維生素D 對(duì)PCOS 大鼠顆粒細(xì)胞凋亡的影響

孫婷，馬思琪，郜艷翠，劉遠(yuǎn)航，李琳，曲銀娥

華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山 063210

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）常見(jiàn)于育齡期女性，發(fā)病率為6%～8%[1]，其特征是生殖、內(nèi)分泌和代謝異常，但持續(xù)的激素失衡會(huì)導(dǎo)致月經(jīng)周期不規(guī)律、排卵障礙等，可導(dǎo)致女性不孕。顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）是卵泡的主要組成部分，是分泌性激素的重要細(xì)胞，在女性卵巢內(nèi)，通過(guò)GCs 凋亡機(jī)制調(diào)控優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育及卵泡閉鎖[2]。有研究報(bào)道，PCOS 患者卵巢GCs可能存在異常細(xì)胞凋亡調(diào)控而引起PCOS[3]。研究發(fā)現(xiàn)PCOS 患者體內(nèi)維生素D（vitamin D，VD）不足與PCOS 發(fā)病有一定關(guān)系，給予適當(dāng)VD 治療可改善PCOS 患者血壓情況、降低胰島素抵抗以及總睪酮（testosterone，T）和雄烯二酮水平，同時(shí)，VD 在調(diào)節(jié)人類(lèi)和大鼠的排卵障礙中起著重要作用[4-5]。PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路參與了PCOS 疾病的發(fā)生，并對(duì)PCOS 卵泡異常發(fā)育起到了調(diào)控作用[6]，但VD 是否通過(guò)PI3K/AKT/mTOR 影響顆粒細(xì)胞凋亡目前尚不明確。本研究通過(guò)構(gòu)建PCOS 大鼠模型，給予VD 治療，分離培養(yǎng)GCs，給予PI3K 抑制劑LY294002 處理，探討VD 對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，為治療PCOS 提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3 周齡SD 雌性大鼠21 只，體質(zhì)量55～70g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可證號(hào)：SCXK（京）2019-0009]，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中心：室內(nèi)溫度23.0℃，濕度45%。本研究經(jīng)華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（倫理審批號(hào)：SQ2022098）。

1.1.2 藥物與試劑 來(lái)曲唑（生產(chǎn)單位：浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：H20133109，規(guī)格：2.5mg），維生素D（生產(chǎn)單位：青島雙鯨藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：H20113033，規(guī)格：每粒含維生素D 400 單位）；羧甲基纖維素鈉（Adams-beta）；PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Bax蛋白、Bcl-2 抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，批號(hào)分別為M09282477、4020965、HJ1121、HJ1121、50613、M08091506、M07221637、M0912208）；β-actin 抗體（武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，批號(hào)：AC026）；兔二抗（美國(guó)Sera care 公司，批號(hào)：10312942）；LY294002（美國(guó)Cayman 公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及藥物干預(yù) 21 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2～3d 后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（n=6）和造模組（n=15）。建立PCOS 大鼠模型。造模組采用來(lái)曲唑[1mg/（kg·d），溶于0.5%羧甲纖維素鈉溶液]灌胃聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組采用等量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，給予普通飼料喂養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)28d。喂養(yǎng)第21 天起，每天7 時(shí)30 分對(duì)兩組大鼠進(jìn)行陰道細(xì)胞學(xué)檢查，觀察大鼠動(dòng)情周期變化。造模后眼內(nèi)眥取血，測(cè)定T、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）。再將12 只造模成功的大鼠（3 只造模失敗），采用隨機(jī)數(shù)字表法分為PCOS 組（n=6）和PCOS+VD 組（n=6），PCOS+VD 組大鼠給予VD[200IU/（kg·d）]干預(yù)，對(duì)照組和PCOS 組同時(shí)間灌胃同等劑量玉米油，普通飼料喂養(yǎng)，連續(xù)21d。

1.2.2 GCs 的分離培養(yǎng)及鑒定 無(wú)菌取出卵巢，在預(yù)溫的磷酸鹽緩沖液中清洗3 次，體視顯微鏡下用1ml 的注射器針頭劃破卵巢表面被膜，刺破大卵泡，使細(xì)胞流出，使用70μm 細(xì)胞篩除去較大卵巢組織，然后用40μm 細(xì)胞篩再次過(guò)濾，離心5min，棄去上清液。用DMEM/F12 完全培養(yǎng)基（含1%雙抗、15%胎牛血清）重懸細(xì)胞，在37℃、6%CO2和95%濕度條件下孵育。棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，4%多聚甲醛固定后，加入胎牛血清封閉30min，棄去封閉液加入FSHR 抗體過(guò)夜，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光鑒定GCs。卵泡刺激素受體是顆粒細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，表達(dá)于GCs 胞質(zhì)，呈綠色熒光。結(jié)果顯示，陽(yáng)性率>90%，提示從大鼠卵巢分離培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，見(jiàn)圖1。將顆粒細(xì)胞分為GCs 對(duì)照組（n=6）、GCs-PCOS 組（n=6）、GCs-（PCOS+VD）組（n=6）、GCs-（PCOS+VD+LY294002）組（n=6）（在抑制劑LY294002 作用前12h，將培養(yǎng)液中胎牛血清濃度減至2%，LY294002 濃度為20μmol/L，作用24h）。

圖1 顆粒細(xì)胞鑒定（×100）

1.3 觀察指標(biāo)

①陰道細(xì)胞學(xué)檢查：將蘸有生理鹽水的無(wú)菌棉簽插入大鼠陰道，沿陰道壁順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)一圈，涂于干凈載玻片上，根據(jù)瑞氏染色劑說(shuō)明進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，判斷動(dòng)情周期；②卵巢組織形態(tài)學(xué)變化：藥物干預(yù)結(jié)束當(dāng)晚20 時(shí)開(kāi)始禁食水，次日早8 時(shí)眼內(nèi)眥取血，脫臼處死大鼠。取大鼠雙側(cè)卵巢，左側(cè)卵巢4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm 連續(xù)切片，用于蘇木精-伊紅染色；右側(cè)卵巢分離GCs，體外培養(yǎng)，用于檢測(cè)凋亡率、電鏡觀察及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)；③酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠血清中25-（OH）D、T、FSH、LH 水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作；④顆粒細(xì)胞凋亡情況：收集處理結(jié)束后的各組GCs，用預(yù)冷的磷酸鹽洗滌細(xì)胞沉淀，在1×結(jié)合緩沖液中以濃度為1×106/ml 將細(xì)胞懸?。粚?00μl 細(xì)胞懸液（1×105個(gè)細(xì)胞）轉(zhuǎn)移至EP 管中，添加5μl FITC 膜聯(lián)蛋白和5μl 碘化丙啶（propidium iodide，PI），輕輕旋轉(zhuǎn)細(xì)胞，并在室溫（25℃）下黑暗中培養(yǎng)15min，然后再向每個(gè)EP管中添加400μl 1×結(jié)合緩沖液，在1 小時(shí)內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡率；⑤蛋白表達(dá)水平：LY294002 作用24h 后收集蛋白，采用蛋白印跡法進(jìn)行檢測(cè)。使用Nanodrop2000 測(cè)蛋白濃度，固定上樣蛋白質(zhì)量（50 μg）和體積（10μl），取適量蛋白加5×上樣緩沖液，并用雙蒸水配平沸水煮10min。取每組蛋白樣品各10μl 經(jīng)凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜；TBST 緩沖液洗滌5min 后放入6%的脫脂奶粉中，室溫封閉2h。將聚偏二氟乙烯膜放入一抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、m-TOR、p-mTOR、Bax、Bcl-2（稀釋比例均為1:500），4℃過(guò)夜。加入二抗（1:5000），37℃放置70min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Image Lab 軟件掃描條帶，導(dǎo)出結(jié)果用ImageJ 量化后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)情周期比較

對(duì)照組大鼠動(dòng)情周期規(guī)律，4～5d 為一個(gè)動(dòng)情周期。造模組大鼠動(dòng)情周期紊亂，10 只大鼠動(dòng)情間期延長(zhǎng)，2 只大鼠動(dòng)情前期延長(zhǎng)，經(jīng)VD 治療后，動(dòng)情周期恢復(fù)正常，見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠動(dòng)情周期變化（瑞氏染色，×400）

2.2 卵巢組織形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組大鼠卵巢內(nèi)可見(jiàn)不同發(fā)育階段的卵泡及黃體，顆粒細(xì)胞層數(shù)多、排列整齊，未見(jiàn)囊狀卵泡；PCOS 組大鼠卵巢中卵泡數(shù)量減少，呈囊狀改變，顆粒細(xì)胞層數(shù)少且排列不規(guī)則，黃體數(shù)量減少；PCOS+VD 組囊狀卵泡明顯減少，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞層數(shù)增多且排列整齊，黃體數(shù)目增多，見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化（HE）

2.3 血清25-(OH)D 及激素水平比較

與對(duì)照組比較，PCOS 組、PCOS+VD 組的血清25-（OH）D 水平均降低，但PCOS+VD 組高于PCOS 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，PCOS 組、PCOS+VD 組的血清T、LH 均升高，F(xiàn)SH 均降低，LH/FSH 均增高，其中PCOS+VD組的25-（OH）D 和FSH 水平高于PCOS 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清25-（OH）D 及激素水平比較（）

表1 各組大鼠血清25-（OH）D 及激素水平比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PCOS 組比較，#P<0.05

2.4 GCs 凋亡率比較

與GCs-對(duì)照組[（5.63±1.86）%]比較，GCs-PCOS組[（27.23±0.96）%]、GCs-（PCOS+VD）組[（6.65±1.30）%]、GCs-（PCOS+VD+LY294002）組[（22.15±2.10）%]的細(xì)胞凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=136.4，P<0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組顆粒細(xì)胞凋亡

透射電鏡觀察顯示，GCs-PCOS 組大鼠顆粒細(xì)胞體積小，染色質(zhì)凝聚呈塊狀，經(jīng)VD 治療后，細(xì)胞核染色質(zhì)輕微邊移，凋亡現(xiàn)象得到明顯改善，GCs-（PCOS+VD+LY294002）組細(xì)胞染色質(zhì)形態(tài)與GCs-PCOS 組相似，見(jiàn)圖5。

圖5 各組顆粒細(xì)胞凋亡電鏡觀察結(jié)果（×4000）

2.5 Bcl-2、Bax、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白表達(dá)水平比較

與GCs 對(duì)照組比較，GCs-PCOS 組Bcl-2 蛋白表達(dá)降低、Bax 蛋白表達(dá)增加、Bcl-2/Bax 降低，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與GCs-PCOS 組比較，GCs-（PCOS+VD）組Bcl-2 蛋白表達(dá)增加、Bax 蛋白表達(dá)降低、Bcl-2/Bax比率升高，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；GCs-（PCOS+VD+LY294002）組與GCs-PCOS 組各項(xiàng)蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與GCs-（PCOS+VD）組比較，GCs-（PCOS+VD+LY294002）組Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2、Bcl-2/Bax、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖6、7，表2。

表2 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白水平比較（）

表2 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白水平比較（）

注：與GCs 對(duì)照組比較，*P<0.05；與GCs-PCOS 組比較，#P<0.05；與GCs-（PCOS+VD）組比較，△P<0.05

圖6 各組卵巢顆粒細(xì)胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)變化

3 討論

維生素D 是一種類(lèi)固醇激素，其受體廣泛分布于各種細(xì)胞中，顆粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞等。除參與鈣磷代謝平衡與骨骼結(jié)構(gòu)外，維生素D在高血壓、肥胖癥、代謝性和自身免疫性疾病等多種疾病預(yù)防方面具有潛在作用。研究顯示，適當(dāng)補(bǔ)充維生素D，可使PCOS 女性血清中25-（OH）D恢復(fù)至生理水平，有效降低空腹血糖，改善胰島素敏感性、高脂血癥和激素水平[7-8]。

在卵泡和卵母細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中，除了膜細(xì)胞為卵泡的發(fā)育提供必要的雄激素并介導(dǎo)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間的相互作用外，顆粒細(xì)胞在決定卵泡的命運(yùn)和卵母細(xì)胞的成熟方面起著決定性的作用[9-10]。Dell’Aquila 等[11]報(bào)道，顆粒細(xì)胞凋亡率過(guò)高影響卵母細(xì)胞成熟。另有學(xué)者認(rèn)為，PCOS 患者血清中T和LH水平及胰島素的升高可使顆粒細(xì)胞異常凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常，增加不孕率[12-13]。本研究首先建立PCOS 大鼠模型，通過(guò)給予維生素D治療，探究維生素D 對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響以及作用機(jī)制。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，GCs-PCOS 組大鼠顆粒細(xì)胞凋亡率顯著高于GCs-對(duì)照組，GCs-（PCOS+VD）組較GCs-PCOS 組凋亡率降低。透射電鏡結(jié)果佐證了上述結(jié)果，GCs-PCOS 組染色質(zhì)核凝聚呈塊狀，GCs-（PCOS+VD）組的凋亡現(xiàn)象明顯改善。本研究結(jié)果顯示，GCs-PCOS 組Bax 表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低。經(jīng)VD 治療后，Bcl-2 蛋白表達(dá)升高，Bax 蛋白表達(dá)降低（即Bcl-2/Bax 比率處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)）。由此可推測(cè)，PCOS大鼠血清中激素水平異常導(dǎo)致高雄激素血癥和氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致卵泡異常發(fā)育。同時(shí)，卵泡發(fā)育異常也可促進(jìn)多囊卵巢的發(fā)生[14-16]。本研究結(jié)果與金萍[17]和Narvaez 等[18]研究結(jié)果具有一致性，給予VD 治療可抑制細(xì)胞凋亡。

圖7 各組顆粒細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白表達(dá)

PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路不僅參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和存活過(guò)程，同時(shí)調(diào)控細(xì)胞的凋亡與自噬，當(dāng)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路出現(xiàn)異常情況時(shí)，會(huì)導(dǎo)致PI3K 激活或惡性轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步磷酸化下游因子AKT并激活mTOR，選擇性激活細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)基因表達(dá)[19]。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)給予PI3K 抑制劑LY294002 干預(yù)后，與GCs-（PCOS+VD）組相比，細(xì)胞內(nèi)p-PI3、p-AKT、p-mTOR 蛋白表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率升高。與GCs-PCOS 組的結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示，維生素D 抑制顆粒細(xì)胞凋亡可能與激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路有關(guān)，與已有研究結(jié)果一致[20]，在軟骨細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路調(diào)控其凋亡與自噬，Gong 等[16]和陳嬌等[21]研究結(jié)果顯示，PI3K/AKT 信號(hào)通路可被生長(zhǎng)激素和miR-141 激活，抑制PCOS大鼠卵巢GCs 凋亡，促進(jìn)其增殖。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)VD 干預(yù)治療后，GCs 凋亡率降低，凋亡因子Bcl-2/Bax 比率升高，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白表達(dá)上調(diào)，LY294002 作用后阻斷了PI3K 通路的激活，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡率升高，結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明VD 對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的治療作用可由于抑制劑LY294002 阻滯PI3K 通路的激活而無(wú)治療效果，表明VD 抑制PCOS 大鼠顆粒細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR 通路來(lái)完成的。

綜上所述，本文通過(guò)維生素D 體內(nèi)治療，并進(jìn)行顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)及抑制劑LY294002 作用后發(fā)現(xiàn)，維生素D 可能通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路抑制卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞的凋亡。因此，維生素D可為今后治療PCOS 提供新的治療方案。然而，細(xì)胞凋亡途徑復(fù)雜，是否通過(guò)外在途徑、線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡仍需進(jìn)一步探究。