豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A與Beclin1相互作用并促進(jìn)病毒增殖

張成成，孫嘉豪，王秀玲，張小榮，吳艷濤

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

豬瘟(classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一種傳染性極強(qiáng)且臨床以高熱、出血和免疫抑制為表征的烈性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。CSFV屬于黃病毒科、瘟病毒屬，其直徑為40～60 nm，基因組大小約為12.5 kb[2]。CSFV編碼產(chǎn)生4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(Core、Erns、E1和E2)和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[3]。CSFV NS5A是一種多功能的磷酸化蛋白，包括497個(gè)氨基酸，定位于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，具有參與病毒復(fù)制和調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞信號(hào)通路的作用，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)新陳代謝、細(xì)胞內(nèi)mRNA翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定表達(dá)、血管生成和通透性以及胞內(nèi)蛋白折疊等[4-5]。NS5A與鳥苷酸結(jié)合蛋白1互作抑制GTPase活性，進(jìn)而影響豬瘟病毒的早期復(fù)制[6]。Rab1A作為CSFV組裝所必須的蛋白與NS5A存在協(xié)同作用，促進(jìn)病毒粒子的組裝；缺失則導(dǎo)致CSFV的毒力下降[7]。NS5A在細(xì)胞內(nèi)的分布經(jīng)由Rab18的調(diào)節(jié)，其復(fù)合物參與CSFV RNA復(fù)制和病毒粒子組裝[8]。NS5A一方面與熱休克蛋白Hsp27相互作用進(jìn)而負(fù)調(diào)控病毒復(fù)制[9]；另一方面與熱休克蛋白HSP70共定位于細(xì)胞質(zhì)中，其N端氨基酸(29～240)與HSP70結(jié)合形成的復(fù)合物促進(jìn)CSFV的復(fù)制[10]。此外，HSP90AB1/HSPCB與NS5A也存在相互作用[11]。GRP78與NS5A相互作用，在激活細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)中扮演重要角色，促進(jìn)豬瘟病毒的復(fù)制[12]。NS5A能與ARFGAP互作促進(jìn)CSFV復(fù)制，另一方面NS5A誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可經(jīng)由ARFGAP降低[13]。

研究表明，豬瘟病毒通過激活宿主細(xì)胞自噬促進(jìn)其增殖[14-15]。自噬作為細(xì)胞程序性死亡的一種方式，表現(xiàn)為將宿主細(xì)胞中受損蛋白質(zhì)及損傷、衰老的細(xì)胞器進(jìn)行批量降解，而后循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)代謝平衡、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)生物體正常生長(zhǎng)發(fā)育和分化[16-17]。自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62/SQSTM1及LC3等，在試驗(yàn)中經(jīng)常被用作自噬的標(biāo)記物[18]。這些基因通常介導(dǎo)自噬小體的形成，并與溶酶體結(jié)合[19]。自噬相關(guān)基因按其功能分類可分為誘導(dǎo)自噬，囊泡成核、延伸、形成和再循環(huán)的自噬過程，以及針對(duì)修飾蛋白或受損細(xì)胞器的選擇性自噬降解[20]。Beclin1因其24.4%的氨基酸序列與酵母自噬蛋白Atg6相同，成為第一個(gè)被證實(shí)的正向調(diào)節(jié)自噬的哺乳動(dòng)物基因之一[21]。Beclin1在PI3K激酶ClassⅢ復(fù)合物中扮演核心角色，該復(fù)合物由Vps34、Vps15、Beclin1三個(gè)主要亞基組成，作為自噬起始的復(fù)合物，其在自噬小體的形成中不可或缺[22]。目前已知Beclin1參與調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路，包括PI3K-AKT-mTOR、AMPK、JNK及MAPK等通路[23]。研究表明，Beclin1在宿主感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)引起的慢性肝炎病例中起到抑制病毒增殖作用[24]。在Fu等[25]的研究中，Beclin1等自噬相關(guān)基因表達(dá)增加可通過調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)病毒增殖。經(jīng)研究HCV NS5A通過活化蛋白C激酶1受體受體與III類PI3K復(fù)合物相互作用[26]。

但Beclin1蛋白在CSFV誘發(fā)宿主細(xì)胞發(fā)生自噬的過程中是否發(fā)揮作用及其作用機(jī)制，還未見研究報(bào)道。本研究旨在探究宿主蛋白Beclin1在CSFV NS5A激活細(xì)胞自噬反應(yīng)過程中所發(fā)揮的影響。研究結(jié)果表明，Beclin1蛋白促進(jìn)CSFV增殖的機(jī)制是通過與CSFV NS5A的相互作用調(diào)控PI3K/Akt通路來實(shí)現(xiàn)，為豬瘟的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 豬瘟病毒CSFV Shimen株，豬腎細(xì)胞系(ST)和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)由本實(shí)驗(yàn)室保存。真核表達(dá)載體pDsRed1-N1購(gòu)自Clontech公司，pcDNATM3.1(+)購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、TMB顯色液、T4 DNA連接酶均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自LONSERA公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ購(gòu)自NEB公司；超純RNA提取試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒及AxyPrep質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒均購(gòu)自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EasyTaq?DNAPolymerase、瓊脂糖等均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；AceQ qPCR Probe Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DL2000 Marker，DL10000 Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；青霉素/鏈霉素/兩性霉素B溶液(無菌)購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀及實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，杭州博日科技有限公司；電泳儀、泳凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司；倒置熒光光顯微鏡，Olympus Corporation公司；倒置光學(xué)顯微鏡，Leica儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在無菌離心管中加入5 mL DMEM培養(yǎng)液備用，從液氮罐中取出凍存的ST細(xì)胞迅速放入37 ℃水浴中溶化至冰水混合狀態(tài)，輕輕吹打數(shù)次轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的離心管中，1 000 r·min-1室溫離心2 min，將沉淀轉(zhuǎn)入含有10%FBS的DMEM中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24～48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，在細(xì)胞呈現(xiàn)單層生長(zhǎng)時(shí)傳代。棄去培養(yǎng)液，PBS緩慢清洗2～3次，加入胰蛋白酶消化2～3 min，當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)大部分脫落后加入血清終止消化，反復(fù)吹打至細(xì)胞成單個(gè)，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè)方法 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的豬源細(xì)胞，在其匯集度在70%左右時(shí)更換DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基；接種1個(gè)moi量的CSFV，吸附1 h后，更換含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基作用6、12、24、36、48 h后收集細(xì)胞。參照江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒的說明書的步驟提取總RNA，提取完成后將之反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：5×TranScript?RT Buffer 2 μL，TranScript?RT 0.5 μL，RI 0.25 μL，dNTPs 2 μL，6 nt 1 μL，Total mRNA 4.25 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的Susscrofa的Beclin1、Vps34、Vps15、ATG14L、UVRAG的基因序列進(jìn)行綜合分析，設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的上、下游引物，送交南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋為100 ng·μL-1，按照SYBR Green PCR MasterMix操作說明，利用上述合成的熒光定量引物分別對(duì)CSFV感染細(xì)胞中Beclin1、Vps34、Vps15、ATG14L、UVRAGmRNA水平進(jìn)行相對(duì)熒光定量，RT-PCR反應(yīng)體系：2×AceQ?qPCR SYBR GREEN Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，dd H2O 補(bǔ)齊至20 μL。每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；98 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 取獲得的ST細(xì)胞的cDNA，使用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增帶有不同酶切位點(diǎn)的Beclin1基因的片段。通過BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ等酶作用進(jìn)行雙酶切后與相應(yīng)載體連接分別克隆至對(duì)應(yīng)載體用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 Western blot 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核蛋白的提取參照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒說明書的步驟進(jìn)行：收集CSFV感染6、12、24、36、48 h的ST細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗后，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心2～3 min，棄上清留沉淀備用。將新鮮配制的200 μL RIPA(含2 μL 100×PMSF)裂解液裂解蛋白，冰上裂解10～15 min，將充分裂解的蛋白于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，讓細(xì)胞碎片沉入EP管底，吸取含有蛋白的上清至新的預(yù)冷的EP管里，抽取適量的上清利用BCA法測(cè)定蛋白濃度。剩余的上清蛋白液中加入一定量的5×SDS PAGE Loading buffer，金屬浴100 ℃10 min使蛋白質(zhì)變性。依據(jù)所測(cè)目的蛋白大小配制對(duì)應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠，電泳恒壓120 V 90 min，完畢后冰上轉(zhuǎn)印至PVDV膜上，電泳恒流120 mA 90 min，然后采用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；TBST緩沖液洗膜2～3次，每次5 min；4 ℃過夜孵育一抗；TBST緩沖液漂洗3次，每次5 min；加入二抗室溫孵育2 h，TBST緩沖液漂洗3次，每次15 min。將清洗干凈的PVDV膜置于ECL發(fā)光成像儀中顯影照相，分析結(jié)果并保存。

1.2.5 免疫共沉淀 將NS5A-Flag和Beclin1-Myc重組載體共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，用RIPA(含1% 100×PMSF)裂解液裂解蛋白，冰上裂解10～15 min。根據(jù)Thermo ScientificTMPierceTMc-Myc Tag co-IP說明書，將裂解所獲蛋白液與抗c-Myc或抗Flag瓊脂糖親和凝膠進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)。簡(jiǎn)要步驟如下：將200 μL細(xì)胞裂解液與10 μL瓊脂糖漿混合，并使用150 μL TBS(25 mmol·L-1Tris鹽酸，0.15 mol·L-1氯化鈉，pH7.2)稀釋的50 μL陽(yáng)性對(duì)照作為陽(yáng)性對(duì)照，在4 ℃下孵育過夜。免疫沉淀用TBST洗滌3次，并在2×非還原樣品緩沖液中重懸。煮沸5 min后，在樣品中加入2 μL的2-ME，用特異性抗體進(jìn)行免疫印跡分析。

1.2.6 GST-pulldown 按照GST-Pulldown說明書，IPTG誘導(dǎo)BL21原核表達(dá)pEGX-6p-1-Beclin1和pEGX-6p-1空載體；用預(yù)冷的200 μL TBS重懸菌體，離心后加入200 μL Pulldown裂解液，冰上裂解30 min，離心收集上清；將上清液與GST瓊脂糖珠孵育2 h，離心收集GST-p17-瓊脂糖復(fù)合沉淀物；收集已在真核細(xì)胞中表達(dá)的NS5A-Flag細(xì)胞蛋白，加入適量pulldown裂解液，冰上裂解30 min，離心收集上清(含NS5A-Flag蛋白)；將收集的NS5A-Flag上清液和GST-Beclin1瓊脂糖復(fù)合物中孵育過夜；離心棄上清，得到Beclin1-NS5A結(jié)合復(fù)合在此復(fù)合物中加入EB洗液(含谷胱甘肽)，離心吸取40 μL上清，加入10 μL 5×蛋白上樣緩沖液，通過Western blot檢測(cè)目的蛋白。

1.2.7 激光共聚焦顯微鏡方法 將細(xì)胞爬片置于75%乙醇中消毒15 min后放入24孔板中，在24孔板內(nèi)接種ST細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時(shí)，將重組質(zhì)粒Beclin1-Myc和NS5A-Flag共同轉(zhuǎn)染至ST細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基后PBS清洗3次，每次5 min。預(yù)冷的無水甲醛固定15 min，棄掉固定液，PBS清洗3次，每次5 min；5%脫脂奶封閉1 h；吸棄封閉液，孵育一抗(兔抗Myc單抗和鼠抗Flag單抗)；孵育二抗(FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG、Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG)；避光加入DAPI(1∶2 000稀釋)染色15～20 min；利用倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果；指甲油封片后滴一滴10%甘油，用激光共聚焦顯微鏡DIPA、FITC、Cy3激發(fā)光激發(fā)熒光，觀察Beclin1與NS5A位置分布。

2 結(jié) 果

2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建

Beclin1基因的PCR擴(kuò)增：收取ST細(xì)胞RNA樣后，加入Trizon后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用EasyTaq?DNAPolymerase酶PCR擴(kuò)增Beclin1全長(zhǎng)，取部分產(chǎn)物進(jìn)行電泳；由圖1A所示條帶大小和預(yù)期相符。

重組質(zhì)粒雙酶切鑒定：將Beclin1全長(zhǎng)產(chǎn)物與pDsRedN1空載體雙酶切后，22 ℃連接1 h并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后采用對(duì)應(yīng)酶進(jìn)行雙酶切并進(jìn)行電泳鑒定。結(jié)果見圖1B，條帶大小與預(yù)期一致。

M1. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.Beclin1基因PCR擴(kuò)增；M2.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.重組載體雙酶切鑒定

2.2 豬瘟病毒及NS5A蛋白上調(diào)Beclin1蛋白表達(dá)

ST細(xì)胞在感染CSFV及轉(zhuǎn)染表達(dá)NS5A蛋白后，于不同時(shí)間點(diǎn)分別收取RNA及蛋白樣品，利用qRT-PCR及Western blot分別檢測(cè)Beclin1轉(zhuǎn)錄及蛋白水平變化，結(jié)果如圖2顯示，CSFV感染及NS5A蛋白均能顯著上調(diào)Beclin1的表達(dá)水平。

A. qRT-PCR檢測(cè)CSFV增殖量；B. qRT-PCR檢測(cè)CSFV對(duì)Beclin1表達(dá)影響；C. qRT-PCR檢測(cè)NS5A對(duì)Beclin1表達(dá)影響；D. Western blot檢測(cè)CSFV對(duì)Beclin1表達(dá)影響；D. Western blot檢測(cè)NS5A對(duì)Beclin1表達(dá)影響。與對(duì)照組相比，*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

2.3 Beclin1蛋白對(duì)CSFV增殖影響

將Beclin1-RedN1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入ST細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)Beclin1蛋白的過表達(dá)，同時(shí)，設(shè)置空載體轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照；之后感染CSFV，于不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞樣品，結(jié)果如圖3所示，CSFV復(fù)制水平顯著提高。相反，利用si-RNA敲低Beclin1表達(dá)后，CSFV增殖受到顯著抑制。

A.過表達(dá)Beclin1后qRT-PCR檢測(cè)Beclin1表達(dá)水平；B.過表達(dá)Beclin1后qRT-PCR檢測(cè)CSFV增殖水平；C.敲低Beclin1后qRT-PCR檢測(cè)Beclin1表達(dá)水平；D.敲低Beclin1后Western blot檢測(cè)Beclin1表達(dá)水平；E. qRT-PCR檢測(cè)CSFV增殖水平；**.P<0.01；***.P<0.001

2.4 Beclin1與CSFV NS5A相互作用研究

進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證Beclin1蛋白是否與NS5A相互作用。將Beclin1-Myc和NS5A-Flag質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞24 h，細(xì)胞裂解液與抗Flag親和凝膠免疫共沉淀。最后，用蛋白印跡法檢測(cè)復(fù)合物中的蛋白。結(jié)果顯示，Beclin1-Myc和NS5A-Flag蛋白相互作用(圖4)。

用NS5A-Flag和Beclin1-Myc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞48 h后收取蛋白樣。樣品經(jīng)抗Flag的抗體免疫沉淀，然后進(jìn)行免疫印跡分析

采用GST-pulldown試驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)Beclin1與NS5A之間的相互作用在體外條件下是否成立。重組全長(zhǎng)Beclin1-GST融合蛋白和GST蛋白分別在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中誘導(dǎo)表達(dá)，并將NS5A-Flag轉(zhuǎn)染到ST細(xì)胞中。采用GST-pulldown法檢測(cè)Beclin1與NS5A之間的關(guān)系。如圖所示，在Beclin1-GST復(fù)合物中檢測(cè)到NS5A-Flag(圖5)。該結(jié)果說明Beclin1在體外可以與NS5A相互作用。

A. GST空載體及Beclin1-GST重組質(zhì)粒原核誘導(dǎo)表達(dá)；B. GST-pulldown試驗(yàn)驗(yàn)證蛋白互作

利用激光共聚焦顯微鏡觀察Beclin1與NS5A在ST細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，在ST細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染Beclin1-RedN1和NS5A-GFPC1真核表達(dá)載體。36 h后制備細(xì)胞爬片，利用多聚甲醛固定后試驗(yàn)DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，最后在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。如圖所示，在共轉(zhuǎn)染Beclin1-RedN1和NS5A-GFPC1的細(xì)胞(黃色斑點(diǎn))中，NS5A與細(xì)胞Beclin1有明顯的共定位(圖6)。

用Beclin1-RedN1和NS5A-GFPC1共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白載體RedN1與GFPC1作為對(duì)照

2.5 CSFV對(duì)PI3K/Akt通路相關(guān)因子表達(dá)影響

收取感染CSFV不同時(shí)間點(diǎn)ST細(xì)胞樣品，利用qRT-PCR方法檢測(cè)PI3K/Akt通路相關(guān)因子VPS34、VPS15、ATG14L與UVRAG等基因表達(dá)情況。結(jié)果如圖7所示，PI3K/Akt通路相關(guān)因子都呈現(xiàn)出不同程度的升高趨勢(shì)，其中VPS34表達(dá)變化水平最高。當(dāng)利用siRNA敲低Beclin1表達(dá)水平后，感染CSFV，收取不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞樣品，利用qRT-PCR檢測(cè)PI3K/Akt通路相關(guān)因子VPS34、VPS15、ATG14L與UVRAG等基因表達(dá)情況。結(jié)果如圖8所示，VPS34、VPS15、ATG14L與UVRAG基因上調(diào)表達(dá)受到明顯抑制。

A. qRT-PCR檢測(cè)VPS34表達(dá)；B. qRT-PCR檢測(cè)ATG14L表達(dá)；C. qRT-PCR檢測(cè)VPS15表達(dá)；D. qRT-PCR檢測(cè)UVRAG表達(dá)。*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

A. qRT-PCR檢測(cè)VPS34表達(dá)；B. qRT-PCR檢測(cè)ATG14L表達(dá)；C. qRT-PCR檢測(cè)VPS15表達(dá)；D. qRT-PCR檢測(cè)UVRAG表達(dá)；**.P<0.01；***.P<0.001

3 討 論

CSFV感染可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生完全自噬，自噬體的激活有助于病毒的復(fù)制及其病毒顆粒的成熟[14，27]。CSFV通過調(diào)控多種信號(hào)通路來完成感染與復(fù)制。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的眾多病理生理過程中扮演重要角色[28]。當(dāng)前研究證實(shí)，與CSFV同屬于黃病毒科的丙型肝炎病毒(HCV)可通過活化PI3K/Akt通路來影響其自身復(fù)制[29]。研究發(fā)現(xiàn)，CSFV感染可通過活化PI3K/Akt通路來促進(jìn)CSFV復(fù)制[30]。CSFV NS5A蛋白定位于宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，對(duì)CSFV的生長(zhǎng)和病毒RNA的合成具有重要意義[4]。LC3作為主要的自噬標(biāo)記物常用于評(píng)估自噬溶酶體的形成，其作為PI3K/Akt通路上的自噬相關(guān)蛋白，與CSFV NS5A蛋白存在相互作用并可誘導(dǎo)完全自噬[15]。本文所研究的Beclin1蛋白，在PI3K激酶ClassⅢ(Class Ⅲ phosphatidylinositol 3-Kinase)復(fù)合物中扮演核心角色，該復(fù)合物由Vps34、Vps15、Beclin1三個(gè)主要亞基組成，作為自噬起始的復(fù)合物，在自噬小體的形成中不可或缺[22]。Twu等[31]研究證實(shí)，Beclin1敲低細(xì)胞系中，HCV和SARS-CoV-2的復(fù)制減少。PI3K復(fù)合物中的ATG14L的敲低/敲除可抑制HCV復(fù)制[32]。另一研究表明，Beclin1作為VPS34活性調(diào)控的關(guān)鍵因子，兩者的降低均減少HCV復(fù)制[33]。有研究表明，HCV NS5A通過活化蛋白C激酶1(RACK1)受體與Ⅲ類PI3K復(fù)合物相互作用[26]。

本研究證實(shí)，ST細(xì)胞感染CSFV或轉(zhuǎn)染表達(dá)NS5A蛋白后，Beclin1在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上表達(dá)均顯著上升。通過免疫共沉淀及GST-pulldown等試驗(yàn)證實(shí)Beclin1與NS5A存在相互作用。當(dāng)過表達(dá)Beclin1時(shí)，CSFV的復(fù)制水平顯著增強(qiáng)；作為另一佐證，ST細(xì)胞干擾Beclin1表達(dá)后CSFV復(fù)制量顯著減少。

此外，F(xiàn)underburk等[34]研究證實(shí)Beclin1及其相關(guān)蛋白VPS34、VPS15、UVRAG結(jié)合,誘導(dǎo)自噬小體的形成。UVRAG的表達(dá)與VPS34酶活性的增加相關(guān)，提示Beclin1-UVRAG-VPS34-VPS15復(fù)合物在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮了作用。與此同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Atg14L的存在主要依賴于Beclin1蛋白，Beclin1的缺失會(huì)大大降低Atg14L蛋白水平，這對(duì)自噬小體的形成至關(guān)重要[34]。本研究采用RT-PCR初步證實(shí)Beclin1的過表達(dá)及敲低影響VPS34、VPS15、ATG14L及UVRAG等級(jí)聯(lián)因子的表達(dá)，結(jié)果呈正相關(guān)。VPS34基因的mRNA表達(dá)在感染后6 h呈現(xiàn)明顯的持續(xù)上升趨勢(shì)，差異極其顯著(P<0.001)(圖7)；相反，當(dāng)ST細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Beclin1后感染CSFV，VPS34基因的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖8)。VPS15作為自噬早期復(fù)合體的關(guān)鍵調(diào)控因子的另一基因，當(dāng)ST細(xì)胞過表達(dá)Beclin1后感染CSFV，其mRNA表達(dá)水平相較于轉(zhuǎn)染空載體接毒組上調(diào)較為緩慢；VPS15基因的mRNA表達(dá)在感染后12 h呈現(xiàn)明顯的持續(xù)上升趨勢(shì)，差異顯著(P<0.05)；相反，當(dāng)ST細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Beclin1后感染CSFV，VPS15基因的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)輕度下降趨勢(shì)。ATG14L作為另一自噬早期復(fù)合體結(jié)合蛋白，當(dāng)ST細(xì)胞過表達(dá)Beclin1后感染CSFV，其mRNA表達(dá)水平相較于轉(zhuǎn)染空載體接毒組上調(diào)顯著；ATG14L基因的mRNA表達(dá)在感染后6 h呈現(xiàn)較明顯的持續(xù)上升趨勢(shì)(圖7)。相反，當(dāng)ST細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Beclin1后感染CSFV，ATG14L基因的mRNA表達(dá)水平下降趨勢(shì)較明顯(圖8)。UVRAG與Beclin-1/PI3KC3復(fù)合體相關(guān)，其能促進(jìn)PI3KC3酶促活性和自噬。當(dāng)ST細(xì)胞過表達(dá)Beclin1后感染CSFV，其mRNA表達(dá)水平相較于轉(zhuǎn)染空載體接毒組上調(diào)趨勢(shì)并不顯著；UVRAG基因的mRNA表達(dá)在感染后24 h呈現(xiàn)較明顯的持續(xù)上升趨勢(shì)，差異顯著(P<0.05)(圖7)。相反，當(dāng)ST細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Beclin1后感染CSFV，UVRAG基因的mRNA表達(dá)水平下降趨勢(shì)顯著(圖8)。上述結(jié)果證實(shí)，Beclin1等自噬相關(guān)因子通過形成PI3K自噬復(fù)合體促進(jìn)豬瘟病毒復(fù)制。

綜上所述，本研究證實(shí)Beclin1蛋白可通過活化PI3K/Akt信號(hào)通路并與CSFV NS5A蛋白互作來促進(jìn)CSFV復(fù)制，為豬瘟的有效防控提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究證實(shí)了ST細(xì)胞感染CSFV或轉(zhuǎn)染表達(dá)NS5A蛋白后，均可上調(diào)細(xì)胞Beclin1及PI3K/Akt通路相關(guān)因子表達(dá)水平。此外，作者發(fā)現(xiàn)Beclin1蛋白對(duì)CSFV復(fù)制起到明顯促進(jìn)作用；且Beclin1蛋白能夠與CSFV NS5A發(fā)生相互作用。提示作為自噬體的重要起始蛋白Beclin1蛋白，通過調(diào)控PI3K/Akt通路中的相關(guān)蛋白促進(jìn)病毒的增殖。