豬流行性腹瀉病毒TaqMan檢測(cè)方法的建立及基于S基因的遺傳變異分析

翟 剛，顧文源，劉 濤，劉 瑩，張 帥，范京惠*，左玉柱*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071001； 2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，保定 071001；3.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，石家莊 050000； 4.瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，保定 071001)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一種急性、傳染性強(qiáng)的腸道疾病[1-2]?？蓪?dǎo)致豬產(chǎn)生腹瀉、嘔吐、厭食和脫水等臨床癥狀，仔豬感染該病后的死亡率極高[3-4]；此外，該病具有接觸傳播的特性，可以通過(guò)污染的水、飼料等途徑進(jìn)行傳播，這就限制了豬以及副產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易[3，5-6]。因此，該病毒嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，研發(fā)快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)，制定正確的防控策略是極為重要的。PED最早于1971年出現(xiàn)在英國(guó)，隨后于1978年首次分離該病毒株，并命名為CV777[7-8]。此后在日本、韓國(guó)和泰國(guó)等國(guó)家相繼發(fā)現(xiàn)PEDV，在2010年以前，PEDV呈零星分布。2010年至今，PEDV變異毒株呈現(xiàn)出致病性更強(qiáng)、流行范圍更廣的特點(diǎn)，這就給PEDV的防控帶來(lái)了更大的壓力[3，9-10]。

PEDV為帶囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于甲型冠狀病毒屬，其基因組全長(zhǎng)約為28 kb，共含有7個(gè)開(kāi)發(fā)閱讀框，分別編碼ORF1a、ORF1b、Spike(S)、ORF3、envelope(E)、membrane(M)、nucleoprotein(N)[9，11-13]。其中，S蛋白為PEDV的纖突蛋白，是病毒表面的最大結(jié)構(gòu)蛋白，含有多個(gè)中和表位，是其主要的抗原蛋白，在病毒入侵宿主細(xì)胞和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體等方面發(fā)揮著重要的作用。編碼S蛋白的S基因是PEDV的重要毒力基因，該基因的堿基突變、插入和缺失會(huì)造成PEDV毒力的增強(qiáng)或減弱。該基因還是PEDV分型的重要依據(jù)。因此，深入研究S基因的結(jié)構(gòu)以及生物特性有助于掌握PEDV的遺傳變異規(guī)律。目前有多種PEDV的檢測(cè)方法，狄亞心等[14]建立了RT-LAMP檢測(cè)方法，李飛等[15]建立了SYBR Green Ⅰ qPCR檢測(cè)方法，但均存在耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性差等問(wèn)題。因此，在PEDV的防控方面，建立一種特異性強(qiáng)、敏感性高、耗時(shí)短的TaqMan qPCR檢測(cè)方法，優(yōu)先對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行PEDV的快速全面篩查，再對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行S基因擴(kuò)增分析，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)豬場(chǎng)不同流行毒株的檢測(cè)，在PEDV病原診斷和基因結(jié)構(gòu)分析等方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。

本研究根據(jù)GenBank登錄的PEDV毒株AJ1102的M基因保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)熒光引物和探針，建立了一種敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的TaqMan qPCR檢測(cè)方法，并對(duì)檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行S基因擴(kuò)增。本研究不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)PEDV不同毒株的檢測(cè)和病毒拷貝數(shù)準(zhǔn)確定量、還為豬場(chǎng)預(yù)防和控制PED的發(fā)生及傳播提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料的采集與處理

2021—2022年，自河北省規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)采集疑似PED腹瀉樣品(糞便或小腸內(nèi)容物)。豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、傳染型胃腸炎病毒(TGEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)以及豬丁型冠狀病毒(PDCoV)均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備；Fast TaqMan Mixture購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司；豬流行性腹瀉病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自國(guó)測(cè)生物；pMD19-T載體、DL2000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考GenBank上登錄的PEDV毒株AJ1102的M基因保守序列應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性熒光引物PEDV-F/R和探針PEDV-P以及PEDVS全基因擴(kuò)增引物PEDVS-F/R(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PEDV的引物及探針

1.4 qPCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備及檢測(cè)方法的建立

用PEDV引物PEDV-M-F和PEDV-M-R擴(kuò)增從PEDV樣品中提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為陽(yáng)性后，對(duì)其進(jìn)行回收純化，隨后將產(chǎn)物與pMD19-T載體經(jīng)連接轉(zhuǎn)化、菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的樣品送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。提取鑒定為PEDV陽(yáng)性菌質(zhì)粒作為qPCR標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)Nanodrop 2000測(cè)定質(zhì)粒濃度，換算為質(zhì)?？截悢?shù)。

對(duì)反應(yīng)條件的不同變量進(jìn)行優(yōu)化；將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍的倍比稀釋，選取9個(gè)不同的濃度(1.09×109～1.09×101拷貝·μL-1)作為模板在最優(yōu)反應(yīng)條件下進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以Cq值為縱坐標(biāo)，模板濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果利用Bio-Rad軟件分析后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 特異性試驗(yàn)

用DNA/RNA提取試劑盒提取PCV2、PRV樣品的DNA，TGEV、PRRSV、CSFV及PDCoV樣品提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，采用上述優(yōu)化好的方法進(jìn)行qPCR，檢驗(yàn)該方法的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋作為模板在最優(yōu)反應(yīng)條件下進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，同時(shí)利用普通PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)兩種檢測(cè)方法得到的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比來(lái)驗(yàn)證本方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

選取經(jīng)10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，應(yīng)用建立的方法進(jìn)行組內(nèi)試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)3次；在不同的時(shí)間對(duì)上述選取的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組間試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)3次，根據(jù)每個(gè)濃度的Cq值計(jì)算組內(nèi)和組間的變異系數(shù)(CV)。

1.8 臨床樣品檢測(cè)

將本實(shí)驗(yàn)室采集的54份仔豬腹瀉疑似樣品提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用建立的qPCR檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)采用豬流行性腹瀉病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)，比較二者的檢測(cè)結(jié)果。

1.9 S全基因的擴(kuò)增及序列分析

將通過(guò)qPCR檢測(cè)為PEDV陽(yáng)性的樣品進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為陽(yáng)性后，對(duì)其進(jìn)行回收純化，隨后將產(chǎn)物與pMD19-T載體經(jīng)連接轉(zhuǎn)化、菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的樣品送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

從NCBI GenBank上選取具有代表性的毒株35條，用MEGA7.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，用DNAStar7.0軟件進(jìn)行氨基酸序列分析。

2 結(jié) 果

2.1 PEDV標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建及qPCR檢測(cè)方法的建立

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD19T-PEDV作為模板，用合成的PEDV-F/PEDV-R進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，得到目的條帶大小為124 bp，膠回收送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，結(jié)果均與預(yù)期一致，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19T-PEDV標(biāo)準(zhǔn)品。通過(guò)Nanodrop 2000測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，換算成拷貝數(shù)為1.09×1010拷貝·μL-1。

經(jīng)過(guò)優(yōu)化后最終確定qPCR反應(yīng)體系為25 μL，含引物各1 μL，探針0.5 μL，2×Fast Probe Mixture 12.5 μL，RNase-Free ddH2O 7 μL及模板3 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s；53 ℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束收集熒光信號(hào)。

采用優(yōu)化后的qPCR方法對(duì)重組質(zhì)粒pMD19T-PEDV標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度在1.09×109～1.09×101拷貝·μL-1時(shí)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程式為y=-3.8x+40.23，擴(kuò)增效率R2為99.8%，結(jié)果成立，可以對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。

1～9.不同稀釋度的重組質(zhì)粒pMD19T-PEDV(1.09×109～1.09×101拷貝·μL-1)

2.2 特異性試驗(yàn)

利用qPCR方法對(duì)PEDV、PCV2、PCV3、TGEV、PRV、PRRSV、PDcoV及CSFV的核酸進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)對(duì)照。結(jié)果顯示，僅PEDV為陽(yáng)性，而其它病原均為陰性，表明本方法具有良好的特異性。

2.3 敏感性試驗(yàn)

利用qPCR方法對(duì)10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用普通PCR方法擴(kuò)增檢驗(yàn)其敏感性。結(jié)果顯示，該方法對(duì)PEDV檢測(cè)出的最低拷貝數(shù)為1.09×101拷貝·μL-1，而普通PCR方法的最低拷貝數(shù)為1.09×103拷貝·μL-1，表明本研究建立的TaqMan qPCR檢測(cè)方法具有較高的敏感性。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

將PEDV的標(biāo)準(zhǔn)品pMD19T-PEDV(1.09×107、1.09×104、1.09×102拷貝·μL-1)作為模板，采用建立的qPCR方法進(jìn)行組內(nèi)及組間的重復(fù)性試驗(yàn)，組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于1%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.5 臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用本研究建立的qPCR對(duì)來(lái)自河北省不同地區(qū)采集的54份疑似PED樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，陽(yáng)性率為27.8%(15/54)，與豬流行性腹瀉病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為100%，并隨機(jī)挑取3份陽(yáng)性樣品，經(jīng)測(cè)序鑒定后，證實(shí)為PEDV，表明此次建立的方法可用于PEDV的流行病學(xué)調(diào)查。

2.6 PEDV S全基因擴(kuò)增

將檢測(cè)為PEDV的樣品應(yīng)用普通PCR方法對(duì)其進(jìn)行S全基因的分段擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定，結(jié)果顯示，出現(xiàn)與預(yù)期片段大小符合的條帶，隨后測(cè)序及拼接。將獲得的S基因上傳至NCBI GenBank中，登錄號(hào)為OL870433～OL870436、OL841533～OL841538。

2.7 PEDV S基因遺傳進(jìn)化分析及序列分析

為了解本研究的9株P(guān)EDV的遺傳特性，利用MegAlign軟件，將從NCBI公布的典型序列中選取35株P(guān)EDV毒株基因組序列與本研究得到的S基因進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)獲取的9株毒株序列之間的核苷酸相似性為96.6%～99.1%，氨基酸的相似性為94.6%～98.7%；與參考株的核苷酸相似性為92.6%～99.3%，其中，與CHGD-01及BJ2011-1的親緣關(guān)系較近，核苷酸相似性為98.3%～99.3%，氨基酸相似性為95.6%～98.9%。與CV777等經(jīng)典毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，核苷酸相似性為92.6%～94.4%，氨基酸相似性為91.3%～93.8%；與近幾年我國(guó)的流行毒株核苷酸的相似性為96.5%～99.3%。

應(yīng)用Mega 7.0軟件，將本研究分離得到的9條S全基因序列及從NCBI上參考的35條S全基因進(jìn)行分析建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，進(jìn)化樹分為GⅠ和GⅡ大群，GⅠ和GⅡ分別分為GⅠa、GⅠb、GⅡa及GⅡb(圖2)。結(jié)果顯示，分離得到的9株P(guān)EDV毒株全部位于GⅡ群上。其中，CH/HB/BD01、CH/HB/BD02、CH/HB/BD03、CH/HB/CZ02、CH/HB/XT01、CH/HB/HD01、CH/HB/HD02與CHGDGZ和CHGD-01、GJL位于同一分支，屬于GⅡa亞群；CH/HB/ZJK01和CH/HB/ZJK02分別與BJ2011-1、AH2012處于同一分支，屬于GⅡb亞群。因此可以得出，本研究得到9條S基因的毒株為變異毒株，表明目前主要的流行毒株為變異毒株。

圖2 PEDV S基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹

利用MegAlign軟件，將得到的S基因與PEDV變異毒株BJ-2011-1進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9株S基因序列存在多處突變，處于GⅡb分支上的突變位點(diǎn)較多，為21～24處；分布于GⅡa分支上的毒株與CV777相似突變位點(diǎn)較多，共有11個(gè)。其中，CHHBBD02、CHHBBD03、CHHBCZ02、CHHBHD02、CHHBZJK01及CHHBZJK02存在1個(gè)氨基酸的插入。

3 討 論

PED是養(yǎng)豬業(yè)常見(jiàn)的疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[16]。為了降低PED的發(fā)病率，人們通過(guò)接種疫苗的方法來(lái)防控PEDV，取得了一定的成效。然而，由于PEDV不斷的變異，從而導(dǎo)致原有疫苗的保護(hù)力逐漸降低甚至失效，使得防控的難度逐漸加重[17-18]。在臨床上，由于PEDV與PDCoV、TGEV等病毒引起的癥狀和病理變化相似性高，臨床不能通過(guò)臨床癥狀和病理變化作出準(zhǔn)確的診斷。因此，建立一種快速、精準(zhǔn)及敏感性高的診斷方法是極為重要的。目前，已有多種常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷方法應(yīng)用于PEDV的臨床檢測(cè)。但是，ELISA相較于TaqMan qPCR的方法具有靈敏度較低、成本高等缺點(diǎn)[19]；普通PCR具有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度相對(duì)較低的缺點(diǎn)[20]；IFA、免疫組化及電鏡等檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于儀器及人員的要求較高[21-22]，且無(wú)法滿足大批量的臨床診斷。相較于以上幾種方法，qPCR不僅具有操作簡(jiǎn)便、成本低的優(yōu)點(diǎn)，而且檢測(cè)時(shí)間短，可適用于基層的臨床檢測(cè)。在PEDV的分子研究機(jī)制上，監(jiān)測(cè)PEDV毒力基因的變化對(duì)PED的防控可提供重要的理論依據(jù)。

本研究建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的TaqMan qPCR檢測(cè)方法。可實(shí)現(xiàn)在臨床中對(duì)PEDV 的全面篩查。S蛋白是PEDV的關(guān)鍵毒力蛋白，其氨基酸的序列決定了蛋白的可塑性，該蛋白含有多個(gè)B細(xì)胞表位和抗體結(jié)合域，對(duì)病毒與抗體和免疫細(xì)胞的結(jié)合發(fā)揮著重要作用，其基因結(jié)構(gòu)的改變可以對(duì)PEDV的毒力等生物特性產(chǎn)生巨大的影響[23-24]。依據(jù)本方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室從河北省在2021―2022年不同地區(qū)收集的腹瀉樣品進(jìn)行篩查，將篩查出來(lái)的陽(yáng)性樣品進(jìn)行S全基因的克隆，并進(jìn)行S基因的遺傳進(jìn)化分析，從而了解當(dāng)前流行毒株的基因結(jié)構(gòu)，掌握其遺傳變異規(guī)律。結(jié)果顯示，克隆的9條S基因均位于GⅡ群的不同分支，與疫苗株CV777的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中，CHHBBD01、CHHBBD02、CHHBBD03、CHHBHD01、CHHBHD02、CHHBCZ02和CHHBXT01與CHGD-01氨基酸序列的相似性最高為93.5%～97.6%，位于GⅡ-a分支；而CHHBZJK01和CHHBZJK02則與BJ-2011-1氨基酸的相似性最高為97.9%～98.9%，位于GⅡ-b分支。結(jié)果表明，目前，河北省PEDV的流行毒株與常規(guī)疫苗具有較大的差異。PEDV的S蛋白含有4個(gè)主要的中和表位區(qū)(499―639、748―755、764―771及1 368―1 374 aa)，其中，499―639 aa為COE抗原區(qū)，該區(qū)的突變會(huì)對(duì)PEDV的毒力及抗原性產(chǎn)生很大的改變[25]。本研究通過(guò)對(duì)得到的9株P(guān)EDV S蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，9株序列的氨基酸相似性為94.6%～98.7%，S蛋白氨基酸與國(guó)內(nèi)流行毒株相比，均發(fā)生多處突變，并且部分突變與疫苗株CV777相同。此外，將9株S蛋白的氨基酸與GenBank登錄的35條序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增的9株S蛋白均含有多處特異性突變，這些突變與PEDV的毒力的關(guān)系暫未研究。結(jié)果表明，在河北省部分地區(qū)毒株的抗原性等生物學(xué)功能可能已經(jīng)產(chǎn)生變化。

4 結(jié) 論

建立了一種快速檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的通用型TaqMan qPCR檢測(cè)方法，并對(duì)2021―2022年河北省不同地區(qū)采集的54份疑似PED樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)出PEDV的樣品進(jìn)行S基因的擴(kuò)增和測(cè)序，從序列的相似性分析和遺傳進(jìn)化研究?jī)蓚€(gè)方面得出河北省PEDV流行毒株分布在GⅡ群中的兩個(gè)進(jìn)化分支，且氨基酸序列發(fā)生多處特異性突變。