近平滑念珠菌復(fù)合群生物膜形成特點(diǎn)的研究

夏翠萍 汪業(yè)梅 王金宇 王中新

摘要：目的 分析近平滑念珠菌、擬平滑念珠菌、似平滑念珠菌生物膜產(chǎn)量和代謝活性特點(diǎn)及氟康唑?qū)ζ渖锬ば纬傻挠绊?。方?收集111株臨床分離的近平滑念珠菌、擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌，通過結(jié)晶紫、甲基四氮鹽、掃描電子顯微鏡方法分析近平滑念珠菌復(fù)合群之間生物膜產(chǎn)生特點(diǎn)，并觀察氟康唑?qū)交钪榫鷱?fù)合群生物膜形成不同時(shí)間段的影響。結(jié)果 在近平滑念珠菌復(fù)合群中，除了3株尿液分離的近平滑念珠菌外，其余108株（97.3%）均可產(chǎn)生生物膜，近平滑念珠菌的生物膜產(chǎn)量和代謝活性均最強(qiáng)，且生物膜代謝活性在不同培養(yǎng)時(shí)間段（6、12、24、48、72和96 h）逐漸升高，在72 h時(shí)達(dá)最高，96 h時(shí)反而降低。擬平滑念珠菌、似平滑念珠菌雖均可產(chǎn)生生物膜，但生物膜的代謝活性在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段均較弱，且在各個(gè)時(shí)間段無明顯差異。血液分離的近平滑念珠菌生物膜產(chǎn)量低于其他分離部位，生物膜代謝活性也最弱。氟康唑在不同培養(yǎng)時(shí)間段均可抑制生物膜的形成，48 h抑制作用最強(qiáng)。結(jié)論 近平滑念珠菌復(fù)合群中近平滑念珠菌的生物膜產(chǎn)量和代謝活性均最強(qiáng)，血液分離的近平滑念珠菌生物膜產(chǎn)量和代謝活性低于其他分離部位，氟康唑?qū)交钪榫鷱?fù)合群生物膜形成有明顯的抑制作用。

關(guān)鍵詞：近平滑念珠菌復(fù)合群；毒力；生物膜產(chǎn)量；代謝活性；氟康唑

中圖分類號：R446.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the characteristics of biofilm formation of Candida parapsilosis complex

Xia Cuiping1， Wang Yemei2， Wang Jinyu1， and Wang Zhongxin1

（1 Department of Clinical Laboratory， The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022;

2 Anhui Promotion Center for Technology Achievements Transfer， Hefei 230088）

Abstract Objective The yield of biofilm production and the metabolic activity of C. parapsilosis sensu stricto， C. orthopsilosis and C. metapsilosis were anlyzed to understand the effect of fluconazole on their biofilm formation. Methods 111 clinical isolates of C. parapsilosis sensu stricto， C. orthopsilosis and C. metapsilosis were collected， the differences in biofilm production characteristics among Candida parapsilosis complex were analyzed by crystal violet （CV） staining， tetrazolium salt （XTT） and scanning electron microscopy （SEM）， and the effect of fluconazole on C. parapsilosis complex biofilm formation in the different periods was observed. Results In the C. parapsilosis complex， except for 3 isolates of C. parapsilosis sensu stricto from urine， which could not produce biofilm， the remaining 108 isolates （97.3%） could produce biofilm. The biofilm metabolic activity increased gradually at different incubation times （6， 12， 24， 48， 72 and 96 h） and reached its highest at 72 h but decreased at 96 h. Although both C. orthopsilosis and C. metapsilosis could produce biofilm， the biofilm metabolic activity was weak during each culture period， with no significant difference. Blood-isolated C. parapsilosis sensu stricto had a lower yield for biofilm production than other isolated resources， and the biofilm metabolic activity was also the weakest. In addition， fluconazole could inhibit biofilm formation at any time and the inhibition effect reached its strongest at 48 h. Conclusion C. parapsilosis sensu stricto was the strongest biofilm producer and had the highest metabolic activity among C. parapsilosis complex. Biofilm production and metabolic activities of C. parapsilosis sensu stricto isolated from blood were lower than those of other isolated resources. Fluconazole had a significant inhibitory effect on the biofilm formation of the C. parapsilosis complex.

Key words C. parapsilosis complex; Virulence; Biofilm production; Metabolic activity; Fluconazole

近平滑念珠菌是非白念珠菌感染的常見菌種之一，在一些國家和地區(qū)的感染率已超過白念珠菌的感染率[1-2]，尤其是在留置導(dǎo)管、胃腸營養(yǎng)和植入生物材料等患者中感染率更高[3]，當(dāng)不注意手衛(wèi)生的情況下也可通過醫(yī)護(hù)人員的手造成近平滑念珠菌的暴發(fā)感染[4-5]。近平滑念珠菌對氟康唑耐藥率上升最快，已超過其他念珠菌[6]。由于其逐漸增加的感染率和耐藥率，引起了人們的廣泛關(guān)注。雖然擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌屬于不常見念珠菌，但發(fā)現(xiàn)由似平滑念珠菌引起的念珠菌血癥對抗真菌藥物的敏感性更低，并且擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌感染嚴(yán)重者已出現(xiàn)新生兒念珠菌血癥死亡病例[7]。由于近平滑念珠菌復(fù)合群在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和組織結(jié)構(gòu)方面非常接近，并且研究發(fā)現(xiàn)近平滑念珠菌復(fù)合群各菌種之間可存在混合感染，常規(guī)方法不能區(qū)分，因此必須用分子水平的鑒定方法區(qū)別。目前通過分子鑒定技術(shù)將近平滑念珠菌復(fù)合群進(jìn)一步分為近平滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌[8]。生物膜是近平滑念珠菌重要的毒力因子，不僅增強(qiáng)近平滑念珠菌的侵襲性播散，通過減少抗真菌藥的滲透可促進(jìn)耐藥的發(fā)生[9-10]。盡管近平滑念珠菌的感染率逐年上升，但目前對近平滑念珠菌毒力的研究有限。因此，本研究目的是對比近平滑念珠菌復(fù)合群各菌種生物膜形成和代謝活性之間的差異。

1 材料

1.1 菌株來源

本研究收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2021—2022年期間共111株近平滑念珠菌復(fù)合群臨床菌株，并排除了重復(fù)菌株，其中：近平滑念珠菌86株，分離自血液9株，皮膚6株，靜脈導(dǎo)管22株，尿液44株，痰液5株；擬平滑念珠菌12株，分離自血液3株，尿液6株，痰液3株；似平滑念珠菌13株，分離自血液4株，皮膚1株，尿液6株，痰液2株。所有的菌株用念珠菌顯色培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24～48 h，通過菌落形態(tài)對菌株進(jìn)行初步鑒定，再用MALDI-TOF MS（matrix-assisted laser-resolved ionization time-of-flight mass spectrometry， 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間）技術(shù)方法確定。所有菌株用含20%甘油凍存液保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器

培養(yǎng)基：念珠菌顯色培養(yǎng)板（安徽合肥天達(dá)診斷試劑有限公司）；沙氏固體培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar， SDA）（美國Oxiod公司）；酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）（PH7.0）：10 g酵母浸膏（美國Oxiod公司），20 g蛋白胨（美國Oxiod公司），20 g葡萄糖（上海生工）加水定容至1 L，高壓滅菌，4 ℃保存；RPMI-1640液體培養(yǎng)基（不含碳酸氫鈉）：4 g RPMI-1640粉劑[Gibco，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，37.2 g 2-羥基-3-（4-嗎啡基）丙磺酸（M-morpholinepropanesulfonic acid，MOPS，上海生工）（0.165 mol/L）調(diào)制pH7.0，無菌過濾后4 ℃保存。

試劑：α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid， CHCA）基質(zhì)液[Biomerieux（上海）有限公司]，甲基四氮鹽（tetrazolium salt， XTT）鈉鹽（Aladdin，上海）：XTT粉劑用磷酸鹽緩沖液配置成0.5 mg/mL溶液，無菌過濾后-20 ℃保存；甲萘醌（上海生工）：100%丙酮（上海麥克林生化科技有限公司）配制成100 mmol/L溶液儲(chǔ)存濃度，實(shí)驗(yàn)時(shí)用XTT染液配置成1 ?mol/L；六甲基二硅胺烷和25%戊二醛溶液（上海麥克林生化科技有限公司）；氟康唑（Aladdin，上海）：用100%二甲基亞砜（DMSO）（上海麥克林生化科技有限公司）溶解，配置成128 ?g/mL儲(chǔ)存濃度，-20 ℃保存；聚苯乙烯96孔微量培養(yǎng)板（廣州潔特生物有限公司）；12孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司，美國）；10 mm圓形蓋玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）。

儀器：Vitek質(zhì)譜儀（Biomerieux），KHBST-360酶標(biāo)儀（上?？迫A生物工程股份有限公司），Infinite F50酶標(biāo)儀（TECAN），場發(fā)射掃描電子顯微鏡Gemini SEM300（Carl Zeiss公司，由安徽醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供支持）。

2 方法

2.1 生物膜形成準(zhǔn)備

菌株-80 ℃復(fù)溫，念珠菌顯色培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24～48 h，SDA培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h；挑取少量單個(gè)菌落于含1 mL YEPD液體培養(yǎng)基的1.5 mL無菌離心管中，37 ℃搖床180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h；3500 g×5 min，無菌PBS清洗3遍，去除YEPD對生物膜形成的影響；10～15 mL RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)菌液濃度為1.0×106/mL；加入100 ?L菌液于聚苯乙烯96孔微量培養(yǎng)板37 ℃培養(yǎng)48 h，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，RPMI1640培養(yǎng)液設(shè)置為陰性對照。陽性對照菌株為白念珠菌SC5314。

2.2 結(jié)晶紫（crystal violet，CV）染色法測定生物膜產(chǎn)量

近平滑念珠菌復(fù)合群在RPMI1640培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)48 h，去除培養(yǎng)液，PBS輕輕清洗3遍微孔板，加入200 ?L 1%CV溶液常溫下避光處理10 min，PBS輕輕清洗3遍微孔板測定，加入200 ?L 33%冰乙酸溶解結(jié)晶紫，室溫下避光處理10 min，聚苯乙烯96孔微量培養(yǎng)板在570 nm處測吸光度，在不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。為消除背景顏色對吸光度的影響，樣本孔A值均應(yīng)減去陰性對照孔A值。生物膜產(chǎn)量是根據(jù)測得的A值：A樣本孔4×A陰性對照定義為強(qiáng)生物膜產(chǎn)生[11]。

2.3 XTT法測定生物膜代謝活性

近平滑念珠菌復(fù)合群在RPMI1640培養(yǎng)液中37 ℃分別培養(yǎng)6、12、24、48、72和96 h，PBS輕輕清洗3遍微孔板，加入200 ?L 0.05mg/mL XTT染液37 ℃培養(yǎng)箱避光處理3 h，測定聚苯乙烯96孔微量培養(yǎng)板在492 nm處吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。生物膜代謝活性定義：A陰性對照0.57定義為強(qiáng)生物膜代謝活性[12]。

2.4 掃描電子顯微鏡下觀察近平滑念珠菌復(fù)合群生物膜形成特點(diǎn)

按實(shí)驗(yàn)“2.1”方法進(jìn)行生物膜形成的準(zhǔn)備，12孔板中加入無菌直徑為10 mm圓形蓋玻片，每孔加入1 mL菌液37 ℃培養(yǎng)48 h，每24 h更換培養(yǎng)基，PBS貼壁加入清洗3遍，2.5%戊二醛室溫固定16 h，用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%無水乙醇梯度脫水各10 min，六甲基二硅胺烷干燥20 min，高真空離子濺射儀對樣品表面30 mA，30 s進(jìn)行鍍金，在場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察近平滑念珠菌復(fù)合群生物膜形成特點(diǎn)。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)濃度氟康唑?qū)交钪榫鷱?fù)合群生物膜的影響

按“2.1”進(jìn)行近平滑念珠復(fù)合群生物膜形成的準(zhǔn)備，在96孔板中調(diào)整氟康唑濃度為標(biāo)準(zhǔn)濃度

1 ?g/mL，每孔加入100 ?L氟康唑溶液，對照孔中加入100 ?L RPMI1640培養(yǎng)液，后續(xù)再按實(shí)驗(yàn)方法“2.3”進(jìn)行3次，測定近平滑念珠菌復(fù)合群在492 nm處吸光度，分析氟康唑?qū)交钪榫鷱?fù)合群生物膜代謝活性的影響。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

由于測得的數(shù)據(jù)符合定量資料的非參數(shù)檢驗(yàn)，因此選用秩和檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行分析。且生物膜的兩種特性的相關(guān)性選擇Pearson相關(guān)性分析，按P=0.05 可認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)分析使用SPSS 24.0軟件。

3 結(jié)果

3.1 CV法分析近平滑念珠菌復(fù)合群生物膜產(chǎn)量的差異

通過CV方法比較近平滑念珠菌復(fù)合群生物膜產(chǎn)量之間差異，111株近平滑念珠菌復(fù)合群中，73（65.8%）株為強(qiáng)生物膜產(chǎn)生者，8（7.2%）株為中生物膜產(chǎn)生者，27（24.3%）株為弱生物膜產(chǎn)生者，僅3（2.7%）株尿液分離來源近平滑念珠菌無生物膜產(chǎn)生，其余均可產(chǎn)生生物膜，如圖1A。近平滑念珠菌復(fù)合群中，近平滑念珠菌的生物膜產(chǎn)生能力強(qiáng)于擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=30.555，P=0.000<0.05），如圖1B。就不同分離部位而言，血液分離來源的近平滑念珠菌與其他分離來源的近平滑念珠菌比較，生物膜產(chǎn)生能力最弱（Z=-2.093，P=0.036<0.05），其他分離部位來源近平滑念珠菌之間無明顯差異（P>0.05）。

3.2 XTT法分析近平滑念珠菌復(fù)合群之間生物膜代謝活性的差異

通過XTT法比較不同時(shí)間段近平滑念珠菌復(fù)合群生物膜代謝活性之間差異，擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌在不同時(shí)間段（6、12、24、48、72和96 h）生物膜代謝活性均無明顯差異（P>0.05）。近平滑念珠菌從6 h到72 h時(shí)吸光度值不斷升高（P<0.05），近平滑念珠菌生物膜代謝活性在72 h達(dá)最高（P<0.05），96 h時(shí)近平滑念珠菌吸光度值反而降低（P>0.05）。近平滑念珠菌復(fù)合群在6 h時(shí)生物膜代謝活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=3.571，P=0.168>0.05），從12 h到72 h時(shí)，近平滑念珠菌代謝活性高于擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌（P<0.05），如圖2A。血液分離來源的近平滑念珠菌吸光度在各個(gè)時(shí)間段均最低（P>0.05），除皮膚表面分離的近平滑念珠菌吸光度值在96 h達(dá)最高（P>0.05），其余分離部位近平滑念珠菌均在72 h時(shí)吸光度達(dá)最高（P<0.05），如圖2B。擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌的菌株數(shù)過少無法比較不同分離部位之間生物膜代謝活性的差異。近平滑念珠菌復(fù)合群生物膜產(chǎn)量和代謝活性之間的相關(guān)系數(shù)r=0.826（P<0.05）。

3.3 掃描電子顯微鏡下觀察近平滑念珠菌復(fù)合群生物膜形成的差異

如圖3所示，近平滑念珠菌復(fù)合群在12孔板中培養(yǎng)48 h后在掃描電子顯微鏡下呈現(xiàn)出不同的形態(tài)差異。近平滑念珠菌生物膜由多層厚厚的酵母細(xì)胞聚集而成，酵母細(xì)胞多為橢圓形、長條形，大小各異，表面發(fā)生輕微皺縮，呈疏松網(wǎng)織狀生長，其間穿插著假菌絲，擬平滑念珠菌的酵母細(xì)胞呈現(xiàn)出堆積式生長，酵母細(xì)胞數(shù)量較少，由橢圓形、扁平狀酵母細(xì)胞組成，細(xì)胞表面也發(fā)生了皺縮，似平滑念珠菌的生物膜表現(xiàn)為單層單個(gè)酵母細(xì)胞生長方式，扁平狀細(xì)胞較擬平滑念珠菌增多，細(xì)胞表面皺縮明顯，和近平滑念珠菌相比，擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌生物膜的酵母細(xì)胞數(shù)量明顯減少，并且無假菌絲形成，白念珠菌SC5314生物膜呈多層密集式生長，細(xì)胞數(shù)量多，形態(tài)飽滿，近似圓形，較規(guī)則，表面光滑，菌絲較長，形成緊密連接的生物膜結(jié)構(gòu)。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)濃度氟康唑?qū)交钪榫鷱?fù)合群不同階段生物膜代謝活性的影響

本實(shí)驗(yàn)中使用氟康唑濃度為1 μg/ml，研究其對近平滑念珠菌復(fù)合群不同時(shí)間段生物膜代謝活性的抑制作用，如圖3所示。1 μg/mL濃度氟康唑?qū)交钪榫鷱?fù)合群不同階段的生物膜代謝活性均可產(chǎn)生抑制作用（P<0.05），3種菌在生物膜形成的早期（6～12 h）時(shí)氟康唑的抑制作用較弱，48 h時(shí)抑制作用最強(qiáng)，當(dāng)時(shí)間達(dá)72 h時(shí)吸光度值逐漸升高，對生物膜代謝活性的抑制作用開始減弱，對于近平滑念珠菌，氟康唑作用后48 h生物膜代謝活性最弱（χ2=39.5，P=0.00<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌在各時(shí)間段吸光度值在0.08～0.15范圍內(nèi)（χ2=-5.25，P=0.068>0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

生物膜是侵襲性真菌或細(xì)菌重要的毒力因子，由酵母細(xì)胞和菌絲聚集的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，真菌或細(xì)菌可黏附并定植于宿主黏膜或醫(yī)療生物材料表面后形成生物膜，當(dāng)生物膜成熟后可播散，在宿主內(nèi)形成侵襲性傳播。同時(shí)，產(chǎn)生生物膜菌株可增強(qiáng)對宿主吞噬細(xì)胞和抗真菌藥物的抵抗力。目前研究多為白念珠菌生物膜，但隨著導(dǎo)管的長期置入，惡性腫瘤和免疫抑制劑等破壞患者的免疫調(diào)節(jié)能力，近些年來近平滑念珠菌復(fù)合群的臨床感染率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[13-14]，而對近平滑念珠菌復(fù)合群的毒力特點(diǎn)研究較少。本研究收集了111株近平滑念珠菌復(fù)合群菌株，培養(yǎng)48 h后用CV法檢測近平滑念珠菌復(fù)合群生物膜產(chǎn)量的差異，本研究發(fā)現(xiàn)除了3株（2.7%）尿液分離的近平滑念珠菌無生物膜產(chǎn)生，其余均可產(chǎn)生生物膜，其中近平滑念珠菌生物膜產(chǎn)生能力最強(qiáng)，擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌生物膜產(chǎn)生能力無差異，通過掃描電子顯微鏡下觀察同樣發(fā)現(xiàn)近平滑念珠菌生物膜產(chǎn)量較擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌高，與CV法具有協(xié)同意義。Pakshir等[15]的研究顯示部分近平滑念珠菌無生物膜產(chǎn)生，和本實(shí)驗(yàn)一致，而Modiri等[16]的研究發(fā)現(xiàn)近平滑念珠菌復(fù)合群均可產(chǎn)生生物膜，擬平滑念珠菌比近平滑念珠菌生物膜產(chǎn)生速度更快，但近平滑念珠菌生復(fù)合群生物膜產(chǎn)量在48 h時(shí)無明顯差異，但此研究未進(jìn)一步說明不同分離部位之間產(chǎn)生生物膜特點(diǎn)的差異。Song等[17]研究發(fā)現(xiàn)分離自醫(yī)護(hù)人員手表面的擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌無生物膜產(chǎn)生，Ataides等[18]的研究發(fā)現(xiàn)分離自血液和指甲的近平滑念珠菌復(fù)合群中似平滑念珠菌的生物膜形成能力高于近平滑念珠菌和擬平滑念珠菌。Lattif等[19]的研究表明分離自硅膠表面的近平滑念珠菌復(fù)合群均可產(chǎn)生生物膜。血流感染是侵襲性念珠菌最嚴(yán)重的感染形式，其致死率最高[20]，但本研究發(fā)現(xiàn)血液分離的近平滑念珠菌的生物膜產(chǎn)生能力最弱?？紤]生物膜的形成必須先黏附于宿主黏膜或生物材料如靜脈導(dǎo)管、導(dǎo)尿管等表面，因此血液中處于懸浮和流動(dòng)狀態(tài)下的近平滑念珠菌細(xì)胞不利于生物膜的形成。而Santos等[21]的研究顯示分離自血液的近平滑念珠菌復(fù)合群均可產(chǎn)生生物膜，且在培養(yǎng)基中添加葡萄糖時(shí)近平滑念珠菌復(fù)合群生物膜的代謝活性增高，原因可能是與近平滑念珠菌復(fù)合群在高糖、高脂的環(huán)境下易形成生物膜同時(shí)血液流動(dòng)減慢有關(guān)。

XTT是檢測生物膜代謝活性的半定量方法，它進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)后，在活細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過線粒體脫氫酶的還原后被DMSO溶解，通過測量570 nm處吸光度的變化間接反映生物膜的代謝活性[22]。由于XTT及還原產(chǎn)物的水溶性好，對生物膜的結(jié)構(gòu)和代謝活性影響較小，可以達(dá)到簡便快速檢測生物膜的目的。生物膜的生長分為3個(gè)階段，早期（0～12 h），中期（12～30 h），成熟期（31～72 h）[23]，本研究發(fā)現(xiàn)近平滑念珠菌的生物膜代謝活性最強(qiáng)，在72 h時(shí)生物膜代謝活性達(dá)最高，96 h時(shí)代謝活性反而降低，而擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌在各個(gè)時(shí)間段的代謝活性均弱，且兩者無明顯差異，無論是否是強(qiáng)生物膜產(chǎn)生菌株。而Modiri等[16]的研究表明擬平滑念珠菌的生物膜代謝活性在24 h達(dá)最高，并且大于近平滑念珠菌的代謝活性，而近平滑念珠菌的代謝活性在48 h達(dá)最高，似平滑念珠菌代謝活性最低。Trevi?o-Rangel等[24]的研究發(fā)現(xiàn)擬平滑念珠菌的代謝活性最高，而近平滑念珠菌和似平滑念珠菌的代謝活性均低，且兩者無明顯差異。本研究發(fā)現(xiàn)近平滑念珠菌中生物膜產(chǎn)生能力強(qiáng)者的代謝活性強(qiáng)，在72 h達(dá)最高（P<0.05），生物膜產(chǎn)生能力弱者各時(shí)間段的生物膜代謝活性均弱，在48 h達(dá)最高（P>0.05），但對于擬平滑念珠菌來說，無論生物膜產(chǎn)生能力強(qiáng)或者弱，生物膜代謝活性均弱。由此我們可知，不同菌株的生物膜產(chǎn)量和代謝活性不同，相同菌株在不同的生長條件下的生物膜產(chǎn)量和代謝活性也有差別，相同菌株在不同附著材料表面形成的生物膜也有差異。

氟康唑由于其抗菌效果好、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)成為臨床最常用的抗真菌藥物之一，生物膜利用其細(xì)胞外基質(zhì)成分減少抗菌藥物的滲透從而增強(qiáng)菌株的耐藥性。本研究中氟康唑?qū)Σ煌瑫r(shí)間段的近平滑念珠菌生物膜代謝活性均有抑制，但早期（6～12 h）抑制作用較弱，48 h達(dá)最強(qiáng)，生物膜成熟后期（72～96 h）抑制作用逐漸減弱，表明在生物膜形成中期時(shí)氟康唑的抑制作用最強(qiáng)，早期和成熟后期抑制作用較弱，可能的原因是氟康唑是抑菌藥，并不能完全抑制生物膜的生長。Kaneko等[25]的研究發(fā)現(xiàn)氟康唑?qū)Π啄钪榫锬さ囊种谱饔迷谠缙冢? h）時(shí)較弱，達(dá)10 h時(shí)抑制作用增強(qiáng)，對生物膜的抑制作用有延遲效果，和本研究一致，而Kawai等[26]的研究卻表明氟康唑?qū)Ψ前啄钪榫锬]有抑制作用，因此對于氟康唑?qū)ι锬さ囊种谱饔萌孕柽M(jìn)一步研究。

針對本研究中，CV法測定的是96孔板上近平滑念珠菌復(fù)合群所有細(xì)胞的生物膜，包括活細(xì)胞和死細(xì)胞，而XTT法僅測定活細(xì)胞的生物膜，因此CV法的敏感性更高，XTT法的特異性更強(qiáng)。本研究利用兩種方法發(fā)現(xiàn)近平滑念珠菌復(fù)合群各菌種生物膜產(chǎn)量和代謝活性之間存在相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義性（r=0.826，P<0.05）。而在Ramage[27]的研究中發(fā)現(xiàn)兩種方法表現(xiàn)的是近平滑念珠菌復(fù)合群生物膜的兩種不同特性，兩者不存在協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)中的擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌菌株數(shù)量較少，近平滑念珠菌各個(gè)分離部位的菌株量也有差異，這些均可能影響試驗(yàn)結(jié)果和重復(fù)試驗(yàn)的一致性。未來的試驗(yàn)將增大樣本量進(jìn)一步研究近平滑念珠菌復(fù)合群之間生物膜的特點(diǎn)，不同分離部位來源的菌株生物膜產(chǎn)生是否有區(qū)別以及產(chǎn)生這種差異的機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)

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