1株mphA和mcr-1陽(yáng)性鼠傷寒沙門菌的鑒定及耐藥特征分析

韓藝然 李欣平 朱坤鵬 彭玉倩 楊海燕 邱少富 向瑩

摘要：目的 1株mphA和mcr-1陽(yáng)性鼠傷寒沙門菌的鑒定及耐藥特征分析；方法 分離自4歲腹瀉患者糞便樣本中的1株鼠傷寒沙門菌，使用沙門菌血清凝集法進(jìn)行菌株鑒定，質(zhì)譜法復(fù)核鑒定結(jié)果；使用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；通過(guò)全基因組測(cè)序及耐藥基因注釋鑒定菌株所攜帶的耐藥基因；通過(guò)質(zhì)粒測(cè)序及生信分析進(jìn)行質(zhì)粒類型鑒定、質(zhì)粒耐藥基因、插入子等注釋及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)分析；通過(guò)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)評(píng)估質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示分離株對(duì)包括阿奇霉素、多黏菌素、頭孢曲松和環(huán)丙沙星等臨床常用抗生素藥物耐藥。耐藥基因鑒定結(jié)果顯示：該分離株攜帶包括大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因mphA，多黏菌素抗性基因mcr-1在內(nèi)的12類45個(gè)耐藥基因及1個(gè)氟喹諾酮類耐藥點(diǎn)突變gyrA S83F。質(zhì)粒測(cè)序分析結(jié)果顯示：該菌株攜帶一個(gè)260，008bp大小的IncHI2型質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶包括mphA基因和mcr-1基因在內(nèi)的19個(gè)耐藥基因，15種插入子，4種轉(zhuǎn)座子。質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該質(zhì)?？梢栽谀c桿菌目細(xì)菌之間水平轉(zhuǎn)移。結(jié)論 研究結(jié)果為臨床治療鼠傷寒沙門菌感染中合理使用抗生素以及有效預(yù)防、控制耐阿奇霉素、多黏菌素鼠傷寒沙門菌的傳播提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門菌；耐藥性；mphA；mcr-1；質(zhì)粒

中圖分類號(hào)：R278；R378文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Identification and antimicrobial resistance analysis of a strain of Salmonella typhimurium positive for mphA and mcr-1

Han Yiran， Li Xinping， Zhu Kunpeng， Peng Yuqian， Yang Haiyan， Qiu Shaofu， and Xiang Ying

（1 College of Public Health， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001;

2? The Centre of Disease Control and Prevention of Chinese People's Liberation Army， Beijing 100071）

Abstract Objective To identify a mphA and mcr-1-positive multidrug-resistant Salmonella typhimurium isolate and analyze its antimicrobial resistance. Methods The strain isolated from a fecal sample of a four years old kid and collected. The Salmonella strains were identified by serum agglutination method， and the results were verified by mass spectrometry . The antimicrobial sensitivity test was conducted by microbroth dilution method. The antimicrobial resistance（AMR） genes were identified by whole genome sequencing and AMR genes annotation. Plasmid sequencing and bioinformatics analysis were used to identify plasmid types， annotate plasmid AMR genes and insertion sequences， and analyze plasmid structure. The horizontal transfer ability of the plasmid was estimated by plasmid conjugative transfer assay. Results The results of? antimicrobial sensitivity test showed that the isolates were resistant to commonly used antibiotics including azithromycin， colistin， ceftriaxone and ciprofloxacin. Identification of AMR genes showed that the isolated strain carried 45 AMR genes in 12 classes， including macrolide resistance gene mphA， colistin resistance gene mcr-1 and a point mutation in gyrA gene. Plasmid sequencing analysis showed that the strain carried a 260，008 bp size of IncHI2 plasmid， which carried 19 AMR genes， 15 classes of insertion sequences and 4 classes of transposons. The results of plasmid conjugative transfer assay showed that the plasmid could be transferred horizontally between intestinal strains. Conclusion This study provides a scientific basis for guiding the rational application of antibiotics and curbing the continuous spread of bacterial resistance.

Key words Salmonella typhimurium; Antimicrobial resistance; mphA; mcr-1; Plasmid

沙門菌感染是一個(gè)重大的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，在許多國(guó)家引起了食源性疾病。食源性疾病主動(dòng)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)（FoodNet）報(bào)告的數(shù)據(jù)顯示，沙門菌已成為美國(guó)食源性細(xì)菌病原體的主要死亡原因[1]。目前，沙門菌已有2600多種血清型存在，鼠傷寒沙門菌是最常見(jiàn)的血清型之一[2]。在我國(guó)臨床腹瀉樣本分離的沙門菌中，鼠傷寒沙門菌的分離比例多年來(lái)排名第一或第二，感染發(fā)病率也常年居首位[3-4]。近年來(lái)，隨著抗生素的廣泛及長(zhǎng)期使用，鼠傷寒沙門菌已進(jìn)化出多種耐藥表型，呈現(xiàn)出耐藥率高、耐藥范圍廣的特點(diǎn)。由于常見(jiàn)用于治療鼠傷寒沙門菌感染患者的抗生素，如環(huán)丙沙星、頭孢曲松等的耐藥率增加，阿奇霉素被FDA推薦用于鼠傷寒沙門菌感染臨床治療藥物[5-6]。由于多黏菌素具有腎毒性和神經(jīng)毒性的副作用，在20世紀(jì)80年代逐漸被其他抗菌類藥物所替代[7]。然而，近年來(lái)，隨著碳青霉烯類抗生素耐藥性的日益流行，多黏菌素被認(rèn)為是治療多重耐藥革蘭陰性菌的最后手段[8]。隨著阿奇霉素和多黏菌素在沙門菌感染治療中的使用率增加，在病原監(jiān)測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了1株對(duì)阿奇霉素和多黏菌素共耐藥的鼠傷寒沙門菌，這是極少見(jiàn)的，因此我們對(duì)其的耐藥特征及其分子機(jī)制展開(kāi)了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

菌株分離于重慶市渝中區(qū)4歲急性腹瀉患者糞便樣本的鼠傷寒沙門菌。

1.1.2 主要試劑

沙門菌-志賀菌（SS）瓊脂培養(yǎng)基（北京路橋技術(shù)股份有限公司）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、沙門屬診斷血清（泰國(guó)S&D公司）、CMV3AGNF藥敏板（ThermoFisher Scientific）、Phoenixtm NMIC-413藥敏板（碧迪醫(yī)療器械有限公司）、麥康凱瓊脂粉（北京路橋股份技術(shù)有限公司）、CAMHB肉湯培養(yǎng)基（武漢金同浩博生物科技有限公司）、頭孢曲松、環(huán)丙沙星Etest試紙條（意大利Liofilchem生物公司）、QIAamp DNA Minikit 試劑盒（德國(guó) QIAGEN 公司）、質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司）。引物合成自生工（上海）生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器

Autof ms1000全自動(dòng)微生物鑒定儀（鄭州安圖生物工程有限公司）、英國(guó)先德系列AutoReader自動(dòng)快速微生物藥敏及鑒定分析系統(tǒng)和SWIN微生物數(shù)據(jù)處理與報(bào)告系統(tǒng)、MiSeq platform 測(cè)序儀（Illumina公司）、美國(guó)Bio-Rad公司的PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定與復(fù)核實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)室保存的菌株進(jìn)行復(fù)蘇，使用三區(qū)劃線法在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，在培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取單菌落使其在SS培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)16～18 h，然后根據(jù)典型菌落形態(tài)，（中心黑色邊緣無(wú)色透明）挑選單菌落接種于LB培養(yǎng)基上進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)16～18 h。通過(guò)O抗原和H抗原的玻片凝集法進(jìn)行血清型鑒定，血清型鑒定過(guò)程嚴(yán)格參考國(guó)家沙門菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T4789.4-2016），通過(guò)質(zhì)譜試驗(yàn)對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行復(fù)核。

1.2.2 抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

采用肉湯稀釋法，選用CMV3AGNF和Phoenixtm NMIC-413商業(yè)化藥敏板進(jìn)行抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，以大腸埃希菌ATCC25922菌株作為質(zhì)控菌株。測(cè)定共包含16類35種抗生素，包括氨基糖苷類：慶大霉素（GEN，0.25～16 μg/mL）、妥布霉素（NN，?2～8 μg/mL）、阿米卡星（AN，8～32 μg/mL）、鏈霉素（STR，2～64 μg/mL）；抗菌青霉素+酶抑制劑：哌拉西林/他唑巴坦（TZP， 4/4～64/4 μg/mL））；頭孢類：頭孢唑林（CZ， 2～16 μg/mL）、頭孢呋辛（CXM， 4～16 μg/mL）、頭孢曲松（CRO，0.25～64 μg/mL）、頭孢他啶（CAZ， 1～32 μg/mL）、頭孢噻呋（XNL，0.12～8μg/mL）、頭孢哌酮-舒巴坦（SCP， 0.5/8～32/8 μg/mL）、頭孢吡肟（FEP， 1～16 μg/mL）、頭孢西丁（FOX，0.5～32μg/mL）；喹諾酮類：萘啶酸（NAL，0.5～32μg/mL）、左氧氟沙星（LVX， 1～8 μg/mL）、諾氟沙星（NOR， 2～8 μg/mL）、環(huán)丙沙星（CIP，0.015～4 μg/mL）、莫西沙星（MXF， 0.5～2 μg/mL）；磺胺類：復(fù)方磺胺甲惡唑（SXT，0.12/2.38～4/76 μg/mL）、磺胺異惡唑（FIS，16～256 μg/mL）；

β-內(nèi)酰胺類：氨曲南（ATM， 2～32 μg/mL）；青霉素：氨芐西林（AMP，1～32 μg/mL）；青霉素+酶抑制劑：阿莫西林/克拉維酸（AUG2，1/0.5～32/16 μg/mL）、氨芐西林/舒巴坦（SAM， 4/2～16/8 μg/mL）；氯霉素類：氯霉素（CHL，2～32 μg/mL）；磷酸類：磷霉素（FF，16～128 μg/mL）；四環(huán)素類：四環(huán)素（TET，4～32μg/mL）、二甲胺四環(huán)素（MI， 1～16 μg/mL）；大環(huán)內(nèi)酯類：阿奇霉素（AZI，0.12～16μg/mL）；多黏菌素：多黏菌素（CL， 1～4 μg/mL）；碳青霉烯類：厄他培南（ETP， 0.25～2 μg/mL）、亞胺培南（IPM， 0.25～8 μg/mL）、美羅培南（MEM， 0.125～8 μg/mL）；硝基呋喃類：呋喃妥因（FM， 16～24 μg/mL）；甘氨酰環(huán)素：替加環(huán)素（TGC， 1～8 μg/mL）。使用E-test藥敏法復(fù)核頭孢曲松和環(huán)丙沙星藥敏結(jié)果，挑取分離株單菌落于0.85% NaCl中，調(diào)整菌落形成單位為1.5×108 CFU/mL，用棉簽蘸取適量菌液涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基上，將試紙條貼于MH瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察抑菌情況并記錄MIC值。結(jié)果按照2021年版臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指南（CLSI M100S31）進(jìn)行解釋[9]。

1.2.3 全基因組測(cè)序及耐藥基因檢測(cè)

使用QIAamp DNA試劑盒提取基因組DNA，使用NEBNext?Ultra?DNA library Prep kit for Illumina制備文庫(kù)，并使用Illumina的高通量測(cè)序平臺(tái)MiSeq生成配對(duì)端序列。質(zhì)量控制和過(guò)濾通過(guò)Fastp （v0.20.1）[10]。使用SPAdes （v3.9.0）起草基因組組裝，使用QUAST （v4.5）進(jìn)行基因組組裝質(zhì)量評(píng)估，使用Prokka （v1.12）進(jìn)行基因組注釋[11-13]。

使用綜合抗生素耐藥性數(shù)據(jù)庫(kù)（CARD）的耐藥性基因標(biāo)識(shí)符（RGI）預(yù)測(cè)抗微生物藥物耐藥性（AMR）基因的存在[14]，使用BLAST（BLASTn）檢測(cè)每個(gè)基因組序列中覆蓋率超過(guò)70%的AMR基因組和80%的同源性，使用snippy軟件進(jìn)行耐藥基因序列點(diǎn)突變比對(duì)分析。點(diǎn)突變基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行一代測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與耐藥基因序列比對(duì)以驗(yàn)證點(diǎn)突變。

1.2.4 質(zhì)粒測(cè)序分析

使用Qiagen Plasmid Midi kit試劑盒來(lái)提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒測(cè)序交由北京諾禾致源公司進(jìn)行，并對(duì)質(zhì)?；蚪M進(jìn)行拼接和組裝；通過(guò)RAST在線網(wǎng)站對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行初步注釋；利用CGE網(wǎng)站中的PlasmidFinder功能鑒定質(zhì)粒的復(fù)制子類型；使用Prokka （v1.12）進(jìn)行基因組注釋，利用card和ISFinder數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充，完善序列結(jié)構(gòu)；采用BLAST Ring Image Generator （BRIG）進(jìn)行質(zhì)粒序列比較分析。

1.2.5 質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

采用質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)測(cè)定質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性。以大腸埃希菌J53為受體，進(jìn)行質(zhì)粒偶聯(lián)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。取出菌株劃線接種至LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)16～18 h，將單菌落接菌至5mL LB液體培養(yǎng)基的離心管中，放至37℃的搖床上增菌培養(yǎng)6 h；分別取20 μL的供體菌和60 μL的受體菌J53混于5 mL的LB液中，使供受體菌比例為1：3即可，放入 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置16～18 h；將上述菌液稀釋1000倍后，吸取100 μL涂布在含有100 mg/mL疊氮化鈉和25 mg/mL阿奇霉素及多黏菌素2 mg/mL的麥康凱培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)36～72 h。挑選單菌落，通過(guò)PCR擴(kuò)增供體和衍生的轉(zhuǎn)偶聯(lián)菌株中存在的質(zhì)粒。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定及藥物敏感性

該分離株的0抗原為：1，4，[5]，12；H抗原第一相為：i；H抗原第二相為：1，2，血清型鑒定為鼠傷寒沙門菌，質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)復(fù)核結(jié)果一致，SS培養(yǎng)基上菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。耐藥性檢測(cè)結(jié)果顯示，該分離株對(duì)包括阿奇霉素、多黏菌素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松等多種臨床常用抗生素耐藥（表1）。E-test實(shí)驗(yàn)復(fù)核結(jié)果顯示，該菌株對(duì)頭孢曲松的MIC值為＞32 μg/mL，對(duì)環(huán)丙沙星的MIC值為1 μg/mL，根據(jù)CLSI M100判定標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)核結(jié)果均為耐藥（圖2）。

2.2 耐藥基因檢測(cè)

該分離株攜帶12類45個(gè)耐藥基因，包括大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因mphA，黏菌素抗性基因mcr-1，氨基糖苷類抗性基因AAC（3）-Ⅳ、AAC（6）-Iaa、ANT（3）-IIa、APH（3）-Ib、APH（6）-Id、aadA2、acrD、kdpE，β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaCTX-M-14和blaTEM-1，磷霉素抗性基因fosA3，磺胺類抗性基因sul1、sul2，四環(huán)素類抗性基因tet（B），多肽類抗性基因bacA，二氨基嘧啶類抗性基因dfrA12，氯霉素抗性基因cmlA1、floR；外排泵相關(guān)基因CRP、acrA、ampH、H-NS、acrB、cpxA、golS、marA、mdsA、mdsB、mdsC、mdtB、mdtC、mdtK、msbA、oqxA、oqxB、qacH、sdiA、tolC和yojI，氟喹諾酮類抗性基因emrA、emrB和emrR（表2）。

該分離株攜帶1個(gè)氟喹諾酮耐藥基因點(diǎn)突變gyrA S83F，測(cè)序結(jié)果顯示，gyrA基因堿基序列的248位點(diǎn)由C突變?yōu)門，從而導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的氨基酸序列83位點(diǎn)由S（絲氨酸）突變?yōu)镕（苯丙氨酸），該突變是產(chǎn)生氟喹諾酮耐藥性的重要機(jī)制[15-16]。

2.3 質(zhì)粒測(cè)序分析

提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序分析，分析結(jié)果顯示該質(zhì)粒類型為IncHI2型。該質(zhì)粒攜帶包括大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因mphA、多黏菌素抗性基因mcr-1在內(nèi)的19個(gè)耐藥基因（表2）。對(duì)該質(zhì)粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示mphA基因位于IS26介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座單元中，mcr-1基因位于ISApl1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座單元中，該質(zhì)粒含有較多插入序列和轉(zhuǎn)座子，如IS2、IS4321、Tn5393和TnAs3等。質(zhì)粒比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)粒與分離于我國(guó)廣州地區(qū)的圣保羅沙門菌中大小為237，710 bp的pS25質(zhì)粒骨架相似，其覆蓋度為81%，相似度為99.98%（圖3）。

2.4 質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移

質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移成功之后的大腸埃希菌 J53 陽(yáng)性接合子經(jīng) PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證mphA和mcr-1基因陽(yáng)性（表3和圖4），對(duì)結(jié)合菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性接合子對(duì)阿奇霉素（最低抑菌濃度為≥16 μg/mL）及多黏菌素耐藥（最低抑菌濃度為＞4 μg/mL）（表1）。

3 討論

隨著臨床治療和畜牧業(yè)長(zhǎng)期使用抗生素，沙門氏菌的耐藥率不斷上升，多重耐藥沙門菌的比例不斷提升。鼠傷寒沙門菌是世界范圍內(nèi)沙門菌感染最常見(jiàn)的血清型之一，其耐藥問(wèn)題尤為突出。研究報(bào)道多重耐藥鼠傷寒沙門菌blaCMY-2在墨西哥迅速?gòu)V泛傳播[17]，對(duì)當(dāng)?shù)毓残l(wèi)生造成極大威脅。多重耐藥鼠傷寒沙門菌在我國(guó)鼠傷寒沙門菌中的占比也高達(dá)52.29%[18]。除了對(duì)常見(jiàn)抗生素的高耐藥率外，近年來(lái)，阿奇霉素及多黏菌素因其治療鼠傷寒沙門菌感染的有效性，這兩類抗生素的臨床應(yīng)用相對(duì)增加，在抗生素選擇壓力下少數(shù)鼠傷寒沙門菌出現(xiàn)對(duì)阿奇霉素的耐藥性、極少數(shù)菌株出現(xiàn)對(duì)多黏菌素的耐藥性，這些耐藥鼠傷寒沙門菌的出現(xiàn)和傳播對(duì)臨床治療沙門菌感染提出了挑戰(zhàn)。

腸桿菌目細(xì)菌對(duì)阿奇霉素的耐藥機(jī)制主要包括①外排泵過(guò)表達(dá)，②多肽基tRNA水解酶過(guò)表達(dá)，③染色體突變，如核糖體蛋白改變和23S rRNA突變，④erm基因編碼的甲基化酶（特別是ermA和ermB）介導(dǎo)的甲基化，⑤ereA和ereB基因編碼的酯酶和/或mphA和mphB編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的大環(huán)內(nèi)酯失活。其中，mphA介導(dǎo)的阿奇霉素耐藥性在腸桿菌目細(xì)菌中被多次報(bào)道[19-20]。

質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-1最初是2015年在中國(guó)的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)的[21]。Hu等[22]通過(guò)已公開(kāi)的細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)mcr-1基因序列最早可在2011年中國(guó)人腸道菌群的研究中被檢出。但mcr-1基因在腸桿菌目細(xì)菌中的檢出水平依然很低，在我國(guó)大腸埃希菌中檢出率為1.20%[23]，沙門菌中檢出率為1.08%[24]。由于mphA和mcr-1往往以質(zhì)粒形式被攜帶，從而導(dǎo)致阿奇霉素、多黏菌素耐藥性通過(guò)水平轉(zhuǎn)移的方式在腸桿菌目細(xì)菌中快速傳播，這些基因甚至可以與其他的耐藥基因共同存在于單一質(zhì)粒，表達(dá)后產(chǎn)生多種耐藥機(jī)制[25]。

本研究報(bào)道了1株同時(shí)攜帶mphA和mcr-1的鼠傷寒沙門菌。該分離株對(duì)包括阿奇霉素、多黏菌素等多種臨床重要抗生素藥物耐藥。值得關(guān)注的是該分離株對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星這些沙門菌感染治療的臨床一線藥物耐藥，這引起我們對(duì)臨床治療的有效性的擔(dān)憂。研究顯示該菌株攜帶12類45個(gè)耐藥基因及1個(gè)氟喹諾酮類耐藥基因點(diǎn)突變gyrA S83F，耐藥基因分析結(jié)果與耐藥性結(jié)果相匹配，這些耐藥基因的攜帶賦予了菌株廣泛的耐藥性。該分離株攜帶的大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因僅有mphA基因，多黏菌素抗性基因僅有mcr-1，說(shuō)明mphA及mcr-1基因在該分離株中分別對(duì)阿奇霉素和多黏菌素的耐藥中起到了關(guān)鍵作用，與已有的研究報(bào)道一致[26-27]。

質(zhì)粒是能夠在細(xì)胞之間自我傳遞的自主DNA分子，它們也能夠通過(guò)稱為高頻重組（Hfr）的過(guò)程動(dòng)員部分染色體[28]。質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)座子或插入序列等可移動(dòng)遺傳元件獲取新基因，以及它們?cè)诖蠓秶拗髦袕?fù)制的能力，使它們成為抗菌素耐藥性（Anti-Microbial Resistance， AMR）傳播的完美載體。腸桿菌目細(xì)菌中最常見(jiàn)的質(zhì)粒為IncA/C、IncFIB、IncN和IncHI2，這些質(zhì)粒在不同菌株間抗生素耐藥性的傳遞中都起著重要作用[29-31]。在本研究中，mphA和mcr-1基因存在于IncHI2型質(zhì)粒上，該類型質(zhì)粒在鼠傷寒沙門菌中廣泛分布，在其多重耐藥的出現(xiàn)和快速傳播中發(fā)揮了重要作用。鼠傷寒沙門菌中IncHI2質(zhì)粒常對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素類和氟喹諾酮類抗生素耐藥，而阿奇霉素耐藥的報(bào)道較少[32-34]。通過(guò)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)比較分析，結(jié)果顯示p15G2563上存在15種插入序列和Tn3、Tn5393等4種轉(zhuǎn)座子，這些插入元件均能獨(dú)立轉(zhuǎn)位，可介導(dǎo)耐藥基因在質(zhì)粒、整合子和染色體間轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)mphA由轉(zhuǎn)座子IS26轉(zhuǎn)座單元介導(dǎo)，mcr-1基因位于ISApl1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座單元中。IS26經(jīng)常與編碼抗生素抗性因子的基因相關(guān)，據(jù)報(bào)道質(zhì)粒中IS26的存在大大增加了額外IS26插入該質(zhì)粒的頻率，從而形成包含多個(gè)抗生素抗性基因的區(qū)域，導(dǎo)致多重耐藥的發(fā)生[35]。ISApl1屬于IS30家族，是介導(dǎo)mcr-1基因最常見(jiàn)的插入元件，Laurent等人研究證實(shí)了復(fù)合轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)ISApl1-mcr-1-ISApl1的轉(zhuǎn)位功能[36]，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)許多mcr-1基因在只有一個(gè)拷貝ISApl1的情況下被介導(dǎo)轉(zhuǎn)座[24]。質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證明了p15G2563可以通過(guò)水平轉(zhuǎn)移導(dǎo)致耐藥性快速擴(kuò)散。

本研究對(duì)該分離株進(jìn)行了耐藥性和耐藥分子機(jī)制的研究，結(jié)果表明該分離株攜帶12類46個(gè)耐藥基因，對(duì)阿奇霉素、多黏菌素、頭孢曲松和環(huán)丙沙星等多種臨床常用抗生素耐藥。mphA和mcr-1基因的存在是該分離株分別對(duì)阿奇霉素和多黏菌素耐藥的主要機(jī)制，且這兩個(gè)基因均存在于p15G2563質(zhì)粒上。p15G2563攜帶19個(gè)耐藥基因和多個(gè)可轉(zhuǎn)移元件，并且可以在腸桿菌目細(xì)菌之間水平轉(zhuǎn)移。廣泛耐藥菌株及攜帶多個(gè)重要耐藥基因的可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒出現(xiàn)，給臨床治療帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，需進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)鼠傷寒沙門菌的抗生素耐藥特征和耐藥譜變化的監(jiān)測(cè)，并持續(xù)探索其耐藥機(jī)制，特別是針對(duì)臨床一線治療藥物的耐藥性展開(kāi)研究，這對(duì)于指導(dǎo)抗生素合理應(yīng)用以及遏制細(xì)菌耐藥性的不斷蔓延具有重要意義。

參 考 文 獻(xiàn)

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