基于分子對接及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎的作用機制

【摘要】目的 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，探討加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎的有效成分、作用靶點及信號通路。方法 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺（TCMSP）收集加減當(dāng)歸六黃湯的活性成分及靶點，通過蛋白數(shù)據(jù)庫（Uniprot）篩選基因名稱。使用GeneCards、OMIM、PharmGKB、Drugbank數(shù)據(jù)庫篩選肺炎相關(guān)基因并與加減當(dāng)歸六黃湯靶基因取交集。將交集基因上傳到 String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），采用CytoNCA對PPI進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選核心靶基因。使用Cytoscape（3.7.2）軟件構(gòu)建加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎的網(wǎng)絡(luò)圖（藥物-有效成分-靶點）。最后利用R語言及Bioconductor平臺對交集靶基因進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和基因相互作用（KEGG）通路分析；并借助AutoDock、Pymol軟件對核心成分和核心靶點進(jìn)行分子對接及可視化分析。結(jié)果 通過篩選，預(yù)測出加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎的有效活性成分共有81個，作用于疾病的有效基因有73個，主要通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、蛋白激酶B（AKT1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、JUN激酶（JUN）等核心靶基因及調(diào)控細(xì)胞凋亡、人巨細(xì)胞病毒、腫瘤壞死因子（TNF）、低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）、IL-17（白細(xì)胞介素-17）、Toll樣受體信號通路等而發(fā)揮對肺炎的治療作用。結(jié)論 通過分子對接及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)論證了加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎具有多成分、多靶點、多途徑的特點，未來我們可以從MAPK、AKT1、IL-6、CASP3、PTGS2、JUN等靶點及相關(guān)信號通路來探究加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎的作用機制，為后續(xù)藥物研發(fā)、分子生物學(xué)實驗及相關(guān)臨床研究奠定理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】加減當(dāng)歸六黃湯、肺炎、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，分子對接，信號通路

中圖分類號：R2-031 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2096-2665.2023.24.0.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2023.24.043

肺炎是人體終末氣道、肺泡及肺間質(zhì)的一種炎癥性疾病，多由病原微生物、理化因素、免疫損傷、過敏、藥物等所致，臨床上主要以咳嗽、咳痰、發(fā)熱、呼吸困難為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重者常伴有呼吸衰竭、心力衰竭。肺炎為一種感染性疾病，具有高致病性和高死亡率，我國入住重癥加強護(hù)理病房（ICU）的肺炎病死率高達(dá)53%[1]?？垢腥局委熓悄壳叭允侵委煼窝椎闹饕侄?，但由于抗生素的濫用及耐藥菌株不斷出現(xiàn)，給肺炎治療帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。中醫(yī)的辨證理論及其中藥復(fù)方的多成分、多靶點、整體調(diào)節(jié)作用特點對肺炎的治療有獨特的優(yōu)勢，臨床上常采用中西醫(yī)結(jié)合的方法治療肺炎。

肺炎在中醫(yī)上多屬“肺炎喘嗽”“咳嗽”“風(fēng)溫”等病癥范疇，本病早期以外邪入侵，痰熱內(nèi)蘊為主要病機，后期由于正氣不足為本，伏氣化熱，易形成氣虛血瘀的病理基礎(chǔ)。臨床上對肺炎恢復(fù)期的患者采用加減當(dāng)歸六黃湯進(jìn)行治療，效如桴鼓[2]。加減當(dāng)歸六黃湯由金代李東垣的《蘭室秘藏》中當(dāng)歸六黃湯化裁而來，其藥物組成為生地黃，熟地黃，當(dāng)歸，炙黃芪，黃連，黃柏，黃芩，白術(shù)，辛夷，蒼耳；諸藥合用共奏“益氣養(yǎng)陰、化瘀解毒”功效[3]。為進(jìn)一步探討加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎的作用機理，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接法構(gòu)建藥物、靶點、基因、通路、疾病之間的多重網(wǎng)絡(luò)，從分子層面剖析加減當(dāng)歸六黃湯與肺炎間相互作用關(guān)系，為疾病治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 加減當(dāng)歸六黃湯有效活性成分及靶點的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索加減當(dāng)歸六黃湯中生地黃、熟地黃、當(dāng)歸、炙黃芪、黃連、黃柏、黃芩、白術(shù)、辛夷、蒼耳的化學(xué)成分及靶點；以（生物口服利用度）OB≥30％、（類藥性）DL≥18％作為篩選條件[4]，對中藥的化學(xué)成分進(jìn)行篩選。運用Perl語言獲取藥物有效成分的靶點，并聯(lián)合Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），得到藥物有效成分靶點所對應(yīng)的基因簡稱。

1.2 肺炎相關(guān)基因的篩選 使用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）、Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫檢索疾病，檢索詞設(shè)置為“pneumonia”“inflammation of the lungs”，將4個數(shù)據(jù)庫所得到的檢索結(jié)果合并，刪除重復(fù)靶點，獲得肺炎的全部靶基因；利用R語言篩選出加減當(dāng)歸六黃湯與肺炎共同作用的靶基因，并繪制出韋恩圖。

1.3 繪制“藥物－有效成分－靶點”網(wǎng)絡(luò)圖 選取加減當(dāng)歸六黃湯有效活性成分及與肺炎的共同靶基因，利用Perl語言對數(shù)據(jù)節(jié)點進(jìn)行屬性標(biāo)識，然后將所得數(shù)據(jù)輸入Cytoscape3.7.2制圖軟件，進(jìn)行可視化分析，繪制藥物與疾病間的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及篩選核心靶基因 將加減當(dāng)歸六黃湯與肺炎共同作用靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中，物種選擇為人類“homo sapiens”，選取最小作用得分（minimum required interaction score）>0.4，并設(shè)置隱藏游離點，獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），下載PPI圖形，并將蛋白互作關(guān)系以TSV格式保存；采用CytoCNA對PPI進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選核心靶基因。

1.5 基因本體（GO）富集分析和基因相互作用（KEGG）通路分析 首先，選取加減當(dāng)歸六黃湯與肺炎的共同作用的靶基因，在R語言上安裝#install.packages（"RSQLite"）#if（！requireNamespace（"BiocManager"， quietly = TRUE）） #install.packages（"BiocManager"）#BiocManager：：install（"org.Hs.eg.db"， version = "3.8"）程序包，然后運用R語言將靶基因symbol轉(zhuǎn)為基因ID；在R語言上安裝#install.packages（"colorspace"）#install.packages（"stringi"）#install.packages（"ggplot2"）#BiocManager：：install（"DOSE"）#BiocManager：：install（"clusterProfiler"）#BiocManager：：install（"enrichplot"）程序包，運行R語言，獲得GO和KEGG富集分析圖，進(jìn)一步說明中藥化合物的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用關(guān)系。

1.6 構(gòu)建KEGG“主要信號通路與靶點”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖 利用Perl語言選取KEGG通路中前20個主要信號通路，并對其通路及基因數(shù)據(jù)節(jié)點進(jìn)行屬性標(biāo)識，然后把所得數(shù)據(jù)輸入Cytoscape3.7.2制圖軟件，進(jìn)行可視化分析，繪制KEGG“主要信號通路與靶點”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，結(jié)合該數(shù)據(jù)庫對網(wǎng)絡(luò)圖作出注釋，從分子水平闡述加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎的作用機理。

1.7 活性成分與核心靶點的分子對接 利用Cytohubba插件篩選藥物核心成分，與核心靶基因進(jìn)行分子對接。利用Autodock進(jìn)行小分子與蛋白對接，對對接結(jié)果（Blind energy）進(jìn)行打分，并用Discovery Studio Visualizer和PyMOL將對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 加減當(dāng)歸六黃湯有效活性成分及潛在靶基因 在TCMSP數(shù)據(jù)平臺，依據(jù)篩選條件OB≥30％、DL≥18％，共獲取加減當(dāng)歸六黃湯的有效活性成分142個，其中黃芪20個、黃芩36個、黃連14個、黃柏37個、地黃

2個、當(dāng)歸2個、辛夷19個、陳皮5個、白術(shù)7個；篩選結(jié)果中有些活性成分共屬于兩個或者三個中藥，刪除重復(fù)化合物20個，最后共獲取122個無重復(fù)的有效活性成分；在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索藥物活性成分相關(guān)的作用靶點（related targets），結(jié)合Perl語言以及Uniprot數(shù)據(jù)庫，獲得其有效成分所對應(yīng)的基因symbol，共1 834個。

2.2 加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎潛在作用靶點基因的預(yù)測 檢索GeneCards、OMIM、PharmGKB、Drugbank數(shù)據(jù)庫，結(jié)合R語言，共得到肺炎相關(guān)基因974個（GeneCards數(shù)據(jù)庫743個、 OMIM數(shù)據(jù)庫190個、DrugBank 數(shù)據(jù)庫59、PharmGkb數(shù)據(jù)庫6個）；與藥物靶基因取交集，得到73個共同作用的靶基因；繪制韋恩圖（圖1、圖2）。

2.3 繪制加減當(dāng)歸六黃湯與肺炎“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖 將上述81個藥物有效活性成分、73個共同作用靶基因，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2制圖軟件，繪制網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3），可直觀地反映這些藥物、化合物與靶標(biāo)的相互作用。分析此網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)此網(wǎng)絡(luò)包含了154個節(jié)點和306條邊，兩連接節(jié)點數(shù)目越多，基因所對應(yīng)的圖形則越大。

圖3 加減當(dāng)歸六黃湯與肺炎“藥物－活性成分－靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（藍(lán)色代表共同作用靶基因，紅色代表黃芪，黃色代表黃芩，粉色代表黃連、淺紫代表黃柏、白色代表當(dāng)歸、深藍(lán)代表地黃、綠色代表陳皮、淺藍(lán)代表白術(shù)、墨綠代表辛夷有效化學(xué)成分）

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）及篩選核心靶基因 將73個潛在作用靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4）。圖中每個圓形節(jié)點代表一個基因蛋白，節(jié)點間的直線表示所連接的2個蛋白存在互作關(guān)系，線條越粗表示兩者關(guān)系越強；采用CytoNCA對73個共同靶基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓樸分析，篩選出14個核心靶基因，分別為趨化因子配體2（CCL2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、JUN激酶（JUN）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、蛋白激酶（AKT1）、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、表皮生長因子（EGF）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM1）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）（見圖5）。

2.5 GO與KEGG富集分析 對73個共同靶基因進(jìn)行GO富集分析。結(jié)果包括生物過程（BP）1 336條、分子功能（MF）100條、細(xì)胞組分（CC）56條。

本文選取前10個GO功能富集的柱狀圖進(jìn)行分析，P值代表富集的顯著性，顯著性越高，P值越小，其對應(yīng)的顏色越偏向紅色，反之則偏向藍(lán)色；橫坐標(biāo)表示富集數(shù)目。從圖6中BP富集區(qū)域包括對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌源分子的反應(yīng)、活性氧的響應(yīng)、對金屬離子的響應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對抗生素的反應(yīng)等；CC富集主要細(xì)胞中的膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、質(zhì)膜筏、囊腔等；MF富集結(jié)果主要為細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、受體激活劑活性、蛋白酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等。

對73個共同靶基因進(jìn)行KEGG富集分析，共得到153條富集結(jié)果。

選取P值較小、關(guān)鍵靶基因數(shù)較多前30條通路進(jìn)行分析，主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、C-型凝集素受體信號通路、麻疹、前列腺癌、甲型流感、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染、NOD樣受體信號通路、細(xì)胞凋亡、EB病毒感染、Th1和Th2細(xì)胞分化，NF-κB信號通路，PI3K-Akt信號通路等（見圖7），圖中縱坐標(biāo)代表信號通路名稱，橫坐標(biāo)代表富集的基因數(shù)量，氣泡的顏色代表顯著性，顏色越紅，顯著性越高。

繪制KEGG“主要通路－關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖8），可直觀看出基因與通路的關(guān)系，兩連接節(jié)點數(shù)目越多，通路和基因所對應(yīng)的圖形則越大，并繪制相關(guān)性較大IL-17信號通路圖（見圖9）。

2.6 分子對接結(jié)果 分子對接在臨床藥物研究中具有重要意義，主要是通過匹配原則算法模擬蛋白質(zhì)與小分子受體相互作用，預(yù)測受體與配體間的作用細(xì)節(jié)和反應(yīng)機制，進(jìn)而確定結(jié)合位點[5]。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定能量越低，發(fā)生的作用可能性越大[6]，能量最低的結(jié)構(gòu)為最優(yōu)結(jié)構(gòu)，當(dāng)結(jié)合能小于0 kcal/mol說明大分子蛋白與小分子化合物之間可以自主結(jié)合；小于-5.0 kcal/mol表明有較好的結(jié)合活性；小于-7.0 kcal/mol表明有強烈的結(jié)合活性[7]。

本文將篩選出的14的核心靶基因與加減當(dāng)歸六黃湯中排名前5的核心成分（degree>10）：槲皮素（quercetin）degree 59、山柰酚（kaempferol）degree 21、漢黃芩素（wogonin）degree 15、柚皮素（naringenin）degree 12與黃芩素（baicalein）degree 12進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示（見表1）結(jié)合能（binding energy）均小于-5 kcal/mol，表明加減當(dāng)歸六黃湯的核心成分與疾病的核心靶蛋白具有較好的結(jié)合活性；并對其具有強烈的結(jié)合活性的化合物與受體分子對接模式進(jìn)行可視化分析，具體見圖10。

3 討論

從篩選出的圖表數(shù)據(jù)可以看出加減當(dāng)歸六黃湯中有81個有效成分參與治療肺炎，與肺炎潛在作用的共同靶基因共有73個。根據(jù)相互作用靶點數(shù)，排名前5的藥物有效活性成分依次是槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素與黃芩素，5個化合物均屬于黃酮類化合物，黃酮類具有抑制黃嘌呤氧化酶活性、抗腫瘤、清除自由基及抗病毒等生物學(xué)作用[8]。黃酮類化合物可抑制 NOX4/NF-κB/MLCK途徑，減輕甲型流感病毒誘導(dǎo)的屏障功能障礙，維持肺內(nèi)皮屏障功能穩(wěn)定[9]，協(xié)同參與抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、改善肺損傷等功能，可作為加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎的主要藥效群。

將CytoNCA拓樸分析得到的14個核心靶基因與藥物有效活性成分進(jìn)行分子對接顯示均有較好的結(jié)合活性，表明此為加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎的主要蛋白。MAPK1、MAPK3和MAPK8可介導(dǎo)免疫/炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、炎癥反應(yīng)等，加重氣道炎癥和黏液分泌增加[10]。CASP、JUN、AKT1均可參與細(xì)胞凋亡過程。CASP3、CASP8是半胱氨酸蛋白酶家族成員，CASP8可作用于CASP3的天冬氨酶，激活凋亡下游的執(zhí)行蛋白酶，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。JUN激酶（JUN）是能夠促使MAPK發(fā)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡；JUN可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)，對急性肝損傷、急性炎癥反應(yīng)具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[12]。蛋白激酶（AKT1）基因在缺氧條件下能通過抑制凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，相關(guān)動物實驗表明轉(zhuǎn)染AKT1基因可以提高大鼠細(xì)胞耐缺氧能力[13]。PTGS是花生四烯酸合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶，主要包括PTGS1和PTGS2在受一些炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子的刺激，可迅速表達(dá)，合成過量的前列腺素（PGs），促進(jìn)其炎癥反應(yīng)[14]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）可激活上皮下血管內(nèi)皮細(xì)胞MAPK信號通路促進(jìn)介質(zhì)分泌，從而維持血管內(nèi)皮環(huán)境穩(wěn)定[15]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs） 是一組與ECM降解有關(guān)的蛋白水解酶家族，可參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、組織修復(fù)、血管生成、炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答等過程。MMP-9的含量增加，可促進(jìn)ECM的降解速度，基底膜斷裂，促進(jìn)炎癥細(xì)胞溢出擴(kuò)散，聚集于呼吸道壁及呼吸道腔，加重其炎性反應(yīng)及肺部炎性疾病的發(fā)生發(fā)展[16]。有研究指出，嬰幼兒肺炎急性期外周血血清中MMP-9及MMP-9/TIMP-1水平可反映疾病嚴(yán)重程度、病原體種類和肺功能損傷的程度[17]。促血管生成因子（MMP2）可以直接調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和遷移，主要是依靠MMP2剪切細(xì)胞-細(xì)胞受體來實現(xiàn)。CCL2是趨化因子CC亞家族成員，CCL2表達(dá)的增加可加重肺部炎癥反應(yīng)[18]。IL-6屬白細(xì)胞介素家族，是重要的炎癥因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，對機體細(xì)胞免疫和體液免疫均有調(diào)節(jié)作用，可參與炎癥的病理過程。有研究表明，肺部感染包括支原體感染（MP）、呼吸道合胞病毒感染（RSV）及其他類型感染患者血清的白細(xì)胞介素水平均會明顯升高，引起嚴(yán)重的炎癥與肺組織損傷[19]。結(jié)合GO功能分析可知，加減當(dāng)歸六黃湯治療肺炎的靶蛋白主要是通過炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答等過程而發(fā)揮作用。

綜上所述，加減當(dāng)歸六黃湯中黃酮類化合物：槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素與黃芩素，可能是治療肺炎的主要有效成分，分別與MAPK、AKT1、IL-6、CASP3、PTGS2、JUN等核心靶基因以氫鍵結(jié)合，發(fā)揮治療作用，但后期仍應(yīng)加以臨床和實驗驗證，使其應(yīng)用更具有指導(dǎo)意義。

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基金項目：北京市中醫(yī)婦幼名醫(yī)傳承工作室建設(shè)項目（編號：2020-46）

作者簡介：王靜，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合兒科。