研究建立了可檢測非洲豬瘟病毒衣殼完整性的PMA-qPCR方法，又稱活力PCR(viability PCR，vPCR)，該方法原理建立在疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)作用機理之上，PMA是一種疊氮類核酸染料，對核酸具有高度親和力，能夠進入病毒衣殼破損的失活病毒內(nèi)部，在強光作用下，所帶的光敏性疊氮基團轉(zhuǎn)化為高活性的氮賓自由基[2-3]，并與結(jié)合位點附近的任意碳?xì)浠衔锓磻?yīng)形成穩(wěn)定的共價氮碳鍵[4-5]，致使核酸分子永久修飾，最后阻斷核酸分子的擴增，消除了失活病毒核酸對檢測結(jié)果的影響[6-7]；同時，由于活性病毒具有完整的衣殼，PMA被阻隔在病毒之外，故不能阻斷活性病毒核酸分子的擴增[8-11]。此外，駐留在溶液中沒有與核酸分子進行交聯(lián)的PMA在強光照射的同時與水分子反應(yīng)生成沒有活性的羥胺[12]。PMA具有結(jié)合游離核苷酸使其不能在PCR中擴增的特性[13-15]，結(jié)合qPCR，就能通過PMA-qPCR定量檢測樣品中完整病毒粒子的數(shù)量。PMA-qPCR方法可以用于檢測細(xì)菌或病毒是否具有完整結(jié)構(gòu)、病毒理化特性研究、篩選消毒劑品類與最佳作用條件、評價生物安全措施效果[16]，在ASFV的防控中具有極大的應(yīng)用潛能。

目前豬場常用的消毒劑主要有酚類、醛類、醇類、酸類、堿類、鹵化物類、過氧化物類和季銨鹽類等，種類繁多，各類消毒劑均有其優(yōu)缺點。探尋高效消毒劑，使用高效經(jīng)濟的手段達(dá)到預(yù)期的生物安全防控效果，是科研力量集中的方向之一。本研究擬通過建立PMA-qPCR方法對消毒劑的消毒效果進行評估，并探究消毒劑的最佳作用條件。該結(jié)果可為豬場生物安全的消毒環(huán)節(jié)提供參考，為臨床生產(chǎn)中消毒劑的選擇、作用條件提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

非洲豬瘟陽性病豬脾、腎組織由四川省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室保存，孔徑0.22 μm綠色針式過濾器購自成都浩搏優(yōu)科技有限公司，PMA購自Biotium公司，Pro Taq HS預(yù)混型探針法qPCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，通用型基因組DNA提取試劑盒購自柯菲特(香港)國際貿(mào)易有限公司。

1.2 ASFV-PMA-qPCR方法的建立

1.2.1 ASFV引物及探針合成

參照《T/CVMA 5—2018 非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法》合成引物與探針，序列見表1。

1.2.2 ASFV-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

提取ASFV陽性組織DNA，采取上述特異性引物PCR擴增目的基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段，克隆至pMD19-T載體。利用NanoDrop 2000核酸蛋白分析儀測定重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，并計算其拷貝數(shù)。將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至104～1010拷貝·μL-1并作為模板，進行qPCR擴增。以循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)、模板稀釋度為橫坐標(biāo)，建立qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 引物與TaqMan探針序列信息

1.2.3 PMA-qPCR方法建立

將ASFV陽性組織研磨成勻漿，用無菌0.22 μm濾頭過濾制成病毒液，分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｖ苽?0 mm×10 mm的無菌方形濾紙片若干作為吸附介質(zhì)，平鋪于無菌平皿內(nèi)，逐片滴加20 μL病毒液，以作含毒載片。置室溫下自然陰干后備用。

按表2設(shè)置實驗分組，將第1、3組樣品高壓蒸汽滅菌，第2、4組樣品常溫放置，每組重復(fù)處理3次，每個重復(fù)3張含毒載片。處理后加入500 μL無菌雙蒸水，振蕩離心。取200 μL各處理組樣本，第1、2組分別加20 μL(0.1 mg·mL-1)PMA染液，第3、4組分別加20 μL無菌雙蒸水，混勻后置于暗室孵育20 min。將所有管置于冰盒上，在500 W鹵素?zé)粝抡丈?0 min，期間每隔5 min翻轉(zhuǎn)離心管，使其均勻曝光。使用通用型基因組DNA提取試劑盒提取上述各處理組所得含毒載片懸液中的病毒DNA，具體操作步驟參考試劑盒說明書，提取所得DNA分裝于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂?.2.1節(jié)中引物與探針，參照《T/CVMA5—2018非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法》進行qPCR檢測，每組樣本設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；在每次循環(huán)的60 ℃退火延伸時收集熒光信號。試驗結(jié)束后，根據(jù)收集的Ct值判定結(jié)果，并計算拷貝數(shù)。

表2 PMA-qPCR分組

1.3 消毒劑作用效果的評估

1.3.1 消毒劑作用

按生產(chǎn)常用濃度配制消毒劑。為符合生產(chǎn)操作，無特殊說明者，一律使用硬水配制，即配即用。消毒液的稀釋度與種類為0.5%過硫酸氫鉀復(fù)合物、1%二氯異氰尿酸鈉、2.5%二氧化氯、0.2%復(fù)合碘、0.5%辛硫磷、0.2%復(fù)合戊二醛季銨鹽溶液、1%復(fù)合有機酸、0.5%溴化二甲基二癸基羥胺、0.25%戊二醛-癸甲溴胺溶液。

試驗組：用200 μL配置好的各組消毒劑充分浸泡含毒載片，靜置30 min后，取出含毒載片于含500 μL無菌蒸餾水的離心管中振蕩混勻，8 000×g離心2 min，取200 μL上清液備用。每組消毒劑做3個重復(fù)，每個重復(fù)3張含毒載片。

陽性對照組：含毒載片經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理，用無菌雙蒸水代替消毒劑溶液，作用至30 min，加入500 μL無菌雙蒸水，振蕩混勻，8 000×g離心2 min，上清液作為陽性對照組樣本備用。

陰性對照組：含毒載片經(jīng)常溫放置處理，用無菌雙蒸水代替消毒劑溶液，作用至30 min，加入500 μL無菌雙蒸水，振蕩混勻，8 000×g離心2 min，上清液作為陰性對照組樣本。所得結(jié)果代表病毒液原有拷貝數(shù)，以其作為計算滅活對數(shù)的初始拷貝數(shù)。

1.3.2 PMA-qPCR

取200 μL各處理組樣本，分別加入20 μL PMA染液(0.1 mg·mL-1)，置于暗室孵育20 min。將所有管置于冰上，在500 W鹵素?zé)粝抡丈?0 min后，使用通用型基因組DNA提取試劑盒提取上述各處理組樣品的病毒DNA，用于qPCR檢測。試驗結(jié)束后，根據(jù)收集的Ct值判定結(jié)果，并計算拷貝數(shù)。

1.4 消毒劑最佳作用條件的優(yōu)化

在上述消毒劑中，選取消毒效果最好的一種消毒劑，按照1.3節(jié)方法依次進行消毒劑的工作濃度(2%～0.2%稀釋)、作用時間(1～30 min)的優(yōu)化，篩選出消毒劑的最適作用濃度和最佳作用時間。

圖1 ASFV-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ASFV-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 ASFV-PMA-qPCR方法的建立

2.1.1 ASFV-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

將ASFV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至104～1010拷貝·μL-1并作為模板，進行qPCR擴增。以循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)、模板稀釋度為橫坐標(biāo)，建立qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=-3.084x+45.770，E=111.0%，R2=0.995，x代表模板的起始拷貝濃度(copies·μL-1)的對數(shù)，y代表樣品擴增的Ct值。

2.1.2 PMA-qPCR方法結(jié)果

由4組實驗結(jié)果(表3、圖2)可見，第1組(高壓蒸汽滅菌、添加PMA)qPCR沒有擴增曲線，第3組(高壓蒸汽滅菌、不添加PMA)有典型的S型擴增曲線，證明通過PMA處理阻止了失活病毒PCR擴增。第2組(常溫處理、添加PMA)和第4組(常溫處理、不添加PMA)都有典型的S型擴增曲線，證明PMA處理不會阻止完整病毒PCR擴增。由此可見，通過PMA-qPCR方法可以檢測病毒是否具有完整結(jié)構(gòu)。

表3 PMA-qPCR各實驗組Ct值

1～4，PMA-qPCR實驗第1～4組擴增曲線。1-4， Amplification curves for groups 1-4 of the PMA-qPCR experiment.圖2 PMA-qPCR各實驗組擴增曲線Fig.2 PMA-qPCR amplification curve of each experimental group

2.2 消毒劑作用效果的評估

用9種不同消毒劑處理后，提取病毒DNA進行PMA-qPCR檢測，每組重復(fù)處理3次。收集各組Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算病毒拷貝數(shù)，采用方差檢驗法(t檢驗)對各組拷貝數(shù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，各組P值均小于0.000 1(圖3)。

****表示達(dá)到0.000 1 顯著水平。1～9，1～9號消毒劑，具體見表4。**** meant significant differences at the levels of 0.000 1.1-9， No. 1-9 disinfectants, shown in Table 4.圖3 消毒劑作用后剩余病毒拷貝數(shù)Fig.3 Copy number of virus left after disinfectants

對拷貝數(shù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換處理，用病毒滅活率公式計算各組消毒劑對ASFV的滅活率，病毒滅活率(%)=[1-10(陰性組病毒拷貝數(shù)-實驗組病毒拷貝數(shù))]×100。結(jié)果(表4)表明，ASFV對不同種類的消毒劑有不同的敏感性，對過硫酸氫鉀復(fù)合物的敏感性最高；寄生蟲藥物(辛硫磷)也能滅活81.75%的ASFV。

表4 不同消毒劑對ASFV的滅活率

2.3 消毒劑最佳作用條件的優(yōu)化

選取消毒效果最好的過硫酸氫鉀復(fù)合物消毒劑，稀釋為2、2.5、3、5、10、20 g·L-1并與含毒載片反應(yīng)30 min，提取病毒DNA進行PMA-qPCR檢測，每組重復(fù)處理3組，計算滅活率。2～20 g·L-1過硫酸氫鉀復(fù)合物溶液能不同程度地滅活A(yù)SFV，質(zhì)量濃度大于5 g·L-1的過硫酸氫鉀復(fù)合物溶液對ASFV的滅活率能達(dá)到99%以上，質(zhì)量濃度小于5 g·L-1的過硫酸氫鉀復(fù)合物溶液對ASFV的滅活率隨質(zhì)量濃度減小而逐漸下降(圖4-A)，所以5 g·L-1是在能達(dá)到良好消毒效果要求下最經(jīng)濟的用量。

將過硫酸氫鉀復(fù)合物消毒劑稀釋到5 g·L-1，按1、5、10、15、20、25、30 min時間梯度處理含毒載片，提取病毒DNA進行PMA-qPCR檢測，每組重復(fù)處理3組，計算滅活率。結(jié)果(圖4-B)表明，病毒滅活率隨作用時間的延長而升高，過硫酸氫鉀復(fù)合物溶液作用1 min即可滅活97.19%的ASFV，作用20 min滅活率提升到99%。實際生產(chǎn)中，應(yīng)盡量延長作用時間。

A，不同質(zhì)量濃度過硫酸氫鉀復(fù)合物對ASFV的滅活率；B，過硫酸氫鉀復(fù)合物不同作用時間對ASFV的滅活率。A， Inactivation rate of potassium persulfate complex at different concentrations on ASFV； B， Inactivation rate of potassium persulfate complex on ASFV at different action times.圖4 過硫酸氫鉀復(fù)合物優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization results of potassium hydrogen persulfate complex

3 討論

本研究建立了PMA-qPCR方法，通過此方法測定了常用消毒劑對ASFV的滅活效果，篩選出了效果最好的消毒劑，優(yōu)化了消毒劑的最佳使用質(zhì)量濃度、作用時間。王巍等[17]總結(jié)闡述了養(yǎng)殖場常用消毒劑滅活A(yù)SFV的原理，發(fā)現(xiàn)消毒劑均能直接破壞病毒衣殼或阻斷膜上生化反應(yīng)，最終使病毒失去結(jié)構(gòu)完整性，所以使用PMA-qPCR方法能夠更加方便快捷地得出常用消毒劑對ASFV的滅活效率。以往若要確定病毒是否具有感染性，需進行細(xì)胞實驗或動物實驗，如血細(xì)胞吸附試驗(hemadsorption，HAD)，該方法原理是ASFV的EP402R基因編碼的外囊膜蛋白CD2v能夠誘導(dǎo)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，但實驗所需的豬肺泡巨噬細(xì)胞價格昂貴，且ASFV細(xì)胞感染試驗需要在Ⅲ級生物安全實驗室(BSL-3)內(nèi)進行，強陽性樣品在接種細(xì)胞后24 h內(nèi)可觀察到紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象[17-18]。細(xì)胞或動物實驗操作繁瑣，容易被受體細(xì)胞或受體動物個體差異影響。PMA-qPCR方法能夠簡捷快速地檢測ASFV的活性，可用于鑒別包膜結(jié)構(gòu)完整的ASFV。相較于細(xì)胞或動物實驗，PMA-qPCR方法的優(yōu)點在于避免了細(xì)胞培養(yǎng)、動物飼養(yǎng)，更加便捷、經(jīng)濟、準(zhǔn)確，且可以定量。PMA-qPCR方法用于病原微生物的檢測，具有廣闊的應(yīng)用前景與實際價值。

本研究結(jié)果顯示，目前使用的消毒劑種類中，過氧化物類和鹵素類的消毒效果較好，滅活率能達(dá)到95%以上，醛類和季銨鹽類次之。縱觀所測試品類的消毒劑，過硫酸氫鉀復(fù)合物消毒效果最好。該結(jié)果可為過硫酸氫鉀復(fù)合物用于養(yǎng)殖場內(nèi)場地、物品消毒提供參考。消毒效果隨消毒劑作用時間和作用質(zhì)量濃度變化而變化，消毒劑質(zhì)量濃度越高、作用時間越長，消毒效果越好，但實際生產(chǎn)中還要考慮使用成本，所以養(yǎng)殖場應(yīng)選用最低的稀釋比例達(dá)到最高的消毒效果，并盡量延長作用時間。

在規(guī)?；B(yǎng)殖生產(chǎn)中，正確使用化學(xué)消毒劑至關(guān)重要，而許多養(yǎng)殖戶對常用消毒劑了解不深，經(jīng)常錯用、濫用，從而影響了畜牧業(yè)生產(chǎn)的健康發(fā)展。因此，如何恰當(dāng)?shù)剡x擇消毒劑并合理利用對有效抵御病毒感染十分關(guān)鍵。提高對生物安全方面的重視程度，建立完善的生物安全防控體系是應(yīng)對非洲豬瘟問題的必經(jīng)之路，所以生豬養(yǎng)殖業(yè)的相關(guān)從業(yè)人員要加強對生物安全防控的重視，使養(yǎng)豬場逐漸規(guī)模化，從而為建立科學(xué)、完善的生物安全防控體系提供條件。