托西酸舒他西林中對(duì)甲基苯磺酸烷基酯檢查方法研究

姚蘭?傅蓉?鄒宇?孫苓苓

摘要：目的 對(duì)工藝中可能產(chǎn)生的對(duì)甲基苯磺酸烷基酯建立氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用的測(cè)定方法。方法 以（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細(xì)管柱為色譜柱；進(jìn)樣口溫度為200 ℃，程序升溫，起始溫度50 ℃，維持1 min，以每分鐘10 ℃升溫至300 ℃；進(jìn)樣體積1 μL。以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)；離子源為電子轟擊源（EI），質(zhì)譜監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。結(jié)果 經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，混合對(duì)照品溶液各峰分離良好，對(duì)甲基苯磺酸甲酯、乙酯、異丙酯分別在0.002485～0.1863 μg/mL、0.002019～0.1514 μg/mL 、0.001879～0.1409 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，在0.05～0.15 μg/mL濃度范圍內(nèi)回收率為94.5%～113.7%，方法檢出靈敏度低于1%TTC。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確可靠，適用于托西酸舒他西林中對(duì)甲基苯磺酸烷基酯的測(cè)定。按該方法形成質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案，并采用擬修訂方法對(duì)生產(chǎn)企業(yè)提供的6批樣品進(jìn)行測(cè)定，6批樣品均符合規(guī)定。

關(guān)鍵詞：托西酸舒他西林；對(duì)甲基苯磺酸甲酯；對(duì)甲基苯磺酸乙酯；對(duì)甲基苯磺酸異丙酯；氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用

中圖分類號(hào)：R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the determination of p-toluenesulfonic acid alkyl ester

in sultamicillin tosilate

Yao Lan， Fu Rong， Zou Yu， and Sun Lingling

（Liaoning Institute for Drug Control， Shenyang 110032）

Abstract Objective A gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry （GC-MSMS） method was developed for the determination of alkyl p-toluenesulfonate. Method An elastic quartz capillary column with （5%-phenyl）-methylpolysiloxane as stationary liquid was used as the chromatographic column. The inlet temperature is 200 ℃. The column temperature was programmed. The starting temperature was set at 50 ℃ for 1 minute， and then the temperature was increased to 300 ℃ at a rate of 10 ℃ per minute; the injection volume was 1 μL. The Electron Ionization source （EI） was used as the ion source， and the monitoring mode was multiple reaction monitoring （MRM）. Result The results showed that the peak area of methyl p-toluenesulfonate， ethyl p-toluenesulfonate， and isopropyl p-toluenesulfonate had a good linear relationship in the concentration range of 0.002485～0.1863 μg/mL， 0.002019～0.1514 μg/mL and 0.001879～0.1409 μg/mL， respectively. The recovery rates were 94.5%～113.7% in the range of 0.05～0.15 μg/mL， respectively. The detection sensitivity concentration was less than 1% TTC. Conclusion The method was accurate and reliable. According to this method， a draft of quality standard was formed， and 6 batches of samples were determined by the proposed method. All 6 batches of samples met the requirements.

Key words Sultamicillin tosilate; Methyl p-toluenesulfonate; Ethyl p-toluenesulfonate; Isopropyl p-toluenesulfonate; Gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry

托西酸舒他西林收載于《中國藥典》2020年版[1]，為舒他西林對(duì)甲基苯磺酸鹽?！吨袊幍洹?020年版[1]該品種[生產(chǎn)要求]項(xiàng)下要求：應(yīng)對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行評(píng)估以確定形成遺傳毒性雜質(zhì)甲苯磺酸烷基酯的可能性。必要時(shí)，應(yīng)采用適宜的分析方法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行分析，以確認(rèn)甲苯磺酸酯的含量符合國家藥品監(jiān)督監(jiān)管部門相關(guān)指導(dǎo)原則或ICH M7指導(dǎo)原則的要求。

根據(jù)生產(chǎn)單位提供的工藝，托西酸舒他西林生產(chǎn)主要使用的溶劑包含甲醇、異丙醇、乙酸乙酯等，成鹽試劑對(duì)甲苯磺酸與溶劑有形成對(duì)甲基苯磺酸甲酯、對(duì)甲基苯磺酸乙酯、對(duì)甲基苯磺酸異丙酯的可能性，磺酸烷基酯為帶有基因毒性警示結(jié)構(gòu)化合物[2]，對(duì)甲基苯磺酸烷基酯屬帶有基因毒性警示結(jié)構(gòu)無致突變性數(shù)據(jù)化合物，應(yīng)采用適宜的方法控制該類雜質(zhì)不高于可接受限度。

根據(jù)ICH M7中毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）的建議[3]，具有誘變性的雜質(zhì)每天每人攝入1.5 μg時(shí)其風(fēng)險(xiǎn)是可以忽略的（終生暴露情況下理論的患癌風(fēng)險(xiǎn)小于十萬分之一），可以通用于大部分藥物作為可接受限度控制標(biāo)準(zhǔn)。托西酸舒他西林成人推薦使用量為最大每次0.75 g，每日兩次（共1.5 g）。照上述控制標(biāo)準(zhǔn)，1.5 μg /1.5 g應(yīng)作為該品種該類雜質(zhì)可接受的限度控制標(biāo)準(zhǔn)，即1 ppm。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：Agilent7890B-7000C三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀

天平： XP205 （Mettler Toledo）

1.2 試劑與對(duì)照品

試驗(yàn)使用的試劑與對(duì)照品詳見表1。

1.3 供試品

生產(chǎn)企業(yè)提供的托西酸舒他西林原料藥6批，批號(hào)C04200501、C04200502、C04200503、C04210101、C04210102、C04210103。

1.4 色譜柱

HP-5（19091J-413）30 m×0.320 mm，0.25 μm；DB-5（122-5032） 30 m×0.25 mm，0.25 μm。

2 方法與結(jié)果

2.1 研究方法

對(duì)甲基苯磺酸甲酯、對(duì)甲基苯磺酸乙酯、對(duì)甲基苯磺酸異丙酯照氣相色譜法（《中國藥典》2020年版通則0521）和質(zhì)譜法（通則0431）測(cè)定。

2.1.1? ? 供試品溶液

取供試品約1.0 g，精密稱定，置具塞（膠塞）試樣瓶中，將試樣瓶置冰水浴中冷卻，加甲基叔丁基醚10 mL，立即旋緊膠塞，室溫下振搖20 min，靜置5 min，取上清液用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2? ? 混合對(duì)照品貯備溶液

取對(duì)甲基苯磺酸甲酯、對(duì)甲基苯磺酸乙酯與對(duì)甲基苯磺酸異丙酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲基叔丁基醚溶解并稀釋制成分別約含10 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3? ? 系列混合對(duì)照品溶液

精密量取混合對(duì)照品貯備溶液適量，用甲基叔丁基醚稀釋制成每1 mL分別約含2、10、50、100和150 ng系列混合對(duì)照品溶液。

2.1.4? ? 靈敏度溶液

取每1 mL分別約含2 ng的混合對(duì)照品溶液，作為靈敏度溶液。

2.1.5? ? 色譜條件

以（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細(xì)管柱為色譜柱；進(jìn)樣口溫度200 ℃；分流比1︰1；載氣為高純氦氣（He），流速2.0 mL/min；程序升溫，起始溫度50 ℃，維持1 min，以每分鐘10 ℃升溫至300 ℃；進(jìn)樣體積1 μL。

2.1.6? ? 質(zhì)譜條件

以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)；離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度200 ℃；碰撞氣為氮?dú)?，流?.5 mL/min；輔助加熱器（MSD傳輸線）溫度為300 ℃；質(zhì)譜監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓（CE）參考值見表2；為提高檢測(cè)靈敏度，可根據(jù)保留時(shí)間分段監(jiān)測(cè)各化合物。

2.1.7? ? 系統(tǒng)適用性要求

精密量取混合對(duì)照品溶液（150 ng/mL）連續(xù)進(jìn)樣，對(duì)甲基苯磺酸異丙酯峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不得過5.0%，各色譜峰之間的分離度應(yīng)符合要求。以上符合要求情況下，進(jìn)行線性關(guān)系的考查。系列混合對(duì)照品溶液色譜圖中，計(jì)算各成分濃度與相應(yīng)峰面積的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)（r）應(yīng)不小于0.99。靈敏度溶液色譜圖中，對(duì)甲基苯磺酸甲酯峰、對(duì)甲基苯磺酸乙酯峰及對(duì)甲基苯磺酸異丙酯峰的信噪比，均應(yīng)不小于10。

2.1.8? ? 測(cè)定法

精密量取系列混合對(duì)照品溶液、供試品溶液與靈敏度溶液，分別注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，記錄色譜圖和質(zhì)譜圖。

2.1.9? ? 限度

供試品溶液色譜圖中如檢出與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，并且在扣除背景后的質(zhì)譜圖中，所選擇的2個(gè)監(jiān)測(cè)離子對(duì)均出現(xiàn)，供試品溶液的監(jiān)測(cè)離子對(duì)峰面積比（比值=定性離子峰面積/定量離子峰面積×100%）與濃度相當(dāng)?shù)膶?duì)照品溶液的監(jiān)測(cè)離子對(duì)峰面積比進(jìn)行比較時(shí)，相對(duì)偏差不超過下列規(guī)定的范圍，則可判定樣品中存在該雜質(zhì)：相對(duì)比例＞50%，允許±20%偏差；相對(duì)比例20%～50%，允許±25%偏差；相對(duì)比例10%～20%，允許±30%偏差；相對(duì)比例≤10%，允許±50%偏差。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計(jì)算，含對(duì)甲基苯磺酸甲酯、對(duì)甲基苯磺酸乙酯與對(duì)甲基苯磺酸異丙酯分別不得過1 ppm。小于靈敏度溶液主峰面積的峰忽略不計(jì)。

2.2 方法學(xué)研究結(jié)果

2.2.1 專屬性

對(duì)甲基苯磺酸甲酯、對(duì)甲基苯磺酸乙酯、對(duì)甲基苯磺酸異丙酯EI源（70 ev）質(zhì)譜圖見圖1，根據(jù)離子響應(yīng)選擇定量與定性參考離子見“2.1.6”質(zhì)譜條件。

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液與空白溶液，照上述“2.1”方法，各進(jìn)樣1 μL，結(jié)果混合對(duì)照品溶液各峰分離良好，溶劑與樣品基質(zhì)不干擾測(cè)定，方法專屬性良好。典型色譜圖見圖2～6。

2.2.2 準(zhǔn)確度與重復(fù)性

取供試品（批號(hào)C04200502）1.0 g，共9份，每組3份，精密稱定，置具塞試樣瓶中，將試樣瓶置冰水浴中冷卻，每組樣品分別精密加入低、中、高混合對(duì)照溶液（濃度分別為0.05、0.10、0.15 μg/mL）

10 mL，密閉，室溫振搖20 min，靜置5 min，用

0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。照“2.1”方法，每樣品進(jìn)樣兩次，結(jié)果表明：各樣品回收率良好，以回收率的樣品間RSD考察重復(fù)性，樣品間重復(fù)性符合要求，方法準(zhǔn)確可靠，結(jié)果見表3。

2.2.3 檢測(cè)限與定量限

精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸異丙酯對(duì)照品各適量，用甲基叔丁基醚溶解并逐級(jí)稀釋，以信噪比10為定量限，信噪比3為檢測(cè)限，各雜質(zhì)定量限與檢測(cè)限結(jié)果見表4，典型圖譜見圖7～10。1 ppm應(yīng)作為該品種該類雜質(zhì)可接受的限度控制標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)限濃度均能夠滿足ICH M7推薦的雜質(zhì)可忽略限度（0.01 ppm）。

2.2.4 定量限精密度與準(zhǔn)確度

取定量限溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，并計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差考察精密度。取供試品6份，每份1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞試樣瓶中，各加定量限溶液10 mL，密閉，振搖20 min，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得，照"2.1"方法，進(jìn)樣1 μL計(jì)算回收率。精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果見表5。結(jié)果表明，精密度與回收率結(jié)果良好。

2.2.5 線性與范圍

精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸異丙酯對(duì)照品各適量，用甲基叔丁基醚溶解并逐級(jí)稀釋，制成線性系列溶液，照“2.1”方法，進(jìn)樣1 μL，各雜質(zhì)線性范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好，r值不小于0.9992。線性與范圍結(jié)果見表6。

2.6 耐用性

采用DB-5 （122-5032） Length30 m×Diam.0.25 mm Film 0.25 μm色譜柱，照“2.1”方法，進(jìn)樣混合對(duì)照溶液（約0.05 μg/mL），結(jié)果各峰分離良好。色譜圖見圖11，表明方法耐用性良好。

2.3 樣品測(cè)定結(jié)果

取供試品1.0 g，精密稱定，精密加入甲基叔丁基醚10 mL，振搖20 min，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，進(jìn)樣1 μL。按外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，結(jié)果見表7。有1批檢出對(duì)甲基苯磺酸異丙酯，其余樣品均未檢出，6批樣品均符合規(guī)定。

3 討論

綜上研究，該方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于托西酸舒他西林中對(duì)甲基苯磺酸甲酯、乙酯、異丙酯的檢測(cè)。根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，該企業(yè)樣品中該類雜質(zhì)控制良好，雜質(zhì)未檢出或痕量檢出。根據(jù)ICH M7中毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）的建議，低于1%TTC雜質(zhì)可以忽略不計(jì)，該方法檢測(cè)靈敏度能夠滿足1%TTC，可以滿足該雜質(zhì)的質(zhì)量控制?！稓W洲藥典》收載GC-MS法測(cè)定甲磺酸甲酯、乙酯、異丙酯，采用衍生化法使待測(cè)物沸點(diǎn)降低，使?jié)M足頂空法要求，本文中待測(cè)物無法通過衍生化法滿足頂空法要求。有文獻(xiàn)報(bào)道采用液質(zhì)聯(lián)用方法測(cè)定該類雜質(zhì)，因該類雜質(zhì)易水解，液質(zhì)法不滿足測(cè)定需求。本文采用GC-MSMS直接進(jìn)樣法，由于樣品濃度較大（0.1g/mL），對(duì)系統(tǒng)污染嚴(yán)重。因此選擇甲基叔丁基醚作為溶劑，托西酸舒他西林與對(duì)甲基苯磺酸烷基酯的在該溶劑中溶解性差異較大，溶劑能夠提取樣品中的待測(cè)物，并使原料藥對(duì)測(cè)定無干擾。測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，對(duì)甲基苯磺酸異丙酯存在進(jìn)樣口吸附的現(xiàn)象，因此，方法先以雜質(zhì)對(duì)照品濃溶液對(duì)進(jìn)樣口進(jìn)行充分的預(yù)飽和，結(jié)果較理想。

參 考 文 獻(xiàn)

國家藥典委員會(huì) 中華人民共和國藥典[S].（2020年版二部）. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社 2020： 434-435

Snodin D J. Genotoxic impurities： from structural alerts to qualification [J]. Org Process Res Dev， 2010， 14（4）： 960-976.

ICH.ICH Harmonized Guideline， Assessment and Control of DNA Reactive （Mutagenic） Impurities in Pharmaceuticals To Limit Potential Carcinogenic Risk M7（R1）[S/OL].（2017-3-31）[2022-9-21]. https：//database.ich.org/sites/default/files/M7_R1_Guideline.pdf.