易損斑塊相關(guān)生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

葛強，徐政昊，袁蔚，申瀟竹，劉希光

1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院，江蘇連云港 222002；2.連云港市第二人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，江蘇連云港 222000

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種可累及全身各處動脈的自身免疫性疾病，主要為大中動脈，病因錯綜復(fù)雜。病程進(jìn)展緩慢，呈進(jìn)行性加重，一般從脂質(zhì)沉積、局灶性纖維化、粥樣斑塊逐漸發(fā)展為管壁彈性下降、管腔狹窄，最終導(dǎo)致動脈閉塞，引起心肌梗死或缺血性卒中等急性事件。在動脈粥樣硬化患者中，頸動脈斑塊往往是最早識別的靶點，可通過觀察頸動脈的狀態(tài)來評估其他動脈血管情況。不僅如此，頸動脈斑塊的形成可獨立預(yù)測腦血管緊急事件的發(fā)生，約20%的缺血性卒中源于它。有研究發(fā)現(xiàn)，頸部非狹窄性易損斑塊對卒中的發(fā)生及后續(xù)復(fù)發(fā)風(fēng)險均有重要的影響[1-2]。因此盡早發(fā)現(xiàn)易損斑塊，積極治療，可預(yù)防急性腦血管意外。但是易損斑塊的形成機(jī)制仍不是很明確，故本文對頸動脈易損斑塊形成的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)，以尋找可以作為治療靶點的循環(huán)生物標(biāo)志物，為指導(dǎo)臨床治療提供依據(jù)。

1 易損斑塊

動脈粥樣硬化斑塊根據(jù)其穩(wěn)定性可分為穩(wěn)定斑塊和易損斑塊，易損斑塊通常指那些容易形成血栓或短期內(nèi)極可能快速進(jìn)展的斑塊。易損斑塊的發(fā)生機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，比較常見的有慢性炎癥、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)皮損傷及血流動力學(xué)改變、巨噬細(xì)胞凋亡和表型極化等[3]。在晚期動脈粥樣硬化斑塊中，纖維帽破裂是加速斑塊生長的主要因素并經(jīng)常導(dǎo)致心腦血管意外的發(fā)生，Redgrave等[4]進(jìn)一步將斑塊細(xì)分為穩(wěn)定的、主要穩(wěn)定的、具有完整纖維帽的不穩(wěn)定斑塊和纖維帽破裂的不穩(wěn)定斑塊4 種類型。易損斑塊通常具有薄的纖維帽、富含脂質(zhì)的壞死核心，其特征有炎癥過程、巨噬細(xì)胞浸潤和新生血管形成等，特別是斑塊內(nèi)出血更容易促使易損斑塊的形成[5]。

2 T 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在易損斑塊中的重要作用

T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在易損斑塊中大量存在，不同功能狀態(tài)的T 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間必然存在復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用，共同參與了動脈粥樣硬化斑塊的形成及心腦血管意外的發(fā)生。

2.1 T 細(xì)胞

斑塊中的T 細(xì)胞主要為CD4+和CD8+T 細(xì)胞，其細(xì)胞亞群較血液中更為活躍，CD8+T 細(xì)胞占比更多，其可被不同程度激活而后衰竭，所以斑塊內(nèi)表現(xiàn)為活化和衰竭的T 細(xì)胞亞群并存的局面[6]。長期慢性炎癥刺激可使T 淋巴細(xì)胞衰竭，此時T 淋巴細(xì)胞失去其強大的效應(yīng)器功能，并表達(dá)多種抑制性抗體，如靶向程序性死亡蛋白 1（programmed death-1，PD-1）、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原 4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA4）等[7]。但這一過程是可逆的，為免疫療法提供了可能。Fernandez 等[8]分析信號通路發(fā)現(xiàn)γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和PD-1 信號傳導(dǎo)被同時激活，再次證實了斑塊中同時存在激活的、促炎的和衰竭的CD8+T 細(xì)胞。此外，在無癥狀斑塊中由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和IFN-γ 配體驅(qū)動的CD4+和CD8+T 細(xì)胞之間的配體-受體相互作用可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）具有抗動脈粥樣硬化作用，通過分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10、IL-35 和轉(zhuǎn)錄生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）來抑制炎癥細(xì)胞的募集和活化，還可以抑制T 細(xì)胞向Th1 和Th17 亞型分化，發(fā)揮誘導(dǎo)、維持免疫穩(wěn)態(tài)及免疫耐受的作用[9]，對本質(zhì)為自身免疫性疾病的動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定頗有益處。另外還能促進(jìn)膠原合成和平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cell，SMC）增殖，進(jìn)而增強斑塊穩(wěn)定性，且該效應(yīng)是通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 型分化實現(xiàn)的[10]。由此可見T 細(xì)胞在易損斑塊形成過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，且與巨噬細(xì)胞密不可分。

2.2 巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞積聚在動脈粥樣硬化累及的動脈壁內(nèi)是一種常見的現(xiàn)象，巨噬細(xì)胞的表型很大程度上影響了疾病的未來走向。炎性巨噬細(xì)胞M1 分泌促炎因子促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展及破壞斑塊穩(wěn)定性，抗炎巨噬細(xì)胞M2 則對動脈粥樣硬化斑塊有保護(hù)作用，兩種表型的轉(zhuǎn)化趨勢受斑塊微環(huán)境中多種因子調(diào)節(jié)，如Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLR)、細(xì)胞因子、氧化脂質(zhì)等會使斑塊巨噬細(xì)胞的極化偏向促炎M1 表型且遠(yuǎn)離抗炎M2 表型[11]。Huang 等[12]在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞中TLR2 和TLR4 信號傳導(dǎo)在轉(zhuǎn)錄因子Sub1 介導(dǎo)下發(fā)揮促炎和促動脈粥樣硬化作用。M2 型巨噬細(xì)胞能延緩斑塊發(fā)展，由CD206 標(biāo)記的2 個巨噬細(xì)胞亞群（CD64+HLADR+CD206hi、CD64+HLADR+CD206lo）組成，約占斑塊巨噬細(xì)胞的47%[8]。細(xì)胞外基質(zhì)降解往往會導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，然而巨噬細(xì)胞在上調(diào)人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（human tissue inhibitors of metalloproteinase-1，TIMP-1），減少細(xì)胞外基質(zhì)降解的同時，卻降低了斑塊穩(wěn)定性[8]，可能是M1 和M2 型巨噬細(xì)胞共同作用的結(jié)果。研究表明，當(dāng)動脈粥樣硬化進(jìn)展到晚期時，除出現(xiàn)特異性臨床表現(xiàn)外，心肌梗死及腫瘤相關(guān)的一種血清長鏈非編碼RNA-MIAT 的表達(dá)也會出現(xiàn)異常升高，而抑制MIAT 基因表達(dá)有助巨噬細(xì)胞清除凋亡細(xì)胞，減弱動脈粥樣硬化的進(jìn)展，減少壞死核心的大小，并增加斑塊的穩(wěn)定性[13]。此外，miR-149-5p過表達(dá)會通過調(diào)控靶向組蛋白去乙?；? 及神經(jīng)肽2 來抑制血小板衍生的生長因子BB 觸發(fā)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖、入侵和遷移[14-15]。生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-149-5p 在circDHCR24 的3'-UTR 具有互補的結(jié)合位點，熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚏IP 實驗進(jìn)一步驗證了circDHCR24 在人主動脈血管平滑肌細(xì)胞中作為miR-149-5p 的海綿[16]。Ye 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，MIAT作為微小RNA（micro RNA，miRNA）海綿，通過海綿作用于miR-149-5p，正向調(diào)節(jié)抗吞噬分子CD47的表達(dá)，進(jìn)一步確定了巨噬細(xì)胞MIAT/miR-149-5p/CD47 通路也是動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素。研究表明，含有大量巨噬細(xì)胞的頸動脈勻漿中存在大量基質(zhì)金屬蛋白酶降解基質(zhì)，形成擴(kuò)張性動脈重塑，最終導(dǎo)致斑塊易損的風(fēng)險提高[18]。

3 循環(huán)生物標(biāo)志物在易損斑塊中的作用機(jī)制

3.1 腫瘤壞死因子受體家族相關(guān)蛋白和干擾素調(diào)節(jié)因子-5

一項以小鼠為實驗對象的研究中，腫瘤壞死因子受體家族相關(guān)蛋白（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）的缺陷會導(dǎo)致單核細(xì)胞聚集障礙，活性氧產(chǎn)生受限，及巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，還會抑制線粒體功能、免疫和炎癥通路，使巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥的能力下降，從而減少易損斑塊形成，反之則促進(jìn)[19]。小鼠的GITR 免疫反應(yīng)模式與人類相似。此外，研究發(fā)現(xiàn)干擾素調(diào)節(jié)因子-5（interferon regulatory factor 5，IRF-5）與整合素CD11c 在基因表達(dá)水平、免疫陽性斑塊面積高度相關(guān)，特別是它們的蛋白表達(dá)有共同的定位，主要在斑塊的肩部區(qū)域[20]。IRF-5 誘導(dǎo)的CD11c+巨噬細(xì)胞可通過下調(diào)橋接分子Mfge8-αvβ3 整合素通路來降低胞吐能力，從而增加斑塊及壞死核心的大小[21]。故GITR 和IRF-5也是引起動脈粥樣硬化易損斑塊的一個機(jī)制。

3.2 幾丁質(zhì)酶3 樣蛋白1

幾丁質(zhì)酶3 樣蛋白1(chitinase-3-like 1，CHI3L1)是一種分泌型糖蛋白，屬于糖苷水解酶家族18 的一員，其表達(dá)水平以往常作為反映肝纖維化程度的關(guān)鍵指標(biāo)。近年來研究關(guān)注的重點多為炎癥、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞活化、血管生成等[21]。與此同時，CHI3L1對頸動脈斑塊的影響近些年也受到了廣泛關(guān)注，其作用機(jī)制比較復(fù)雜。一方面，CHI3L1 在有癥狀的頸動脈粥樣硬化患者的血清中較健康人群含量增多，該現(xiàn)象可能為環(huán)境適應(yīng)性反應(yīng)，旨在阻止血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，將其維持在分化狀態(tài)，從而達(dá)到穩(wěn)定斑塊的效果[22]。進(jìn)一步研究將其確定為一種新的血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）表型調(diào)節(jié)劑，高水平的CHI3L1 使腫瘤抑制基因（large tumor suppressor kinase 2，LATS2）表達(dá)下降，產(chǎn)生下游抑制效應(yīng)，降低VSMCs 上的LGALS3 和IL6、IL1β 的表達(dá)，防止VSMCs 產(chǎn)生不良生物學(xué)行為，包括細(xì)胞凋亡和表型向“巨噬細(xì)胞樣”狀態(tài)轉(zhuǎn)變[23]。另一方面，CHI3L1 介導(dǎo)動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管的形成，誘發(fā)斑塊內(nèi)出血，增加斑塊不穩(wěn)定性。試驗證明CHI3L1 增強了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的遷移、成管和斑塊內(nèi)新生血管形成，且至少部分是由其細(xì)胞膜受體白細(xì)胞介素-13 受體α2 通過ERK 和AKT 信號通路介導(dǎo)的，因為該作用可被絲裂原活化蛋白激酶激酶和磷脂酰肌醇3-激酶的抑制劑顯著抑制[24]。CHI3L1 對頸動脈粥樣硬化斑塊的影響是雙重的，其在斑塊發(fā)生發(fā)展過程中必然發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用，同時對于晚期易損斑塊形成后又起了相當(dāng)一部分保護(hù)作用。因此，CHI3L1不僅是一個可以預(yù)測不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊存在的生物標(biāo)志物，還可以作為斑塊穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)因子。隨著研究的進(jìn)展，CHI3L1 在血管生物學(xué)上相互矛盾的作用機(jī)制解釋清楚以后，將是一個理想的治療靶點。

3.3 纖維蛋白原和纖維蛋白原γ'

纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)ib）在上級凝血因子作用下形成纖維蛋白網(wǎng)附著在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，誘導(dǎo)血栓形成，進(jìn)而沉積在血管內(nèi)壁上加速粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。尤其在血漿脂蛋白促進(jìn)血小板活化和聚集、穩(wěn)定纖維蛋白網(wǎng)結(jié)構(gòu)等作用下，進(jìn)一步促進(jìn)易損斑塊的發(fā)展，大幅提高斑塊破裂風(fēng)險[25]。Fib與白蛋白的比率 (fibrinogen to albumin ratio,FAR)是一種新型炎癥和血栓形成標(biāo)志物，且既往研究表明Fib 和低血清白蛋白水平與急性缺血性卒中的不良預(yù)后有關(guān)，故有學(xué)者將之應(yīng)用于急性腦梗死預(yù)后的預(yù)測，結(jié)果顯示 FAR 值≥0.077 提示急性腔隙性腦梗死后3 個月的不良結(jié)局[26]。纖維蛋白原γ'（Fibγ'）是纖維蛋白原的一種亞型，具有抗凝血特性。已有報道稱Fibγ'可以增加中國人群缺血性腦卒中的易感性[27]，但頸動脈易損斑塊的作用機(jī)制一直未經(jīng)明確闡述。而最新研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ib 和Fibγ'水平較高的患者與水平較低的患者相比，斑塊內(nèi)出血體積和富含脂質(zhì)的壞死核心體積顯著降低，且不受C 反應(yīng)蛋白的影響[28]，說明Fib 和Fib γ'在易損斑塊的發(fā)展中具有保護(hù)作用。這些研究讓我們看到了纖維蛋白原在頸動脈易損斑塊形成中的重要性。

3.4 纖維膠凝蛋白

最新研究發(fā)現(xiàn)，纖維膠凝蛋白（ficolin，F(xiàn)CN）與炎癥標(biāo)志物如髓過氧化物酶、基質(zhì)金屬蛋白酶8、基質(zhì)金屬蛋白酶9、細(xì)胞間黏附分子-1、骨橋蛋白、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶等表達(dá)水平呈正相關(guān)，在明視野顯微鏡下可見FCN 主要存在于斑塊中富含膽固醇晶體的壞死核心區(qū)域[29]。FCN -2 與動脈粥樣硬化患者中預(yù)測主要不良心血管事件的炎癥蛋白——骨橋蛋白及斑塊下游的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)，與動脈粥樣硬化的保護(hù)因子高密度脂蛋白膽固醇呈負(fù)相關(guān)，但與SMCs 呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)CN-2 介導(dǎo)斑塊內(nèi)免疫細(xì)胞募集和炎癥過程，最終導(dǎo)致斑塊易損[30]。還有一個奇怪的現(xiàn)象，動脈粥樣硬化患者的FCN-2 血清水平高于健康人群，但在易損斑塊患者血漿中可見FCN-2 表達(dá)水平明顯下降[29]，據(jù)此可以推測FCN-2 參與了動脈粥樣的過程并不斷積累，同時在疾病晚期的斑塊侵蝕階段被炎癥不斷消耗。此外，F(xiàn)CN-1 和FCN-3 也與炎癥發(fā)生、易損斑塊的形成密切相關(guān)，如FCN-3 表達(dá)水平的高低與頸動脈易損斑塊形成呈負(fù)相關(guān)[31]。甚至在2 型糖尿病患者中，F(xiàn)CN-3 的升高可獨立預(yù)測斑塊形成的風(fēng)險[32]。一項回顧性分析顯示原發(fā)性高血壓患者血清FCN-3 越低，頸動脈內(nèi)膜中層的厚度隨之增加，進(jìn)而加速心血管疾病發(fā)展[33]。

3.5 血清信號素7A

血清信號素7A（semaphorin 7A，Sema7A）對動脈粥樣硬化斑塊的影響比較復(fù)雜，在不同的器官中有不同的促炎和抗炎作用[34]。Sema7A 通過激活mTOR和AKT2 信號通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化，激活巨噬細(xì)胞向M2 表型極化，促進(jìn)白細(xì)胞清除，從而緩解炎癥[35]。在頸動脈中主要以促炎為主，其升高與急性動脈粥樣硬化血栓性卒中發(fā)病風(fēng)險獨立相關(guān)[36]。Sema7A 缺乏可減少T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的積累，并增強斑塊穩(wěn)定性[37]。最新研究發(fā)現(xiàn)，含Sema7A 基因的高脂飲食小鼠的左頸動脈血流紊亂促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞Sema7A 和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)以及白細(xì)胞黏附和斑塊形成，但是阻斷已知的Sema7A 受體——β1整合素或抑制局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）則顯著降低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和單核細(xì)胞的黏附，表明Sema7A 通過β1整合素依賴性方式介導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)易損斑塊的形成[38]。Song 等[39]將HUVECs 暴露于50μg/ml ox-LDL 來模擬高脂血癥誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，結(jié)果顯示HUVECs 活力顯著降低，IL-1β、IL-6 和趨化因子配體2 等炎癥因子被誘導(dǎo)產(chǎn)生，細(xì)胞黏附因子（cell adhesion molecules-1，CAM-1）和血管細(xì)胞黏附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達(dá)水平顯著上調(diào)，Sema7A 的敲低可以消除上述結(jié)果，然而β1 整合素的過表達(dá)又可以逆轉(zhuǎn)Sema7A 敲低的效果。因此，Sema7A 敲低可以抑制炎癥、細(xì)胞凋亡和內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化，起到一種保護(hù)效果，且該效果可被β1 整合素的過表達(dá)所抵消。內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）在動脈粥樣硬化中是一種常見的變化，Hong 等[40]發(fā)現(xiàn)Sema7A 通過膜受體β1 整合素上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子ATF3，導(dǎo)致TGF-β2 轉(zhuǎn)錄增強和TGF/Smad3 信號通路激活，從而誘導(dǎo)EndMT，加速動脈粥樣硬化的進(jìn)展。因此，Sema7A 和β1 整合素可以作為治療動脈粥樣硬化中內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙的潛在靶點。

4 小結(jié)與展望

頸動脈易損斑塊的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，想要更加精準(zhǔn)地了解斑塊發(fā)生發(fā)展的全過程，仍需在未來繼續(xù)不斷總結(jié)經(jīng)驗及深入探究。迄今為止，對于已經(jīng)明確的可以作為易損斑塊標(biāo)志物的生物分子，大部分可作為心腦血管意外的獨立危險因素，用于預(yù)測發(fā)生心腦血管意外的概率，但目前尚未在臨床上廣泛應(yīng)用。另外，目前臨床上藥物治療動脈粥樣硬化斑塊仍以阿司匹林及他汀類藥物為主，主要起到延緩斑塊進(jìn)展的作用，期望今后可發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，進(jìn)而研發(fā)出逆轉(zhuǎn)斑塊進(jìn)展的新一代靶向治療藥物，減少由動脈粥樣硬化斑塊引起的心腦血管意外。