電針療法對AKI犬的腎功能、鈣磷代謝、抗氧化能力以及NRF2信號通路的影響

張嘉賓，徐 釗，周光余，張夢迪，符 楊，劉佳琪，周東海*

(1.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070； 2.塔里木大學動物科學學院，阿拉爾 843300)

目前，我國寵物行業(yè)發(fā)展迅速。急性腎損傷已成為危害寵物生命和健康的一種常見病，尤其在老年犬中發(fā)病率逐年上升。雖然腎損傷的治療方法已十分成熟，不過對于急性腎損傷而言其治療有一定難度。因此，找到更加快速、簡便、經濟且有效地治療犬急性腎損傷的方法在當前寵物醫(yī)療行業(yè)迅速發(fā)展的階段具有重要現(xiàn)實意義。袁玲等[1]研究發(fā)現(xiàn)采用主客配穴的方法對急性胰腺炎與急性腎損傷的大鼠進行治針灸治療，減輕炎癥作用，同時降低動物腎損傷程度。張俊川[2]報道，選取內關、足三里等穴位針灸局灶性大腦皮層梗死模型大鼠，發(fā)現(xiàn)電針能減輕炎性因子的表達，減輕腎的受損程度，保護腎功能。梁鑫[3]研究發(fā)現(xiàn)選擇腎俞和足三里兩個穴位針刺能夠通過增強腎功能，減少有害物質在體內的蓄積，同時作用于細胞凋亡相關的信號通路，減輕腎橫紋肌的溶解程度，降低腎的病理損傷程度。王冰舒[4]發(fā)現(xiàn)電針治療急性腎衰竭后機體的抗氧化能力得到提高，其抗氧化相關蛋白的表達明顯增強，同時腎的損傷程度明顯減輕。這說明中醫(yī)治療對于腎的保護和腎功能的恢復具有很好的療效，尤其是針灸治療的方法，其可行性強，應用廣泛。鄒曉彪等[5]研究發(fā)現(xiàn)急性腎衰竭的發(fā)病過程中存在氧化應激反應，而氧化應激損傷也存在于急性腎衰竭的致病機制之中。郭艷輝[6]研究發(fā)現(xiàn)急性腎衰竭兔的氧化應激作用在電針治療后得到明顯改善，同時NRF2信號通路上的抗氧化蛋白HO-1的表達明顯的增加。因此，對于急性腎衰竭過程中的氧化應激反應的研究十分有必要。目前，有關腎損傷的治療方法不盡相同，然而運用中獸醫(yī)的電針療法治療犬急性腎損傷的研究少有報道。以比格犬為對象，探討電針療法對急性腎損傷犬的腎功能、鈣磷代謝、抗氧化能力以及NRF2信號通路的作用研究，為犬急性腎損傷的治療提供理論依據和新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取2～3歲健康、體重相近比格犬24只，采用單因子完全隨機區(qū)組試驗設計，將試驗犬隨機分為對照組、造模組、常規(guī)治療組、電針干預組、電針治療組和聯(lián)合治療組。第1～15天為造模期，第16～30天為治療期。本研究選用腺嘌呤制造急性腎損傷模型。造模的方法參考聶靜等[7]的造模方法，即當試驗犬的血清肌酐濃度達到基線的1.5倍時即判定為造模成功。造模期，除對照組外其余各組每日上午基礎日糧添加75 mg·(kg·d)-1腺嘌呤，電針干預組每日下午電針治療。治療期，除對照組、造模組和電針干預組外，其余各組每日下午治療。常規(guī)治療組通過補液(5%葡萄糖氯化鈉溶液)、利尿(呋塞米2 mg·kg-1)等方法對試驗犬進行對癥治療，電針治療組每日下午電針治療，聯(lián)合治療組在電針治療的同時根據試驗犬的癥狀輔以對癥治療。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗期間自由采食和飲水，單獨籠子飼養(yǎng)。每天清理、消毒犬舍，隨時觀察犬健康狀況。

1.3 電針操作方法

選取犬雙側腎俞(第2腰椎橫突末端相對的髂肋肌溝中)、脾俞(倒數第2肋間，背最長肌與髂肋肌之間的肌溝中)、足三里(小腿外側上1/4處，脛腓骨間隙中)、三陰交(內踝上方，脛骨內隆起與內踝連線下1/5處)、太溪(跟骨內測凹陷中)以及命門(第2、3腰椎棘突之間)；試驗犬保定、剃毛、消毒，選用1寸(0.30 mm×25 mm)一次性無菌針，快速進針法針刺上述穴位，直刺進針，捻轉后接電針。用華佗牌電子針療儀(SDZ-Ⅱ型)，選擇疏密波，頻率1檔，每次電針持續(xù)20 min。電針干預組、電針治療組和聯(lián)合治療組均在造模成功后連續(xù)電針15 d直至試驗結束。

1.4 試驗測定與方法

1.4.1 尿比重和血液生化指標 試驗結束后收集各組尿液進行尿常規(guī)檢測；同時分別從各組犬前肢背側皮下頭靜脈采集血液5 mL，用EDTA抗凝管收集，37 ℃水浴30 min后3 000 r·min-1離心15 min，將上清液分裝到1.5 mL離心管中，置于-20 ℃保存待測生化指標。BUN、CRE、Ca2+、P3+、UA、SOD和MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4.2 X光 根據拍攝部位調節(jié)腹部X光拍攝條件，設置管電壓為56.00 kV，毫安秒為8.00 mAs，曝光時間為40.00 ms。將試驗犬保定在臺子上，拍攝X光。

1.4.3 H.E.染色 試驗結束后，試驗犬麻醉，取出左側腎，將腎表面的血漬用生理鹽水洗凈，放入4%多聚甲醛緩沖液固定12～24 h。將固定好的組織用常規(guī)方法脫水后進行石蠟包埋。包埋后的組織塊修理、切片、脫蠟、水化、蘇木素染色3～5 min、乙醇分色5 s后用伊紅染色數秒，分別用濃度梯度乙醇和二甲苯對切片進行脫水、透明，中性樹膠進行封片處理后，光學顯微鏡下觀察。

1.4.4 免疫組織化學染色 組織石蠟切片常規(guī)脫水、透明后用檸檬酸抗原修復緩沖液(pH 6.0)加熱修復，然后放入3 %雙氧水溶液阻斷內源性過氧化物酶。切片封閉后用一抗4 ℃孵育過夜。PBS洗滌切片后滴加與二抗(HRP標記)覆蓋組織，室溫孵育50 min，DAB顯色和蘇木素復染3 min后脫水封片于光學顯微鏡下觀察。

1.4.5 qRT-PCR 檢測相關基因 用Trizol法提取腎組織總RNA，測定RNA的濃度和純度；根據NCBI主頁GenBank已公布的目的基因序列，應Primer Premier 5.0軟件設計引物，同時參考文獻中提及的引物序列，引物中G+C含量應在40%～60%。qRT-PCR標準程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40次，然后繪制曲線，使用2-ΔΔCt的方法計算目的基因在不同cDNA 模板中的相對表達量。

表1 目的基因及內參基因引物設計

1.4.6 Western blot 用RIPA裂解腎組織并提取總蛋白，BCA法測定總蛋白的濃度；加入Loading Buffer在95 ℃下蛋白變性；取適量的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳結束后進行轉印至PVDF膜，封閉1.5 h；4 ℃過夜孵育一抗(KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1稀釋比例為 1∶800；β-actin稀釋比例為1∶1 000)、HRP標記山羊抗兔二抗室溫孵育2 h(二抗稀釋比例為 1∶5 000)，顯影。使用Image J軟件進行蛋白條帶的灰度值分析；應用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA、t檢驗方法對數據進行顯著性差異分析。KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1一抗購自于Wanleibio 試劑公司，β-actin一抗和HRP標記山羊抗兔二抗購自ABclonal試劑公司。

2 結 果

2.1 電針療法對AKI犬尿比重和血液生化指標的影響

由表2可知，與對照組相比，造模組犬尿比重數值降低；與造模組相比，常規(guī)治療組、電針干預組、電針治療組和聯(lián)合治療組的尿比重數值均有不同程度的升高，但均低于對照組。

表2 尿比重的變化

由圖1可知，與對照組相比，造模組犬血清CREA、BUN、UA、MDA以及血磷含量顯著提高(P<0.01)，而血鈣、血清與腎SOD水平顯著降低(P<0.01)；與造模組相比，常規(guī)治療組、電針干預組、電針治療組和聯(lián)合治療組的血清CREA、BUN、UA、MDA以及血磷含量顯著降低(P<0.01)，而血鈣、血清與腎SOD水平顯著升高(P<0.01)。

B. 空白組; M. 造模組; R. 常規(guī)治療組; Ei. 電針干預組; Et. 電針治療組; C. 聯(lián)合治療組。對比空白組，*.P<0.01；對比造模組，#.P<0.01

2.2 犬腎組織影像學觀察

由圖2可知，X光檢測造模前試驗犬腎結構、大小正常，被膜完整。造模結束后與第2腰椎對比腎體積明顯增大，聯(lián)合治療后腎有所變小，但仍大于造模前腎大小。

A. 造模前；B.造模后；C.聯(lián)合治療后

2.3 犬腎組織病理學觀察

HE染色結果如圖3，空白組腎組織結構完整，造模組腎組織中有大面積腎小管上皮細胞發(fā)生腫大、空泡化、壞死，管腔內細胞碎片和顆粒、且腎間質存在瘀血。常規(guī)治療組與各電針處理組中腎出現(xiàn)的病變相較模型組均有減輕趨勢。

A.空白組;B.造模組;C.常規(guī)治療組;D.電針干預組;E.電針治療組;F.聯(lián)合治療組。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖

2.4 KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1蛋白免疫組織化學染色

試驗用 KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1單克隆抗體孵育組織切片進行免疫組織化學檢測(圖4)。各組腎組織均有KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1 4種蛋白表達，其主要分布于腎小管上皮細胞胞質中，另有少量分布于腎小球基底膜細胞胞質及腎間質中。造模組腎小管上皮細胞KEAP1蛋白陽性染色深，呈深棕色，NRF2、HO-1、NQO1蛋白陽性染色淺，呈淺棕色；對照組腎小管上皮細胞KEAP1蛋白陽性染色淺，NRF2、HO-1、NQO1蛋白陽性染色深，呈深棕色，呈淺棕色。其余各治療的KEAP1蛋白陽性染色均淺于造模組，深于對照組；其余各治療的NRF2、HO-1、NQO1蛋白陽性染色均淺于空白組，深于造模組。

A.空白組;B.造模組;C.常規(guī)治療組;D.電針干預組;E.電針治療組;F.聯(lián)合治療組。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖

2.5 電針療法對AKI犬NRF2通路的影響

qRT-PCR和Western blot檢測KEAP1、NRF2、HO-1和NQO1的基因和蛋白的表達，結果如圖5、6所示，與對照組比，造模組KEAP1基因和蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，而NRF2、HO-1、NQO1基因和蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)；與造模組比，各治療組腎組織KEAP1基因和蛋白相對表達水平顯著下調(P<0.01)，而NRF2、HO-1、NQO1基因和蛋白表達水平顯著上調(P<0.01)。

B.空白組;M.造模組;R.常規(guī)治療組;Ei.電針干預組;Et.電針治療組;C.聯(lián)合治療組。對比空白組，*.P<0.01；對比造模組，#.P<0.01

3 討 論

3.1 電針療法對AKI犬腎功能的影響

現(xiàn)代研究證實針灸在腎疾病的治療方面有著確切的療效。徐藝菲等[8]報道電針可以通過改善腎微循環(huán)，增加氧和其他營養(yǎng)物質的供給，進而減輕腎損傷，增強腎功能。研究發(fā)現(xiàn)針刺還具有延緩腎損害進展、減輕腎組織損傷程度、抑制炎癥反應、促進抗炎物質表達來改善腎功能[1]。肖小艷等[9]和金佳慧等[10]研究發(fā)現(xiàn),刺激腎俞和關元兩個穴位，腎的損傷程度明顯減輕。王學杰等[11]研究證實，在腎損傷通過刺激腎俞穴能夠降低尿蛋白的含量，使腎的濾過作用更快恢復。

B.空白組;M.造模組;R.常規(guī)治療組;Ei.電針干預組;Et.電針治療組;C.聯(lián)合治療組。對比空白組，*.P<0.01；對比造模組，#.P<0.01

本試驗選擇一組經大量研究證實在腎疾病中有顯著療效的穴位配伍。其中，腎俞穴其中最主要的穴位，在治療腎系疾病中使用頻率最高，治療效果最好，尤其在治療腎損傷和糖尿病腎病的研究中常被選用[12-13]。中醫(yī)學對于本臟的疾病優(yōu)先考慮本臟的背俞穴進行治療，以達到更好的治療效果。因此，腎疾病首選腎俞穴進行治療。刺激腎俞穴能夠改善腎功能，促進水液運化[14-15]。脾俞穴與腎俞穴相配伍，能夠在調節(jié)腎功能的同時加強脾的水液運化能力[16]。足三里穴在許多疾病的治療和養(yǎng)生保健方面都有著廣泛的應用，針刺其穴位能夠生發(fā)脾胃之氣同時增強機體的免疫力[17-18]。針灸三陰交除健脾益血外，還能調肝補腎，對于急性腎衰竭的恢復期有著較好的療效[19]。太溪穴與腎俞穴合用稱原俞配伍[20]。原俞配穴是指將臟腑所對應的原穴和背俞穴配伍使用，相比單獨針灸一個穴位效果更好。因此，選用腎俞和腎經的原穴太溪相配伍[21]。此外，本試驗選取的命門穴在臨床上與腰、腎疾病關系密切。本試驗選取命門穴與上述其他穴位合用，改善急性腎損傷犬的腎功能。同時由于犬的皮膚游離性較大，在試驗操作過程中腎俞穴不方便定位。因此先定位命門穴，再沿腰椎定位腎俞穴也有利于試驗過程中的操作。本試驗造模組的腎較對照組出現(xiàn)體積增大[22]，經過電針聯(lián)合治療后，體積減少，腎病變損傷程度減輕，治療效果比常規(guī)治療及電針單獨治療效果好。尿酸和肌酐是判定腎損傷的主要指標。臨床上也是主要根據肌酐含量來判定腎損傷程度[23]。AKI犬的最明顯癥狀便是腎功能的損傷，其CREA、BUN、尿比重等都會出現(xiàn)明顯的變化[24]。郭銀雪等[25]報道ARF出現(xiàn)腎功能失常的主要原因是腎小管發(fā)生阻塞，導致有毒物質在體內蓄積。本研究發(fā)現(xiàn)電針治療組及其他治療組較造模組BUN、CREA、UA均顯著降低，尿比重顯著升高，且電針聯(lián)合治療組的結果比常規(guī)治療組合電針單獨治療組低。說明電針療法對AKI犬的腎及其功能具有積極作用。

3.2 電針療法對AKI犬鈣磷代謝的影響

在腎發(fā)生損傷過程中，血液內游離的鈣通過被破壞的鈣離子轉運通道轉移到細胞內，超過正常細胞承載能力[26]。同時，血液中磷的含量會因腎功能障礙導致磷排出困難而增加，另外組織細胞受到實質性的損傷導致細胞內的磷被釋放入血，進一步導致了血磷的上升[27]。上述報道與本研究結果一致，試驗造模后血清磷含量顯著增加，血清鈣含量顯著降低。各治療組較造模組血磷濃度顯著降低，血鈣濃度顯著增高，其中，電針聯(lián)合治療組比常規(guī)治療組和電針單獨治療組變化明顯；說明電針處理能夠減少磷在血中的含量并提高鈣的含量，從而減輕AKI引起的體內鈣磷代謝失調，從而減輕組織細胞的損傷程度。

3.3 電針療法對AKI犬抗氧化能力和NRF2通路的影響

在AKI過程中出現(xiàn)廣泛的氧化應激損傷[28]，而氧化應激損傷也存在于AKI的致病機制之中[5]。鄧樹泳等[29]研究發(fā)現(xiàn)針刺治療能夠提高機體的免疫反應，增加體內多個免疫器官的抗氧化能力，并促進這些免疫器官中SOD的生成和MDA的減少，從而達到增強機體整體的抗氧化能力的效果。這一結論與本研究結果相一致，各治療組相比于腺嘌呤造模組SOD均有不同程度的增強，MDA含量均有不同程度的降低，其中，聯(lián)合治療組的作用效果最明顯。說明電針的干預和治療能夠提升AKI犬的抗氧化能力。

在氧化應激過程中，NRF2信號通路通過激活抗氧化酶的表達來對過量的能造成氧化損傷的物質進行清除[30-31]。NRF2信號通路被認為是最為主要的信號通路之一，NRF2也被認為是該信號通路上的核心蛋白[5,32]。NRF2進入細胞核內，啟動各類抗氧化蛋白酶的翻譯過程，包括NQO1、HO-1等[33-36]。也有研究證實，電針治療能夠通過調控NRF2信號通路改善機體的氧化應激水平[37-38]。上述報道與本研究結果一致，造模組KEAP1蛋白和基因的表達量升高，NRF2、NQO1、HO-1蛋白和基因表達量降低；電針治療組KEAP1蛋白的表達量較造模組降低，而NRF2、NQO1、HO-1蛋白的表達量較造模組增加，其中，聯(lián)合治療組的蛋白和基因表達量較造模組變化最明顯。說明經電針治療以后其NRF2通路上相關蛋白表達增加,其抗氧化能力也得到提升。

4 結 論

4.1電針治療通過提高腎功能、改善鈣磷代謝、提升抗氧化能力、降低腎KEAP1的表達，增加腎NRF2及其下游的抗氧化相關蛋白的表達等方面緩解犬的急性腎損傷癥狀，減輕腎損傷程度。

4.2電針與常規(guī)療法相結合的聯(lián)合治療方法對于急性腎衰竭的治療效果較好，其治療效果優(yōu)于單獨使用電針治療與單純進行對癥治療。