鐵死亡參與鎘暴露雞肝損傷的研究

陳敬宜，于 淼，張金洋，樊 堃，楊桂君，葛 銘，張瑞莉*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

鎘(cadmium，Cd)是自然環(huán)境中毒性最大的重金屬污染物之一，主要存在于硫鎘礦、鋅礦中，因其良好的物理性質(zhì)，在冶金、電鍍、涂料和充電電池等生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。隨著自然環(huán)境變化、工農(nóng)業(yè)迅速發(fā)展以及人類活動(dòng)的頻繁，鎘對(duì)土壤、水源、空氣的污染越來越明顯，土壤或水域中的鎘不斷被農(nóng)作物或水生生物吸收蓄積，經(jīng)過食物鏈層層傳遞，造成鎘在多種生物體內(nèi)富集[1-2]。鎘是人和動(dòng)物體非必需的金屬元素，由于其生物半衰期長(zhǎng)，從體內(nèi)排出的速率十分緩慢，容易在體內(nèi)蓄積，對(duì)肝、腎、睪丸、肺、骨、心、脾和腦等多種器官組織產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，甚至還具有遺傳毒性和致癌性[3-6]。隨著鎘對(duì)自然環(huán)境污染和對(duì)人和動(dòng)物健康威脅越來越明顯，探討鎘毒性機(jī)制逐漸被重視并成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和動(dòng)物醫(yī)學(xué)，特別是環(huán)境毒理學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

肝是鎘蓄積和毒性損傷的主要靶器官，Cd2+可以通過Zn2+等運(yùn)輸載體、電壓門控式Ca2+通道及Cd-金屬硫蛋白結(jié)合態(tài)進(jìn)入肝[7-8]。鎘暴露的肝表現(xiàn)為肝細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)喪失、淤血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)締組織增生，在功能上表現(xiàn)為肝重要酶類活性異常，導(dǎo)致肝功能紊亂[9-10]。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是鎘誘導(dǎo)肝毒性的重要機(jī)制[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露雞的肝組織內(nèi)過氧化物蓄積，并伴有嚴(yán)重的炎性損傷[12]；同時(shí)肝中谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)表達(dá)顯著降低。GPX4是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，提示鐵死亡機(jī)制參與到鎘暴露雞肝損傷過程。

鐵死亡(ferroptosis)是一種鐵依賴的脂質(zhì)過氧化損傷引起的、全新的細(xì)胞死亡方式，近年來越來越受到關(guān)注[13]。鐵死亡與壞死、凋亡、焦亡、自噬等有著明顯的不同。在形態(tài)學(xué)方面，發(fā)生鐵死亡的細(xì)胞主要表現(xiàn)為線粒體體積縮小、線粒體嵴減少或消失；在生化方面，谷胱甘肽(glutathione，GSH)耗竭，GPX4表達(dá)降低，脂質(zhì)氧化物不能經(jīng)GPX4催化的谷胱甘肽還原反應(yīng)代謝，繼而二價(jià)鐵離子以類似芬頓反應(yīng)的方式氧化脂質(zhì)，產(chǎn)生大量ROS，促使細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[14]。越來越多的證據(jù)表明，鐵死亡在肝的多種病理過程中起著不可忽視的作用[15-18]。但到目前為止，未見有鐵死亡參與鎘致肝毒性損傷機(jī)制的研究報(bào)道。

如果鐵死亡參與了鎘致肝損傷過程，那么將會(huì)從全新的視角進(jìn)一步揭示鎘致肝組織乃至整個(gè)機(jī)體損傷機(jī)制。因此，本試驗(yàn)在建立鎘暴露雞肝損傷模型和雞肝癌細(xì)胞染鎘的細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，設(shè)立鐵死亡激活劑和抑制劑對(duì)照，通過對(duì)鐵死亡相關(guān)因子、線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)基因、炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)的檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察，從多水平、多角度闡明鐵死亡參與鎘暴露雞肝組織損傷機(jī)制。不但可豐富鎘的毒理學(xué)理論內(nèi)容，更為重要的是為鎘暴露診斷、預(yù)后判斷及拮抗藥物的研發(fā)提供新的科學(xué)試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為比較醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究提供有益的科學(xué)借鑒。

1 材料與方法

1.1 鎘暴露雞肝組織損傷與鐵死亡相關(guān)性檢測(cè)

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)計(jì) 選取30只1日齡海蘭白蛋公雞(購自哈爾濱市成高子孵化場(chǎng))，預(yù)飼7 d，飼養(yǎng)期間雞日糧根據(jù)中國(guó)雞飼料標(biāo)準(zhǔn)配制。在7日齡時(shí)，將雞隨機(jī)均分為正常對(duì)照組(C組)和染鎘組(Cd組)，每組15只。C組，飼喂基礎(chǔ)日糧，與預(yù)飼期一致；Cd組，在基礎(chǔ)日糧中混入140 mg·kg-1氯化鎘，試驗(yàn)周期60 d。試驗(yàn)期間觀察雞群精神狀態(tài)、體況、體態(tài)等，并于染鎘后20、40和60 d每組隨機(jī)選取5只雞心臟采血并安樂死，取肝組織，一部分置于10%福爾馬林固定液，用于組織病理學(xué)檢查；一部分固定于2.5%戊二醛，用于超微病理變化觀察；其余部分置于-80 ℃凍存，用于鎘與鐵含量、肝功能酶活性、相關(guān)因子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、Western blot法及ELISA法的檢測(cè)。

1.1.2 肝組織內(nèi)鎘、鐵含量檢測(cè) 取1 g肝組織作為樣本，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)進(jìn)行檢測(cè)。

1.1.3 肝功能酶活性檢測(cè) 取血清作為樣本，根據(jù)ALT和AST試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書的具體操作步驟測(cè)定肝功能酶ALT和AST活性。

1.1.4 肝組織病理及超微病理變化觀察 取部分肝組織固定于10%福爾馬林固定液，制作石蠟切片，經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。另取一部分肝組織固定于2.5%戊二醛，經(jīng)固定、脫水、浸透、包埋、聚合、修塊、切片和染色后置于透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.1.5 肝組織炎癥因子表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)變化。分別提取各組肝組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，使用SYBR Real-time PCR染料(購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)mRNA的表達(dá)。反應(yīng)在Light Cycler 96 real-time PCR儀(Roche公司)上進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性3 s、60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，退火延伸時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。引物序列見表1。

表1 炎癥因子基因引物序列

采用ELISA法檢測(cè)肝組織TNF-α、IL-6、IL-1β含量變化。取10%肝組織勻漿，離心，取上清，根據(jù)TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒(購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)說明書步驟檢測(cè)肝組織TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.1.6 肝組織氧化應(yīng)激檢測(cè) 取10%肝組織勻漿，離心，取上清，根據(jù)GSH-Px、SOD和MDA ELISA試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書檢測(cè)肝組織內(nèi)GSH-Px、SOD活性和MDA含量。

1.1.7 鐵死亡相關(guān)因子表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)鐵代謝相關(guān)因子(FTH1和TFR)、鐵死亡標(biāo)志物(GPX4、ACSL4、PTGS2)mRNA表達(dá)，方法同“1.1.5”，引物序列見表2。

表2 鐵死亡相關(guān)因子基因引物序列

采用Western blot法檢測(cè)GPX4、ACSL4和PTGS2蛋白表達(dá)變化。分別取各組肝組織0.1 g，按比例加入RIPA組織裂解液，充分裂解，離心后取上清，SDS-PAGE，轉(zhuǎn)??；孵育一抗，一抗分別為1∶1 000稀釋的兔抗鼠GPX4和ACSL4多克隆抗體(購于Affinity公司)、兔抗鼠PTGS2多克隆抗體和1∶1 000稀釋的兔抗鼠β-actin單克隆抗體(購自萬類生物科技有限公司)，4 ℃孵育過夜；孵育二抗，二抗為1∶1 500稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(購自萬類生物科技有限公司)，37 ℃作用1 h；使用ECL超敏發(fā)光液(購自上海天能科技有限公司)進(jìn)行曝光，并用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.1.8 肝組織線粒體融合相關(guān)因子表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)OPA1、Mfn1和Mfn2 mRNA表達(dá)變化，方法同“1.1.5”，引物序列見表3。

表3 線粒體融合相關(guān)因子引物序列

1.2 鐵死亡誘導(dǎo)鎘暴露LMH細(xì)胞損傷檢測(cè)

1.2.1 LMH細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將LMH細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室保存)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(購自HyClone公司)的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞分組及處理：Ⅰ組，加入2.5 μmol·L-1CdCl2；Ⅱ 組，加入6.5 μmol·L-1鐵死亡激活劑RSL3，孵育2 h；Ⅲ組，加入2 μmol·L-1鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1，孵育2 h；Ⅳ組，6.5 μmol·L-1RSL3孵育2 h后加入2.5 μmol·L-1CdCl2；Ⅴ 組，2 μmol·L-1Ferrostatin-1孵育2 h后加入2.5 μmol·L-1CdCl2；C組，不作處理。每組3個(gè)重復(fù)。在CdCl2孵育24 h后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2 LMH細(xì)胞活力檢測(cè) 將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下按試驗(yàn)處理培養(yǎng)細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間后加入CCK-8溶液，孵育2 h后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于A450 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3 LMH細(xì)胞炎癥因子表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)變化，方法參照“1.1.5”。

1.2.4 LMH鐵死亡相關(guān)因子表達(dá)的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)GPX4、ACSL4、PTGS2、FTH1和TFRmRNA表達(dá)；采用Western blot法檢測(cè)GPX4、ACSL4和PTGS2蛋白表達(dá)變化。方法同“1.1.5”和“1.1.7”。

1.2.5 LMH細(xì)胞線粒體融合相關(guān)因子表達(dá)的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)OPA1、Mfn1和Mfn2 mRNA表達(dá)，方法同“1.1.5”和“1.1.8”。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用GraphPad Software Prism 6.01軟件繪圖。兩組間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)方法，多組間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)。各組值表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨診癥狀

C組雞精神狀態(tài)良好，生長(zhǎng)情況正常。Cd組雞被毛散亂、失去光澤，喜臥、無法直立，個(gè)體發(fā)育不良。

2.2 肝組織鎘、鐵含量

如圖1所示，鎘暴露后20、40、60 d，與C組相比，Cd組雞肝組織鎘、鐵含量均極顯著增加(P<0.01)。

“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。下同

2.3 肝功能酶活性變化

如圖2所示，鎘暴露后20、40和60 d，雞血清中ALT和AST的活性與對(duì)照組相比均極顯著升高(P<0.01)。

圖2 雞血清ALT(A)、AST(B)活性變化

2.4 肝組織病理及超微病理變化

鎘暴露組雞肝細(xì)胞排列紊亂，胞漿內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的空泡，胞核染色變淡或溶解消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞之間界限不清；竇狀隙及門管區(qū)內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量增多，并可見有漿液、纖維素滲出及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。上述組織病理變化隨著鎘暴露時(shí)間延長(zhǎng)而越來越顯著。透射電鏡下可見Cd組雞肝細(xì)胞核核周間隙增大，大部分線粒體體積縮小，嵴減少；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張。對(duì)照組雞肝組織未見明顯病理形態(tài)變化。

2.5 肝組織炎癥因子的表達(dá)變化

如圖4所示，在鎘暴露后20、40、60 d的同一取樣時(shí)間點(diǎn)，雞肝組織NF-κB、TNF-α、IL-6的mRNA水平均較C組極顯著升高(P<0.01)。鎘暴露后20 d，與對(duì)照組比較，LOXmRNA的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，IL-1β的mRNA水平顯著升高(P<0.05)。鎘暴露后40、60 d，與對(duì)照組比較，LOX和IL-1β的mRNA水平極顯著升高(P<0.01)。雞肝組織中TNF-α和IL-6的含量，與同一取樣時(shí)間點(diǎn)的正常組比較，均極顯著升高(P<0.01)。

A～E分別為雞肝組織中LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)變化；F～G分別是雞肝組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量變化

鎘暴露后20 d，與對(duì)照組相比IL-1β的含量無顯著差異；40、60 d時(shí)，IL-1β的含量均極顯著升高(P<0.01)。

2.6 肝組織氧化應(yīng)激水平變化

由圖5可知，鎘暴露后20、40和60 d，與同取樣時(shí)間點(diǎn)的C組相比較，雞肝組織中GSH-Px和SOD的活性均極顯著降低(P<0.01)，MDA的含量極顯著升高(P<0.01)。

A、B和C分別為雞肝GSH-Px活性、SOD活性和MDA含量

2.7 肝組織鐵代謝相關(guān)因子mRNA表達(dá)變化

圖6顯示，鎘暴露后20 d，F(xiàn)TH1的mRNA 表達(dá)顯著升高(P<0.05)，TFR的mRNA 表達(dá)極顯著升高(P<0.01)；鎘暴露后40、60 d，與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，F(xiàn)TH1和TFR的mRNA 表達(dá)極顯著升高(P<0.01)。

A和B分別為雞肝組織FTH1、TFR的mRNA 表達(dá)變化

2.8 肝組織鐵死亡標(biāo)志物表達(dá)變化

鎘暴露后20 d，與C組相比，Cd組GPX4 mRNA水平極顯著下降(P<0.01)，ACSL4 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，PTGS2 mRNA水平極顯著上升(P<0.01)。鎘暴露后40和60 d，Cd組相較于C組，GPX4 mRNA水平極顯著下降(P<0.01)，ACSL4、PTGS2 mRNA水平極顯著上升(P<0.01，圖7A)。

鎘暴露后20、40和60 d，Cd組與同一取樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，GPX4的蛋白相對(duì)含量極顯著下降(P<0.01)，ACSL4和PTGS2 的蛋白相對(duì)含量極顯著升高(P<0.01，圖7B)。

A.雞肝組織鐵死亡標(biāo)志物mRNA表達(dá)變化；B.雞肝組織鐵死亡標(biāo)志物蛋白表達(dá)變化

2.9 肝組織線粒體融合相關(guān)因子表達(dá)變化

如圖8所示，鎘暴露后20 d，與同一取樣時(shí)間點(diǎn)C組相比，OPA1和Mfn1 mRNA的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，Mfn2的mRNA水平極顯著下降(P<0.01)；鎘暴露后40 d，對(duì)比同一取樣時(shí)間點(diǎn)C組，OPA1 mRNA的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，Mfn1的mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)，Mfn2的mRNA表達(dá)極顯著下降(P<0.01)。至鎘暴露后60 d，OPA1、Mfn1和Mfn2的mRNA水平，與對(duì)照組相比均極顯著下降(P<0.01)。

A、B和C分別為雞肝組織中OPA1、Mfn1和Mfn2的mRNA表達(dá)變化

2.10 LMH細(xì)胞活力變化

在染鎘細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，設(shè)立鐵死亡激活劑和抑制劑對(duì)照，觀察對(duì)LMH細(xì)胞活力變化。如圖9所示，與C組相比，Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ組細(xì)胞活力極顯著降低(P<0.01)。Ⅴ組細(xì)胞活力，較Ⅰ組極顯著升高(P<0.01)。

與C組相比，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01；與Ⅰ組相比，“#”表示P<0.05，“##”表示P<0.01。下同

2.11 LMH細(xì)胞炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)變化

如圖10所示，與C組相比，Ⅰ和Ⅱ組細(xì)胞LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平均極顯著升高(P<0.01)。Ⅲ組中NF-κB和TNF-αmRNA表達(dá)水平較C組顯著上升(P<0.05)，LOX、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。Ⅴ組與經(jīng)氯化鎘處理的Ⅰ 組相比，LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平均極顯著降低(P<0.01)。

A、B、C、D和E分別為L(zhǎng)OX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)變化

2.12 LMH細(xì)胞中鐵代謝相關(guān)因子mRNA表達(dá)變化

如圖11所示，與C組相比，Ⅰ、Ⅱ 和Ⅳ 組中FTH1和TFR的mRNA水平，極顯著升高(P<0.01)。與Ⅰ 組相比，Ⅴ組中FTH1和TFR的mRNA水平極顯著下降(P<0.01)。

A和B分別為L(zhǎng)MH細(xì)胞中FTH1、TFR的mRNA 表達(dá)變化

2.13 LMH細(xì)胞鐵死亡標(biāo)志物表達(dá)變化

如圖12所示，Ⅰ、Ⅱ 和Ⅳ 組中GPX4的mRNA水平，較C組極顯著降低(P<0.01)，ACSL4和PTGS2的mRNA水平極顯著升高(P<0.01)。與 Ⅰ 組相比，Ⅴ 組中GPX4的mRNA水平極顯著升高(P<0.01)，ACSL4和PTGS2的mRNA水平極顯著下降(P<0.01)。

A. LMH細(xì)胞鐵死亡標(biāo)志物mRNA表達(dá)變化；B. LMH細(xì)胞鐵死亡標(biāo)志物蛋白相對(duì)表達(dá)變化

與C組相比，Ⅰ、Ⅱ 和Ⅳ組中GPX4的蛋白相對(duì)表達(dá)極顯著降低(P<0.01)，ACSL4和PTGS2的蛋白相對(duì)表達(dá)極顯著升高(P<0.01)。Ⅴ 組中，GPX4的蛋白相對(duì)表達(dá)，較 Ⅰ 組極顯著升高(P<0.01)，ACSL4和PTGS2蛋白表達(dá)水平極顯著下降(P<0.01)。

2.14 LMH細(xì)胞線粒體融合相關(guān)因子mRNA表達(dá)變化

如圖13所示，與C組相比，Ⅰ 和 Ⅱ 組細(xì)胞中OPA1、Mfn1和Mfn2 mRNA表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。與 Ⅰ 組相比， Ⅴ 組OPA1、Mfn1和Mfn2 mRNA表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01)。

A、B和C分別為OPA1、Mfn1和Mfn2的mRNA表達(dá)變化

3 討 論

肝是鎘最主要的靶器官。鎘暴露造成斑馬魚肝組織核苷酸、氨基酸等代謝途徑異常[19]；引起大鼠肝細(xì)胞發(fā)生顆粒變性、脂肪變性和細(xì)胞壞死[20]；在亞慢性鎘中毒蛋雞中，可以觀察到肝組織充血，肝細(xì)胞嚴(yán)重變性、壞死，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜性細(xì)胞器嚴(yán)重?fù)p傷[21]。本試驗(yàn)中，鎘暴露組雞肝內(nèi)鎘含量顯著升高，血清中肝功能酶活性明顯升高，肝細(xì)胞排列紊亂、空泡變性甚至壞死，肝淤血、漿液-纖維素性滲出及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，超微病理結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)肝細(xì)胞核周間隙變寬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體嵴斷裂、減少，炎癥因子LOX、NF-κB、TNF-α，IL-6 和IL-1β表達(dá)顯著升高，表明鎘暴露雞肝組織發(fā)生了炎性損傷，該動(dòng)物模型可用于鎘致肝組織毒性機(jī)制的研究。

目前，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是鎘毒性作用的主要機(jī)制。Cd在體內(nèi)蓄積破壞了氧化還原系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低抗氧化能力，造成氧化損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的含量最高的單體醛類[22]；GSH-Px和SOD是生物體抗氧化酶系統(tǒng)的主要成員。研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露錦鯉腎中的MDA含量顯著升高[23]。鎘暴露也可引起小鼠肝組織SOD及GSH-Px活性降低，MDA含量升高[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，鎘暴露雞肝組織GSH-Px和SOD的活性均極顯著降低、MDA的含量極顯著升高，表明鎘暴露雞肝組織損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。

研究表明，氧化應(yīng)激導(dǎo)致大量脂質(zhì)過氧化物累積，為細(xì)胞發(fā)生鐵死亡提供了條件[25]。那么，鎘暴露雞肝組織氧化應(yīng)激損傷機(jī)制是否與鐵死亡相關(guān)呢？為此，本試驗(yàn)對(duì)雞肝內(nèi)鐵含量、鐵代謝相關(guān)因子及鐵死亡標(biāo)志物進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，Cd組雞肝中鐵含量極顯著升高，且鐵含量的升高趨勢(shì)與染鎘時(shí)間具有明顯的依賴性，表明鎘暴露可引起雞肝組織鐵過載。生理?xiàng)l件下，鐵含量在機(jī)體內(nèi)維持著吸收與排出的動(dòng)態(tài)平衡。其中，鐵吸收主要依賴于TFR、鐵的儲(chǔ)存則主要是由FTH1介導(dǎo)的[26]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生鐵過載，F(xiàn)TH1和TFR表達(dá)上調(diào)，來維持機(jī)體內(nèi)鐵含量穩(wěn)定。結(jié)果顯示，鎘暴露雞肝組織FTH1和TREmRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。作為鐵代謝的關(guān)鍵蛋白，F(xiàn)TH1和TRE的表達(dá)升高也是鐵死亡發(fā)生的標(biāo)志之一。試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，鎘暴露雞肝組織鐵死亡標(biāo)志物GPX4表達(dá)明顯下調(diào)，GPX4下游的脂質(zhì)過氧化物合成關(guān)鍵蛋白ACSL4和PTGS2的表達(dá)顯著上調(diào)。上述結(jié)果表明鎘暴露誘發(fā)了雞肝細(xì)胞鐵死亡。

線粒體體積變小、膜密度增加、嵴變少甚至消失是鐵死亡區(qū)別于其他細(xì)胞死亡方式的主要形態(tài)特征[27]。細(xì)胞中調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)與功能的動(dòng)態(tài)過程是線粒體動(dòng)力學(xué)，其中線粒體的融合關(guān)鍵因子為OPA1和Mfn1/2。OPA1蛋白可調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜的融合，維持線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整。Mfn1是線粒體融合蛋白，通過其結(jié)構(gòu)域之間的間歇性相互作用，束縛兩個(gè)相對(duì)的線粒體；Mfn2參與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的物理相互作用[28]。本試驗(yàn)中，鎘暴露雞肝組織OPA1、Mfn1和Mfn2 mRNA表達(dá)顯著下降，肝細(xì)胞內(nèi)大部分線粒體體積縮小、嵴斷裂且數(shù)量減少，提示鎘致肝細(xì)胞鐵死亡破壞線粒體動(dòng)力學(xué)動(dòng)態(tài)平衡，引起肝損傷。

雞肝癌細(xì)胞系(LMH)細(xì)胞是通過化學(xué)試劑誘導(dǎo)的、具有雞肝細(xì)胞分化形態(tài)和生化特性的雞肝癌細(xì)胞系，在保持雞肝細(xì)胞分化大量表型特征的同時(shí)，具有連續(xù)傳代的特征，適合作為體外試驗(yàn)的研究對(duì)象，常用于各種毒性物質(zhì)對(duì)雞肝細(xì)胞的毒性作用研究[29-30]。因此，本試驗(yàn)選用LMH細(xì)胞作為體外研究對(duì)象，建立鐵死亡激活劑和抑制劑染鎘細(xì)胞模型，進(jìn)一步明確鐵死亡在鎘致肝損傷中的作用。鐵死亡激活劑RSL3是含有親電子的氯乙酰胺，可以和GPX4產(chǎn)生共價(jià)相互作用，從而導(dǎo)致GPX4不可逆的失活[31]；鐵死亡機(jī)制及Ferrostatin-1可以較為有效的抑制鐵蛋白的沉積，從而抑制鐵死亡的發(fā)生[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd與RSL3作用相同，均能引起GPX4表達(dá)下調(diào)、脂質(zhì)過氧化物合成關(guān)鍵蛋白(ACSL4、PTGS2)表達(dá)上調(diào)、線粒體融合相關(guān)因子(OPA1、Mfn1和Mfn2)表達(dá)下調(diào)、炎癥因子(LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β)表達(dá)上調(diào)，表明Cd能夠激活LMH細(xì)胞鐵死亡，導(dǎo)致LMH細(xì)胞線粒體損傷和炎性損傷；進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，F(xiàn)errostatin-1可通過抑制鐵死亡緩解Cd引起的LMH細(xì)胞線粒體損傷和炎性損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制線粒體中ROS的生成，可減輕炎癥小體的生成[33]；通過抑制線粒體分裂能夠緩解煙草暴露誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[34]。上述研究結(jié)果提示鎘通過誘導(dǎo)雞肝細(xì)胞鐵死亡導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)損傷、功能障礙，促進(jìn)肝組織炎性損傷。

4 結(jié) 論

總之，鎘暴露造成鎘大量蓄積于肝，導(dǎo)致肝氧化應(yīng)激水平升高、鐵代謝紊亂、大量脂質(zhì)過氧化物累積，引發(fā)鐵死亡，破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而引起肝組織炎性損傷。