芹菜素磷脂復(fù)合物納米混懸劑制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

宋文穎，于雅琴

（珠海科技學(xué)院，廣東 珠海 519041）

芹菜素屬于黃酮類化合物，大量存在于橘子、洋蔥、歐芹、柑橘等植物中［1］，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、降血壓、心肌保護(hù)等活性［1-3］，開(kāi)發(fā)價(jià)值大，但該成分溶解度僅為1.35 μg／mL［4］，并且溶出度低，體內(nèi)易受胃腸道酶、pH 值的影響［5］，導(dǎo)致其口服吸收困難。目前，已有關(guān)于芹菜素固體分散體［4］、磷脂復(fù)合物［4］、固體脂質(zhì)納米粒［6］等方面的研究，但固體分散體或磷脂復(fù)合物改善吸收程度有限［4］，而固體脂質(zhì)納米粒往往存在載藥量較低等問(wèn)題。

納米混懸劑可提高難溶性藥物的溶解度、溶出度、生物利用度等參數(shù)［7-9］，應(yīng)用潛力較大，于世龍［10］采用二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑制備芹菜素納米混懸劑，但它難以除去，而且具有一定毒性［11］，影響了推廣價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用磷脂復(fù)合物增加芹菜素在有機(jī)溶劑（如乙醇）中的溶解度，可為后續(xù)其納米混懸劑的制備奠定基礎(chǔ)［4，12］，并且磷脂復(fù)合物一般存在黏性大、溶出度低、生物利用度提高程度受限等問(wèn)題［13-14］，而將其進(jìn)一步制成納米混懸劑后可有效解決這些缺陷，能為后續(xù)相關(guān)研究提供新思路。

1 材料

SQP 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；08-2G 型恒溫加熱磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；安捷倫1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Master-sizer 型粒度分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；ATS 型均質(zhì)機(jī)（加拿大SEEKER 公司）；MIX-2500 型渦旋混合器（常州金壇良友儀器有限公司）；HNDK400 型氮?dú)獯祾邇x（上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司）；BCD-206TAS 型冰箱（青島海爾股份有限公司）。

芹菜素對(duì)照品（批號(hào)191105，純度98%，南京青澤醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司）；芹菜素原料藥（批號(hào)Y190915，純度96.5%，山東永信中和生物科技有限公司）。磷脂酰膽堿（批號(hào)20191012，上海輔必成醫(yī)藥科技有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS，批號(hào)20200124，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30，批號(hào)250015427，美國(guó)Ashland 公司）。

清潔級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量（240±20）g，雌雄兼具，購(gòu)于河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2016-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米混懸劑制備 參考文獻(xiàn)［12，14］報(bào)道，采用高壓均質(zhì)法。取芹菜素原料藥100 mg、磷脂300 mg，置于燒杯中（摩爾比約1∶1），加入50 mL 乙酸乙酯制成混懸液，50 ℃水浴磁力攪拌至溶液澄清（約2.5 h），減壓旋蒸除去乙酸乙酯，加入5 mL 無(wú)水乙醇復(fù)溶，作為有機(jī)相；稱取處方量PVP K30、泊洛沙姆188，溶于100 mL 蒸餾水中，加熱至50 ℃，作為水相，將有機(jī)相加到水相中，減壓旋蒸10 min 后在一定壓力下循環(huán)均質(zhì)數(shù)次，蒸餾水定容至100 mL，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 HPLC 法測(cè)定芹菜素含量

2.2.1 色譜條件 Agilent-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；體積流量水-甲醇（70∶30）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm；進(jìn)樣量20 μL。理論塔板數(shù)以芹菜素計(jì)，不低于6 500。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取芹菜素對(duì)照品適量，甲醇制成每1 mL 含100 μg 該成分的對(duì)照品溶液，流動(dòng)相依次稀釋至20、10、5、0.5、0.1、0.05 μg／mL，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝24.147 2X－9.425 7（r＝0.999 9），在0.05～20 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 供試品溶液制備 取1 mL 納米混懸劑，置于100 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解并定容，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察 取供試品溶液適量，室溫下于0、4、8、12、24、48 h 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芹菜素峰面積RSD 為0.19%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取20、5、0.05 μg／mL 對(duì)照品溶液適量，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得芹菜素含量RSD 分別為0.24%、0.31%、0.23%，表明儀器精密度良好。取納米混懸劑適量，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芹菜素含量RSD 為1.40%，表明該方法重復(fù)性良好。取0.5 mL 納米混懸劑，置于100 mL 量瓶中，平行9 份，分為高、中、低3 組，分別加入對(duì)照品溶液（100 μg／mL）6、5、4 mL，再加入甲醇超聲溶解并定容，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芹菜素平均加樣回收率分別為100.87%、99.46%、99.03%，RSD 分別為0.74%、1.19%、0.63%。

2.3 粒徑、PDI、Zeta 電位測(cè)定 取納米混懸劑0.5 mL，蒸餾水稀釋30 倍，混勻后取適量至比色皿中，在粒度分析儀上測(cè)定。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 穩(wěn)定劑用量 固定PVP K30 與泊洛沙姆188 比例為1∶1，均質(zhì)壓力為100 MPa，均質(zhì)次數(shù)為8 次，考察穩(wěn)定劑用量50、100、150、200 mg對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。由此可知，當(dāng)穩(wěn)定劑用量較小時(shí)，粒徑、PDI 較高，Zeta 電位絕對(duì)值較低；隨著用量增加，粒徑、PDI逐漸降低，Zeta 電位絕對(duì)值逐漸升高，但過(guò)大時(shí)粒徑、PDI 反而又有升高趨勢(shì)。最終，選擇穩(wěn)定劑用量為150 mg。

表1 穩(wěn)定劑用量對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.1 Effects of stabilizer consumption on particle size，PDI and Zeta potential（n＝3）

2.4.2 PVP K30 與泊洛沙姆188 比例 固定穩(wěn)定劑用量為150 mg，均質(zhì)壓力為100 MPa，均質(zhì)次數(shù)為8 次，考察PVP K30 與泊洛沙姆188 比例對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，當(dāng)PVP K30 用量逐漸增加時(shí)，粒徑、PDI 先降低后升高；當(dāng)兩者比例為1∶2 時(shí)，粒徑、PDI較低，Zeta 電位絕對(duì)值較高。最終，選擇PVP K30與泊洛沙姆188 比例為1∶2。

表2 PVP K30 與泊洛沙姆188 比例對(duì)粒徑、PDI、Zeta電位的影響（n＝3）Tab.2 Effects of PVP K30-Poloxamer 188 ratio on particle size，PDI and Zeta potential（n＝3）

2.4.3 均質(zhì)壓力 固定穩(wěn)定劑用量為150 mg，PVP K30 與泊洛沙姆188 比例為1∶2，均質(zhì)次數(shù)為8 次，考察均質(zhì)壓力對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，隨著均質(zhì)壓力增加，粒徑、PDI 先降低后升高；當(dāng)均質(zhì)壓力為110 MPa 時(shí)，PDI、Zeta 電位絕對(duì)值與100 MPa 時(shí)相比差異不大，但粒徑低于200 nm。最終，選擇均質(zhì)壓力為110 MPa。

表3 均質(zhì)壓力對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.3 Effects of homogenization pressure on particle size，PDI and Zeta potential（n＝3）

2.4.4 均質(zhì)次數(shù) 固定穩(wěn)定劑用量為150 mg，PVP K30 與泊洛沙姆188 比例為1∶2，均質(zhì)壓力為110 MPa，考察均質(zhì)次數(shù)對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。由此可知，隨著均質(zhì)次數(shù)增加，粒徑、PDI 先降低后升高；當(dāng)均質(zhì)次數(shù)為10 次時(shí)，粒徑、PDI 較低，Zeta 電位絕對(duì)值較高。最終，選擇均質(zhì)次數(shù)為10 次。

表4 均質(zhì)次數(shù)對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.4 Effects of homogenization frequency on particle size，PDI and Zeta potential（n＝3）

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定最優(yōu)制備工藝為取芹菜素100 mg、磷脂酰膽堿300 mg，置于燒杯中，加入50 mL 乙酸乙酯制成混懸液，50 ℃水浴磁力攪拌至溶液澄清（約2.5 h），減壓旋蒸除去乙酸乙酯得熔融液，加入5 mL 無(wú)水乙醇復(fù)溶，作為有機(jī)相；以PVP K30 與泊洛沙姆188比例為1∶2 共取150 mg，溶于100 mL 蒸餾水中，加熱至50 ℃后加到熔融液中，立即在110 MPa 均質(zhì)壓力下循環(huán)均質(zhì)10 次，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得。平行制備3 批樣品，按“2.3” 項(xiàng)下方法測(cè)得平均粒徑為193.51 nm（圖1），PDI 為0.172，Zeta 電位為－36.48 mV（圖2）。

圖1 芹菜素磷脂復(fù)合物納米混懸劑Zeta 電位Fig.1 Zeta potential of nanosuspensions of apigenin phospholipids complex

圖2 芹菜素磷脂復(fù)合物納米混懸劑粒徑分布Fig.2 Particle size of nanosuspensions of apigenin phospholipids complex

2.6 載藥量測(cè)定 取1 mL 納米混懸劑至100 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并定容，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算芹菜素含量M1；取1 mL 納米混懸劑，在－30 ℃下預(yù)凍2 d 后在－20 ℃下真空冷凍干燥1 d，稱定粉末質(zhì)量M0，計(jì)算載藥量，公式為載藥量＝（M2／M1）×100%。結(jié)果，3 批樣品平均載藥量為18.02%。

2.7 凍干粉制備 課題組前期考察了不同凍干保護(hù)劑（甘露醇、乳糖、蔗糖）、用量（4%、5%、6%、7%）對(duì)粒徑、外觀的影響，發(fā)現(xiàn)以6%甘露醇為凍干保護(hù)劑時(shí)粒徑增加程度最小，外觀飽滿。取納米混懸劑混懸液適量，加入6% 甘露醇，在－30 ℃下預(yù)凍2 d 后在－20 ℃下真空冷凍干燥1 d，于3 h 內(nèi)將溫度緩慢升高至25 ℃，取出，即得，外觀見(jiàn)圖3，蒸餾水復(fù)溶后，測(cè)得其平均粒徑為257.23 nm，PDI 為0.240，Zeta 電位為－31.75 mV。

圖3 凍干粉外觀Fig.3 Appearance of lyophilized powder

2.8 穩(wěn)定性考察 取納米混懸劑及其凍干粉適量，置于恒溫恒濕箱中（溫度25 ℃，相對(duì)濕度60%），于0、5、10、15、30、45、60 d 取樣，測(cè)定凍干前后粒徑、Zeta 電位，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，納米混懸劑放置60 d 后粒徑變大，Zeta 電位絕對(duì)值變小，而將其制成凍干粉后兩者變化趨勢(shì)明顯變緩，表明凍干有助于提高其穩(wěn)定性。

表5 穩(wěn)定性考察結(jié)果（n＝3）Tab.5 Results of stability investigation（n＝3）

2.9 體外釋藥研究 取原料藥、磷脂復(fù)合物、納米混懸劑、物理混合物（比例同納米混懸劑）粉末適量（芹菜素含量均為4 mg），加入5 mL 1%SDS 溶液制成混懸液［15］，置于活化后透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），細(xì)尼龍繩扎緊兩端，以1 000 mL 1.5% SDS 溶液為介質(zhì)，在溫度（37±1）℃、轉(zhuǎn)速100 r／min 下于0、0.15、0.3、0.5、0.45、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h 各取樣3 mL，并補(bǔ)加3 mL 空白溶出介質(zhì)，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算累積溶出度，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，原料藥12 h 內(nèi)累積溶出度為21.84%，而磷脂復(fù)合物提高至42.16%，納米混懸劑更達(dá)94.53%，表明雖然物理混合物累積溶出度有所提高，但仍明顯低于納米混懸劑。

圖4 芹菜素體外釋藥曲線（n＝3）Fig.4 In vitro drug release curves for apigenin（n＝3）

2.10 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.10.1 灌胃液制備 取原料藥、磷脂復(fù)合物、納米混懸劑凍干粉適量，0.5%CMC-Na 溶液制成混懸液，即得（以芹菜素計(jì)，質(zhì)量濃度為8 mg／mL）。

2.10.2 分組、給藥與采血 18 只大鼠禁食12 h后隨機(jī)分為3 組，每組6 只，按60 mg／kg 劑量給予“2.10.1” 項(xiàng)下灌胃液，原料藥、磷脂復(fù)合物組于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10 h 眼眶靜脈叢取血各約0.3 mL 至肝素化離心管中，納米混懸劑組增加12 h 取血點(diǎn)，取血期間補(bǔ)充適量生理鹽水，全血3 000 r／min 離心2 min，取上層血漿至空白離心管中，標(biāo)記后密封，置于－20 ℃冰箱中。

2.10.3 血漿處理 參考文獻(xiàn)［4］報(bào)道，血漿室溫緩慢解凍后吸取0.1 mL，置于離心管中，依次加入10 μL 冰醋酸、1.5 mL 甲醇，渦旋振蕩3 min，6 000 r／min 離心6 min，吸取上清液，45 ℃氮?dú)饩徛党袡C(jī)溶劑得殘留物，加入0.1 mL 甲醇渦旋復(fù)溶，6 000 r／min 離心6 min，進(jìn)樣分析。

2.10.4 血漿對(duì)照品溶液制備及線性關(guān)系考察 取芹菜素對(duì)照品適量，甲醇制成8、4、1、0.5、0.1、0.05 μg／mL 溶液，分別精密取0.1 mL，45 ℃氮?dú)饩徛党状迹瑲埩粑锛尤?.1 mL 空白血漿，即得血漿對(duì)照品溶液，按“2.10.3” 項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝0.452 7X－2.361 4（r＝0.993 4），在0.05～8 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.10.5 方法學(xué)考察 取空白血漿、血漿對(duì)照品溶液（0.05 μg／mL）、磷脂復(fù)合物灌胃給藥10 h 后的血漿樣品適量，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5，可知色譜峰分離度理想，方法專屬性良好。制備0.5 μg／mL 血漿樣品，于0、3、6、12、18、24 h 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芹菜素峰面積RSD 為1.94%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取高（8 μg／mL）、中（1 μg／mL）、低（0.05 μg／mL）質(zhì)量濃度血漿對(duì)照品溶液，分別在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得芹菜素峰面積RSD 分別為7.52%、10.61%、8.04%，表明儀器精密度良好。取空白血漿適量，甲醇制成8、1、0.05 μg／mL 溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，并與配制時(shí)的質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，即為方法回收率，結(jié)果分別為90.07%、91.24%、93.19%，RSD 分別為7.11%、3.08%、5.93%。取8、1、0.05 μg／mL 血漿對(duì)照品溶液及相同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液適量，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算兩者峰面積比值，即為萃取回收率，結(jié)果分別為96.33%、93.07%、94.26%，RSD 分別為7.02%、4.73%、6.65%。

圖5 芹菜素HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of apigenin

2.10.6 結(jié)果分析 繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，再采用3P97 程序統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（tmax、t1／2采用非參數(shù)法秩和檢驗(yàn)，Cmax、AUC 經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后采用t檢驗(yàn)），結(jié)果見(jiàn)圖6、表6。由此可知，與原料藥比較，磷脂復(fù)合物t1／2延長(zhǎng)（P＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對(duì)生物利用度提高至1.73 倍；與原料藥、磷脂復(fù)合物比較，納米混懸劑tmax縮短（P＜0.05），t1／2延 長(zhǎng)（P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升 高（P＜0.01），相對(duì)生物利用度增加至4.88 倍。

表6 芹菜素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s， n＝6）Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for apigenin（±s， n＝6）

表6 芹菜素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s， n＝6）Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for apigenin（±s， n＝6）

注：與芹菜素比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與芹菜素磷脂復(fù)合物比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖6 芹菜素血藥濃度-時(shí)間曲線（n＝6）Fig.6 Plasma concentration-time curves for apigenin（n＝6）

3 討論

前期考察發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)采用某一種穩(wěn)定劑時(shí)納米混懸劑粒徑一般在300 nm 以上，分布范圍較大；將PVP K30 與SDS 聯(lián)用后，納米混懸劑粒徑較小，可能是由于前者分子鏈較長(zhǎng)，伸展后可形成較大的空間阻力［16-17］，而后者是表面活性劑，有助于降低納米混懸劑粒徑，而且也可提供空間位阻作用［18］。于世龍［10］采用DMSO 作為溶劑，制備的芹菜素納米混懸劑在31 d 內(nèi)粒徑增加了2 倍多（凍干前），可能是由于納米混懸劑中DMSO（難以除去）影響了制劑穩(wěn)定性所致。本實(shí)驗(yàn)引入磷脂復(fù)合物后，提高了芹菜素在無(wú)水乙醇中的溶解度［4］，無(wú)需使用DMSO 即可制成納米混懸劑，并且凍干前放置60 d 后其粒徑僅增加了37.57%。

結(jié)果顯示，芹菜素磷脂復(fù)合物納米混懸劑tmax顯著延長(zhǎng)，可能是由于納米混懸劑加快了藥物釋放，縮短了入血時(shí)間；累積釋放度大大增加，從而使Cmax顯著升高；相對(duì)生物利用度增加至4.88 倍，除了與納米混懸劑促進(jìn)藥物釋放、提高累積溶出度有關(guān)外，還可能涉及納米混懸劑增強(qiáng)藥物對(duì)腸道黏膜的黏附性、間接促進(jìn)吸收、納米藥物經(jīng)淋巴循環(huán)等途徑進(jìn)入血液循環(huán)等因素［19］，從而使藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)生很大變化［20］。但最終納米混懸劑中芹菜素是以磷脂復(fù)合物的形式存在，還是以游離芹菜素的形式存在，或是兩者兼有尚不明確，仍需進(jìn)一步研究，并且后續(xù)還要繼續(xù)完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、注射藥動(dòng)學(xué)、藥效評(píng)價(jià)等方面的考察。