抗廣譜耐藥細(xì)菌的放線菌篩選及抗菌活性研究

羅健雅 黃紫貝 趙以恒 郭鑫 李蒙 蘇思元 李自盼 徐昀眺 王海燕 劉文博

摘要：目的 篩選對多重耐藥菌具有廣譜抗性的放線菌，發(fā)掘新型抗生素，為人類和動物細(xì)菌性疾病防控提供物質(zhì)儲備。方法 采集江蘇省部分地區(qū)土壤樣品20份，稀釋涂布于改良高氏一號固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化， Chelex-100法提取放線菌基因組DNA，PCR測定16S rRNA基因序列，確定菌屬。應(yīng)用垂直條紋法檢測放線菌對標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床多重耐藥分離菌株的抗菌效果；PCR檢測放線菌抗菌活性和抗生素合成基因之間是否存在相關(guān)性；篩選抗菌活性最強(qiáng)的放線菌，檢測不同時間抗菌物質(zhì)釋放量，測定臨床分離病原菌的抗菌譜；基于16S rRNA基因確定其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；對抑菌活性最好的放線菌進(jìn)行基因組測序，應(yīng)用antiSMASH 在線工具分析次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，預(yù)測其產(chǎn)生新穎次級代謝產(chǎn)物的潛力。結(jié)果 從20份土壤樣品中分離純化237株放線菌，分布于放線菌綱的10個目13個科19個屬，優(yōu)勢菌屬為鏈霉菌屬，占分離總數(shù)的57.8%；抗生素合成基因檢測實驗表明放線菌的抗菌作用與抗生素合成基因的存在可能呈正相關(guān)；抗菌活性最強(qiáng)的鏈霉菌命名為Y94，在第七天產(chǎn)生具有抗菌活性的次級代謝產(chǎn)物最多；Y94產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對臨床分離的238株不同種屬的病原菌均有良好的抗菌效果；對Y94進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明其與甲酸鏈霉菌（Streptomyces formicae）1H-GS9的相似度為95.83%，可能為潛在新種；Y94全基因組中有多種抗生素相關(guān)的次級代謝產(chǎn)物基因簇，有巨大的生物合成潛能。結(jié)論 鏈霉菌Y94株具有抗多重耐藥菌活性，可能屬于1個新的種屬，其抗菌活性物質(zhì)可能是1種新的物質(zhì)，具有潛在的開發(fā)價值。

關(guān)鍵詞：土壤；放線菌；多重耐藥菌；抗菌活性；抗生素合成基因；全基因組

中圖分類號：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Screening and antibacterial activity of Actinomycetes

against broad-spectrum drug-resistant bacteria

Luo Jianya1，2， Huang Zibei1，2， Zhao Yiheng 1，2， Guo Xin1，2， Li Meng 1，2， Su Siyuan1，2，

Li Zipan1，2， Xu Yuntiao1，2， Wang Haiyan3， and Liu Wenbo1，2

（1 College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009; 2 Jiangsu Co-innovation Center for Prevention

and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou University， Yangzhou 225009;

3 Jiangsu Vocational College of Agricultural and Animal Husbandry， Taizhou 225300）

Abstract Objective Screening of positive actinomycetal strains with broad-spectrum resistance to multidrug-resistant bacteria， discovering new antibiotics for the prevention and control of bacterial infections of human-being and animals. Methods Twenty soil samples were collected from some areas in Jiangsu Province. For isolation and purification of actinomycetes， the samples were diluted and plated on the modified GS 1 agar. Chelex-100 was used to extract the genomic DNA from actinomycetal strains， and PCR was used to identify the genus based on the 16S rRNA gene sequence of the purified colonies. The antibacterial activity of actinomycetes was detected using the vertical stripe method with standard strains and isolates in animal clinic. PCR was used to detect the correlation of actinomycetal strains between the antibacterial activity and antibiotic synthesis genes. The actinomycetal strains with the highest antibacterial activity were evaluated， antibacterial substances release were detected in different time after inoculated in liquid medium， and the antibacterial spectrum of clinically isolates were determined; The 16S rRNA genes were used to establish the phylogenetic connection; The genome of the actinomycetal strain with highest antibiotic activity was further sequenced. The secondary metabolite biosynthetic gene clusters were analyzed by antiSMASH. Results 237 actinomycetal strains were obtained from 20 samples of soil， which could be categorized into 10 orders， 13 families， and 19 genera. Most of them were identified as Streptomyces spp. with 57.8% of the total isolates. PCR results showed that the antibacterial activity of actinomycetal strains connected with the presence of antibiotic synthesis genes. The strain of Streptomyces with the highest antibacterial activity to the bacteria tested was designated as Y94. Streptomyces Y94 products had the highest antibacterial activity on the seventh day; The biotics of Y94 against to 238 isolates of pathogenic bacteria from different species of animal collected in our lab. Phylogenetic analysis of Y94 revealed that it was similar to Streptomyces formicae 1H-GS9， with 95.83% homology， suggesting that it might be a new species. There are a number of secondary metabolite gene clusters associated with antibiotics throughout the entire Y94 genome， and these clusters have great potential for biosynthesis. Conclusion Y94 has the activity against multi-drug resistant bacteria， and may belong to a new species. Its antibacterial active substance may be a novel substance， which has potential of development value.

Key words Soil; Actinomycetal strains; Multi-drug resistance bacteria; Whole genome; Antibacterial activity; Antibiotic synthesis genes

細(xì)菌可引起人和動物感染某些疾病，1928年Fleming首次發(fā)現(xiàn)的青霉素從問世以來就開始應(yīng)用于細(xì)菌感染治療，在特定的歷史時期挽救了很多人的生命[1]。此后，各種不同的抗生素被研制出來，并應(yīng)用于人和動物的細(xì)菌感染治療，抗生素在治療人和動物細(xì)菌感染性疾病中發(fā)揮著無法替代的作用，但由于抗生素的誤用和濫用使細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性[2]。近年來，不斷增加和擴(kuò)散的耐藥菌已成為威脅人類和動物健康的一個危險因素，因此研發(fā)新型抗生素顯得尤為重要。

除來源于真菌的青霉素類，頭孢菌素類為真菌產(chǎn)物側(cè)鏈人工改造外，大多數(shù)抗生素來源于放線菌，目前已知的天然藥物中，約有70%是從放線菌中分離得到的，其中75%和60%分別用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)[3]。

放線菌在自然環(huán)境中分布廣泛，尤其是土壤中，是土壤微生物中的一個主要類群，土壤中存在種類豐富的放線菌資源，其中以鏈霉菌屬最為常見[4]。研究表明放線菌產(chǎn)生的抗生素中約有80%的活性物質(zhì)都是由土壤中的鏈霉菌產(chǎn)生的，如鏈霉素、新生霉素等[5]。從土壤中分離具有抑菌活性的放線菌，并通過發(fā)酵使其產(chǎn)生具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物是目前微生物藥品開發(fā)的一個重要途徑[6]。自20世紀(jì)50年代以來，放線菌的研究出現(xiàn)了黃金期，國內(nèi)外學(xué)者和眾多生物公司在此領(lǐng)域進(jìn)行了大量而廣泛的微生物資源發(fā)掘， 90年代以后這種篩選性研究逐漸減少，近幾年，以海洋微生物為代表的放線菌及其活性物質(zhì)篩選又引發(fā)了新一輪的抗生素篩選的熱潮，分離不同來源未知放線菌可以更好地進(jìn)行放線菌及其次級代謝產(chǎn)物的開發(fā)[7]。據(jù)估計，土壤中的放線菌約只分離到10%～20%，其次級代謝產(chǎn)物的研究比例更小，故而對土壤中放線菌的進(jìn)一步挖掘應(yīng)該不懈進(jìn)行。

本研究從江蘇省鹽城市濱?？h和揚(yáng)州市揚(yáng)州大學(xué)校園內(nèi)采集到的土壤中分離純化放線菌并開展一系列放線菌天然產(chǎn)物抗菌活性的探究，為新型抗菌活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)提供新資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品來源

10份土壤樣品于2021年12月采集自江蘇省鹽城市濱海縣，另10份土壤樣品于2022年1月8日采集于江蘇省揚(yáng)州市揚(yáng)州大學(xué)文匯路校區(qū)校園內(nèi)，樣本深度為地表以下15～20 cm，樣品編號及采集地點(diǎn)等詳細(xì)信息見表1。樣品裝入無菌自封袋，運(yùn)回實驗室

4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）分離及純化培養(yǎng)基

改良高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L、KNO3 1 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、MgSO4·7H20 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、FeSO4·7H20 0.01 g/L、瓊脂粉15 g/L。

（2）指示菌培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、瓊脂粉15 g/L；LB液體培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L；產(chǎn)氣莢膜梭菌測定用培養(yǎng)基：多價胨15.0 g/L、大豆胨7.5 g/L、酵母浸粉7.5 g/L、牛肉浸粉7.5 g/L、檸檬酸鐵銨1.0 g/L、偏重亞硫酸鈉1.0 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.75 g/L、瓊脂20.0 g/L；液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：酪胨（胰酶水解）15.0 g/L、酵母浸出粉5.0 g/L、葡萄糖5.0 g/L、硫乙醇酸鈉0.5g/L、L-胱氨酸0.5 g/L、氯化鈉2.5 g/L、刃天青0.001 g/L、瓊脂0.75 g/L。

1.1.3 抑制劑

1 mL 3%重鉻酸鉀/300 mL 培養(yǎng)基，萘啶酮酸40 mg/L，制霉菌素100 mg/L。將抑制劑經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后與滅菌的培養(yǎng)基混合。

1.1.4 試劑及儀器

主要試劑：Premix TaqTM（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye）購自TaKaRa公司，螯合樹脂Chelex 100（50-100 mesh）購自麥克林公司，引物由南京擎科生物科技有限公司合成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

主要儀器：超低溫冰箱（美國Thermo Fisher公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；超純水儀一體機(jī)（美國Millipore科技儀器有限公司）；電熱恒溫金屬?。ㄉ虾１壤蕛x器有限公司）；PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；水平電泳儀、凝膠成像分析儀（北京六一生物科技有限公司）；高壓滅菌鍋（日本Tomykogyo公司）；震蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）。

1.1.5 指示菌

標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC29213、大腸埃希菌（Escherichia coil）ATCC25922由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院王志強(qiáng)老師惠贈；多重耐藥大腸埃希菌（210307-4）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（211226-28）、產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸埃希菌、鴨疫里默桿菌、豬鏈球菌、副乳鏈球菌、鼠傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、沙雷菌、肺炎克雷伯菌、愛德華菌、棉子糖乳球菌、海豚鏈球菌、糞腸球菌、乳酸乳球菌、無乳鏈球菌、白色鏈球菌、溶血葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌、琥珀葡萄球菌、阿爾萊特葡萄球菌、木糖葡萄球菌大多為本實驗室分離保存，部分葡萄球菌菌株由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院王彥紅老師惠贈，鴨疫里默桿菌部分菌株由山東家禽研究所李玉峰研究員惠贈。

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品的處理

隨機(jī)稱取10 g自然風(fēng)干混勻的土壤樣品，研磨，80 ℃烘干1 h，在裝有 90 mL無菌水的250 mL錐形瓶中搖震（170 r/min，28℃） 1 h，取出，10：1連續(xù)稀釋到1000倍，取0.2 mL稀釋液，涂布于改良高氏一號培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)2周。

1.2.2 菌株的分離純化及鑒定

（1）分離純化：挑取單菌落，進(jìn)行編號、純化。

（2）菌株鑒定：Chelex-100法[8]提取放線菌DNA：配置5%（W/V）Chelex-100溶液，115℃高壓滅菌20 min。取適量純化后的放線菌菌體于裝有50 μL Chelex-100溶液的EP管中金屬浴100℃煮沸15 min，12000 r/min離心5 min后取上清液作為PCR模板。16S rRNA基因序列擴(kuò)增的細(xì)菌通用引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'[9]。50 μL PCR反應(yīng)體系為：Premix Taq 25 μL，27F（10 μmol/L）2 μL，1492R（10 μmol/L）2 μL，模板DNA 3 μL，無菌水18 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析儀觀察電泳結(jié)果并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果使用NCBI中BLAST工具將得到的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較[10]，確定菌株的分類學(xué)地位。

1.2.3 放線菌對受試菌株的抗菌活性探究

（1）抗菌活性篩選

以標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌（S.aureus）ATCC29213、大腸埃希菌（E.coil）ATCC25922為指示菌，采用垂直條紋法[11]檢測放線菌的抗菌活性；挑選有抗菌作用的放線菌，篩選對多重耐藥大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有抗菌活性的放線菌。

篩選完后，測量放線菌對受試菌株第2～11天的抑菌圈大小變化，確定最佳抗菌物質(zhì)的釋放時間。

（2）抗生素合成基因的檢測

放線菌DNA提取方法同“1.2.2（2）”，抗生素合成基因包括Ⅰ型聚酮合酶（PKSⅠ）、Ⅱ型聚酮合酶（PKS Ⅱ）和Ⅲ型聚酮合酶（PKSⅢ）KS域基因，非核糖體多肽合成酶（NRPS）A結(jié)構(gòu)域基因以及多烯類化合物合成酶（CYP），引物序列見表2。

（3）放線菌Y94對臨床分離細(xì)菌的耐藥譜探究

臨床分離的革蘭陰性細(xì)菌包括大腸埃希菌、鼠傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、沙雷菌、肺炎克雷伯菌、愛德華菌和鴨疫里默桿菌；臨床分離的革蘭陽性細(xì)菌包括產(chǎn)氣莢膜梭菌、豬鏈球菌、副乳鏈球菌、棉子糖乳球菌、海豚鏈球菌、糞腸球菌、乳酸乳球菌、無乳鏈球菌、白色鏈球菌、溶血葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌、琥珀葡萄球菌、阿爾萊特葡萄球菌、木糖葡萄球菌，其中產(chǎn)氣莢膜梭菌采用產(chǎn)氣莢膜梭菌測定用固體培養(yǎng)基活化以及液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，其余受試菌采用LB固體培養(yǎng)基復(fù)蘇純化和LB液體培養(yǎng)基搖菌。放線菌在固體培養(yǎng)基上圈狀劃線，培養(yǎng)4 d后，用無菌棉簽蘸取產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌懸液，均勻涂布于整塊產(chǎn)氣莢膜梭菌測定用固體培養(yǎng)基上，將平板置于厭氧罐中，其余受試菌涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 基于16S rRNA基因序列的分子鑒定

放線菌Y94的16S rRNA基因序列利用MEGA X軟件采用鄰接法構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹[16]，重復(fù)計算1000次，進(jìn)行自展值分析以評估系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[17]。

1.2.5 放線菌Y94全基因組測序及分析

將菌株Y94單菌落接種至滅菌后的LB液體培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)5～7 d后，收集菌體送測序公司，完成組裝基因組，通過基因預(yù)測、功能元件分析、基因組功能注釋。在antiSMASH （https：//antismash.secondarymetabolites.org）在線網(wǎng)站對次級代謝基因簇進(jìn)行分析，基因簇對應(yīng)產(chǎn)物通過搜索基因或蛋白同源序列進(jìn)行預(yù)測，并根據(jù)基因簇中生物合成基因的構(gòu)成及其編碼酶的催化功能進(jìn)行預(yù)測[18]。

2 結(jié)果

2.1 土壤放線菌的分離結(jié)果

經(jīng)16S rRNA基因序列測定，測序結(jié)果使用NCBI中BLAST工具將測得的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較，本次實驗從土壤中共分離得到237株放線菌，分屬于放線菌綱的10個目14個科21個屬（表3），其中鏈霉菌是優(yōu)勢菌屬，共分離得到137株，占分離總數(shù)的57.8%。

2.2 放線菌抗菌活性篩選

挑選大部分培養(yǎng)生長良好的放線菌進(jìn)行抗菌活性初次篩選，結(jié)果見表4，共檢測了207個放線菌，有37個（17.87%）有抗菌作用，其中9個（24.32%）對大腸埃希菌有抗菌作用，37個（100%）對金黃色葡萄球菌有抗菌作用，這些有抗菌活性的放線菌都是鏈霉菌屬，且對革蘭陽性菌的抗菌作用優(yōu)于對革蘭陰性菌的抗菌作用，其中有9株鏈霉菌有廣譜抗菌作用。

挑選上述37株有抗菌作用的放線菌繼續(xù)篩選對多重耐藥大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌臨床分離株有抗菌作用的菌株，結(jié)果顯示有6株放線菌對大腸埃希菌有抗菌活性，有6株放線菌對金黃色葡萄球菌有抗菌活性，其中有1株對兩株耐藥菌都有顯著的抗菌作用，命名為Y94（表5）。

對Y94的最佳抗菌物質(zhì)釋放時間進(jìn)行檢測，結(jié)果表明從第2～7天抑菌圈逐漸增大，即放線菌釋放的抗菌物質(zhì)逐漸增多，從第7天抑菌圈開始變小，表明放線菌釋放的抗菌物質(zhì)在第7天達(dá)到峰值，之后處于下降趨勢（圖1）。

2.3 抗生素合成基因檢測結(jié)果

選取對耐藥菌株有抗菌活性的放線菌，進(jìn)行抗生素合成基因的檢測。PCR結(jié)果顯示10株鏈霉菌中，Ⅰ型聚酮合酶（PKSⅠ）為陽性的有8株，Ⅱ型聚酮合酶（PKS Ⅱ）KS域基因為陽性的有8株，非核糖體多肽合成酶（NRPS）A結(jié)構(gòu)域基因為陽性的有9株，CSYA基因全為陰性，CSYB基因為陽性的有6株，CSYC基因為陽性的有5株，CSYD基因為陽性的有5株，CYP基因為陽性的有9株（表6）。

2.4 鏈霉菌Y94對臨床分離革蘭陰性和陽性細(xì)菌的抗菌譜結(jié)果

鏈霉菌Y94對臨床分離的238株革蘭陰性和陽性細(xì)菌均有很好的抗菌效果（表7，圖2），由抑菌圈直徑之間的比較可以看出，Y94對革蘭陰性菌的抗菌效果比對革蘭陽性菌稍強(qiáng)，其中對大腸埃希菌的抗菌效果是最明顯的。

2.5 基于16S rRNA基因序列的分子鑒定結(jié)果

鏈霉菌Y94的16S rRNA基因序列（GenBank 登錄號：OP848185）結(jié)果在NCBI上進(jìn)行菌株相似性序列比對搜索，確定菌株的分類學(xué)地位。利用MEGA X軟件采用鄰接法構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。菌株Y94表現(xiàn)出較低的16S rRNA基因序列相似性（＜98.65%，這是區(qū)分兩個物種的閾值[19]），與最相似菌株甲酸鏈霉菌Streptomyces formicae（NCBI：NR146048）的相似度為95.83%，根據(jù)NCBI中的BLAST搜索結(jié)果，表明此菌株可能代表新的分類群。

2.6 鏈霉菌Y94全基因組測序及分析

測序獲得了鏈霉菌Y94的全基因組序列。圖4展示其基因組圈圖，由外到內(nèi)依次為：第一圈，基因組序列信息；第二圈，基因組序列的GC skew曲線；第三圈，基因組序列的GC含量曲線。鏈霉菌Y94的基因組大小約為8.14 Mbp，G+C含量為71.1%。

在KEGG數(shù)據(jù)庫中對這些CDS（編碼序列）進(jìn)行功能注釋，如圖5所示，與代謝相關(guān)的CDS有2793個，包括氨基糖和核苷酸糖代謝相關(guān)CDS有1600個，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝相關(guān)的CDS有1089個，磷酸肌醇代謝的相關(guān)CDS有100個；與鏈霉素的生物合成相關(guān)的CDS有81個；與萜類化合物生物合成相關(guān)的CDS有169個，泛酸和CoA合成相關(guān)的CDS有196個。

通過antiSMASH（https：//antismash.secondarymetabolites.org）在線網(wǎng)站對鏈霉菌Y94基因組的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇類型分析，結(jié)果見表8。

鏈霉菌Y94基因組中存在33個潛在的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇，負(fù)責(zé)合成的次級代謝產(chǎn)物主要類型有：NRP（非核糖體多肽）、PK（聚酮類）、terpene（萜類）、RiPP（肽類）和PKS-NRPS雜合型。其中Cluster 8與terpene的相似度為7%，Cluster 9、13、14、20、31與NRP相似度分別為5%、6%、3%、4%和9%，Cluster 12、18、26與的RiPP相似度分別為6%、6%和7%，均低于10%，即表示Y94的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇都有可能產(chǎn)生新的次級代謝產(chǎn)物。

3 討論

自然界是各種產(chǎn)天然活性物質(zhì)和微生物的重要儲庫[20]，放線菌是生物活性物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物的主要來源，也是各種生物活性化合物的重要來源[21]，分布在所有生態(tài)棲息地，如土壤、淡水、湖泊、堆肥、污水和海洋環(huán)境中[22]，尤其在土壤中含量豐富。土壤中的放線菌優(yōu)勢菌屬為鏈霉菌屬，且鏈霉菌是產(chǎn)生抗生素活性物質(zhì)的最多的一類放線菌，迄今已知的抗生素中，有51%是由鏈霉菌產(chǎn)生的[23]。放線菌是農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)抗生素產(chǎn)生菌的重要分離資源和種質(zhì)資源庫，對于發(fā)展畜牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)有著重要的研究價值和應(yīng)用前景[24]。葉景靜等[25]在廣西茅尾海紅樹林植物根際土壤中發(fā)現(xiàn)放線菌共88株，有6目8科9屬；羅亞軍等[26]在西藏沙棘根瘤及根際土壤中分離放線菌共112株，有7目12科23屬。本研究篩選了20份土壤樣本，共分離純化得到了237株放線菌，分布于放線菌綱的10個目13個科19個屬，其中鏈霉菌屬是土壤放線菌的優(yōu)勢菌屬，表明土壤放線菌具有類群和數(shù)量多樣性。

羅亞軍等[26]對西藏沙棘根瘤及根際土壤放線菌進(jìn)行抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，有17株放線菌至少對1種受試菌株有抗菌活性；潘文娟等[27]對西藏湖泊放線菌進(jìn)行抗菌活性測定發(fā)現(xiàn)，有55株放線菌至少對1種受試菌株有抗菌活性，這表明放線菌能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，抑制病原菌生長。本研究通過以標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株為受試菌株，對207株放線菌的抗菌活性進(jìn)行兩輪篩選，發(fā)現(xiàn)有37株放線菌至少對1種受試菌株有抗菌作用，其中有1株鏈霉菌對標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株均有顯著的抗菌作用，即鏈霉菌Y94。對鏈霉菌Y94最佳抗菌物質(zhì)釋放時間的測定表明在第7天時釋放的抗菌物質(zhì)最多，對后續(xù)次級代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)解析的發(fā)酵時間具有指導(dǎo)意義。抗菌譜測定的結(jié)果表明鏈霉菌Y94產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)對臨床分離到的多種病原菌均有很好的抗菌作用， Y94對革蘭陰性菌的抗菌作用優(yōu)于對革蘭陽性菌，從對革蘭陰性菌的抗菌效果來看，其對大腸埃希菌的抗菌效果最顯著，但其對銅綠假單胞菌和鴨疫里默桿菌的抗菌效果較差；從對革蘭陽性菌的抗菌效果可以得出Y94對厭氧菌的抗菌效果低于對需氧菌的抗菌效果，由此可以得出抗菌活性物質(zhì)的釋放可能與氧氣的存在有關(guān)。通過16S rRNA鑒定，與最相似菌株甲酸鏈霉菌（Streptomyces formicae）1H-GS9的相似度為95.83%，其可能為潛在新種，說明這株鏈霉菌值得深入開發(fā)和研究，由此可以得出土壤中仍存在具有進(jìn)一步研究開發(fā)價值的重要放線菌資源。

本研究通過對篩選出的可抑制耐藥菌株的10株鏈霉菌進(jìn)行抗生素合成基因檢測發(fā)現(xiàn)10株鏈霉菌中，除CSYA基因均為陰性以外，其余基因均為陽性的有4株，分別是B65、B77-2、B112和Y103，與上述抗菌活性篩選的結(jié)果有高度的吻合度，表明抗生素合成基因可能與放線菌的抗菌活性呈正相關(guān)，但為何抗菌能力最強(qiáng)的Y94卻不含所有檢測的抗生素合成基因，需要進(jìn)一步探究。

放線菌通常具有較大的基因組，并擁有許多編碼多功能生物合成酶的生物合成基因簇[28-29]，因而具有多種生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)[30]。本研究通過對Y94全基因組序列和次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇分析發(fā)現(xiàn)，該菌含有豐富的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，負(fù)責(zé)合成的次級代謝產(chǎn)物主要類型有：NRP、PK、terpene、RiPP和PKS-NRPS雜合型。其中NRP類基因簇中的Cluster 10與具有抗氧化物質(zhì)paenibactin合成基因簇相似度為83%，文艷蘋等[31]對其進(jìn)行了相關(guān)研究報道；PK類基因簇中的Cluster 24與具有抗細(xì)菌和抗腫瘤活性的抗生素柯林霉素（collinomycin）[32-33]合成基因簇相似度為96%，并且Cluster 8與具有抗細(xì)菌活性的抗生素萘啶霉素（napyradiomycin）合成基因簇相似度為7%；terpene類基因簇中Cluster 23與具有半萜化合物土味素（geosmin）合成基因簇相似度為100%，以及Cluster 27與具有肽類抗生素cypemycin合成基因簇相似度為22%，Komiyama K等[34]對其進(jìn)行了相關(guān)研究報道；RiPP-like類基因簇中的Cluster 26與系統(tǒng)抑制劑瓜地諾明（Guadinimine）合成基因簇相似度為7%，Masato等[35]對其進(jìn)行了相關(guān)研究報道。上述結(jié)果說明鏈霉菌Y94可能具有產(chǎn)生類似結(jié)構(gòu)的新型活性物質(zhì)的潛力，因此，進(jìn)一步深入研究該類菌株的次級代謝產(chǎn)物，有望發(fā)現(xiàn)具有重要生物活性的新型次級代謝產(chǎn)物，為從土壤里發(fā)現(xiàn)新的藥物或生物防治劑的研發(fā)提供新的資源。

日益增多的耐藥菌株的出現(xiàn)導(dǎo)致現(xiàn)有抗生素抗菌效果的降低，本研究為研發(fā)新型抗生素奠定基礎(chǔ)，研究結(jié)果顯示土壤中具有豐富多樣的放線菌資源，值得深入挖掘。鏈霉菌Y94具有廣譜的抗菌活性且對多重耐藥菌株亦有良好的抗菌能力，在16S rRNA的序列對比中發(fā)現(xiàn)Y94可能為潛在新種，通過對次級代謝產(chǎn)物的預(yù)測發(fā)現(xiàn)其含有多種與抗生素相關(guān)的基因簇，某些基因簇所預(yù)測抗生素的相似度低于10%，且有幾個基因簇未匹配到同源基因簇，這些結(jié)果表明Y94有產(chǎn)生新抗生素的潛力。在抗生素合成基因檢測實驗中， Y94在未含有全部抗生素合成基因的條件下仍表現(xiàn)出最顯著的抗菌活性，通過菌株改造使Y94含有未檢測到的抗生素合成基因是否會造成其抗菌活性的提高值得深入探索，在后續(xù)的研究中，進(jìn)一步研究Y94產(chǎn)生抗菌活性的物質(zhì)，揭示其次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)組成，通過基因組學(xué)對活性物質(zhì)進(jìn)行反向研究，力求從中發(fā)現(xiàn)具有較好應(yīng)用價值的新型活性物質(zhì)，為新藥的開發(fā)提供有力的依據(jù)。

致謝：感謝在實驗過程中提供菌種的揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院王志強(qiáng)老師、劉源老師、王彥紅老師和山東農(nóng)科院家禽研究所李玉峰研究員。

參 考 文 獻(xiàn)

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