IFN-α對山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

孫 敏，郝 飛，張紋紋，李文良,3,4，楊蕾蕾，毛 立,2，程子龍，劉茂軍,3,4

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，南京 210014，2.江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013; 3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013;4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

宿主先天免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，激活宿主先天免疫應(yīng)答而進入抗感染狀態(tài)[1-2]，而干擾素(IFN)介導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答是宿主抵抗病原感染的第一道屏障，具有較強的抗病毒活性[1]。根據(jù)干擾素的結(jié)構(gòu)、受體的特異性和來源的細胞種類不同，干擾素被分為I型、II型及III型，其中I型干擾素包括多種類型，包括IFN-α[3-4]。目前人類及不同種屬動物中(如豬、鼠、犬、雞)均報道含有IFN-α編碼基因，且均報道存在一定的抗病毒活性[5-8]。人源重組IFN-α可抑制SARS-CoV-2及PEDV復(fù)制，且具有劑量依賴性[9-10]，豬源重組IFN-α可抑制VSV及PRV的復(fù)制[11]，而目前關(guān)于山羊源IFN-α表達特性及抗病毒活性尚不清楚，值得進一步研究。

I型IFN是病毒感染細胞分泌的多肽，其通過激活JAK/STAT信號通路刺激下游干擾素刺激基因(ISGs)的轉(zhuǎn)錄表達誘導(dǎo)感染細胞和相鄰細胞進入抗病毒狀態(tài)，由它們調(diào)制宿主細胞的各類抗病毒效應(yīng)[12]。ISG可以正調(diào)節(jié)或負調(diào)節(jié)IFN信號，甚至直接阻斷病毒復(fù)制周期[1, 13]。大多數(shù) ISG分子，比如Mx、Viperin等IFN誘導(dǎo)蛋白可直接作為抗病毒效應(yīng)分子[14-15]，分別作用于病毒復(fù)制周期的不同階段而發(fā)揮抗病毒活性[1, 16]。

目前，養(yǎng)殖方式向集約化、規(guī)?；淖?，而養(yǎng)殖條件以及防控技術(shù)的應(yīng)用情況卻參差不齊，引起呼吸道疫病為主的疫病多發(fā)，危害嚴重。山羊副流感病毒3型(CPIV3)屬于副黏病毒科呼吸道病毒屬，可引起發(fā)病羊表現(xiàn)呼吸道臨床癥狀及相應(yīng)的病理變化，其可通過氣溶膠進行水平傳播，具有較強致病性[17-19]。CPIV3在感染過程中可編碼非結(jié)構(gòu)蛋白C，死病毒、未感染病毒或早期感染階段病毒含量較低的細胞裂解物中不含有該蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白C 的表達水平可用于評價CPIV3的增殖效率。目前針對CPIV3感染尚無有效的免疫調(diào)控策略，探究山羊IFN-α對該病毒復(fù)制的調(diào)控作用，并依據(jù)非結(jié)構(gòu)蛋白C建立相應(yīng)的免疫印跡檢測方法，為開發(fā)有效的預(yù)防和治療措施提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 細胞及病毒培養(yǎng)

MDBK細胞(牛腎細胞)購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，由本實驗室傳代保存。其培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM(北京全式金)營養(yǎng)液中，消化液為0.25%胰酶(含0.02% EDTA, Gibco)。山羊副流感病毒3型(CPIV3)由本實驗室保存。MDBK細胞長滿單層后PBS洗滌3遍，按照MOI比值為1接種CPIV3 JS2013株第8代(P8，病毒含量為108.0TCID50·0.1 mL-1)，37 ℃孵育1 h后棄除病毒液，向細胞中添加細胞維持液(含有2% FBS的DMEM營養(yǎng)液)，待培養(yǎng)至特定時間收集細胞上清，測定TCID50，計算病毒含量。

1.2 山羊IFN-α原核表達與純化

根據(jù)GenBank中山羊IFN-α編碼蛋白的基因序列，去除其信號肽序列后，基因合成相關(guān)序列，并獲得原核表達重組載體pET-30a-gIFN-α，進而利用熱應(yīng)激方法轉(zhuǎn)化至工程菌Rosetta (DE3)。擴大培養(yǎng)陽性克隆菌液，IPTG(10 μmol·L-1)誘導(dǎo)蛋白表達，細菌破碎、離心，培養(yǎng)上清過His鎳柱(GE)和親和純化(南京德泰生物科技有限公司)，獲得山羊IFN-α。

1.3 SDS-PAGE電泳

將相同濃度的山羊IFN-α和pET-30a表達產(chǎn)物與2×蛋白上樣緩沖液(碧云天)1∶1混合后，煮沸10 min使蛋白變性，13 000 r·min-1離心5 min，取上清加入12% SDS變性膠(金斯瑞)，200 V電泳約30 min，取蛋白膠進行考馬斯亮藍染色6 h后進行脫色觀察。

1.4 Western blot

原核表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳后，取蛋白膠濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上(300 mA，1 h)，用含5%脫脂奶的TBST進行封閉(37 ℃，2 h)。封閉后加入His(博士德)單克隆抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，再加HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體(博士德)37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。

同樣，將山羊IFN-α(1.0 μg·mL-1)孵育MDBK細胞1 d，同樣設(shè)立空白細胞對照組和陰性對照組(pET-30a表達產(chǎn)物處理組)，進而按照MOI為1感染CPIV3 JS2013株，于感染后48 h裂解細胞并收集總蛋白。進而將CPIV3感染后的細胞蛋白樣品按照上述方法進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印、封閉，隨后加入CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C特異性單克隆抗體5E4(本實驗室自備)或β-actin單克隆抗體(博士德)4 ℃孵育過夜，隨后按序進行TBST洗滌、HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體孵育、TBST洗滌等。最后，利用ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(諾唯贊)曝光顯色后，全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(天能)采集和分析印跡膜圖像。

1.5 熒光定量PCR

山羊IFN-α(1.0 μg·mL-1)孵育MDBK細胞1 d后，利用RNAiso Plus(TaKaRa)充分裂解，利用氯仿抽提，異丙醇沉淀的方法提取細胞的總RNA。同時，設(shè)置pET-30a表達產(chǎn)物處理組為陰性對照組，脂質(zhì)體Poly(I:C)(1 μg·mL-1)轉(zhuǎn)染的MDBK細胞為陽性對照組。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)說明書進行反轉(zhuǎn)錄試驗。按照SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa)說明書配置反應(yīng)液，并利用Applied Biosystems Step OneTMReal Time PCR System儀器使用說明書要求進行操作。特定目的基因的反應(yīng)引物參見表1[20-21]。以細胞β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct計算方法測定和比較特定目的基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。

表1 qPCR反應(yīng)引物

1.6 山羊IFN-α對CPIV3復(fù)制的影響

MDBK細胞于前1 d胰酶消化后鋪于12孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)至長滿單層，棄除細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍后，利用山羊IFN-α(1.0 μg·mL-1)預(yù)處理MDBK細胞1 d，同時設(shè)立空白細胞對照組和陰性對照組(pET-30a表達產(chǎn)物處理組)。然后按照MOI為1接種CPIV3，并于接種后不同時間點收集細胞上清，測定病毒滴度；同時，收集細胞沉淀，利用Western blot檢測CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C和β-actin表達水平。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

山羊IFN-α蛋白序列跨膜區(qū)預(yù)測：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/。收集不同種屬的IFN-α蛋白序列(表2)，利用MegAlign軟件對基因序列對齊，利用GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)的顯著性并作圖。若P<0.05，則判定為差異顯著，并用“*”標識，若P<0.01，則判定為差異極顯著，并用“**”標識。

表2 不同種屬IFN-α蛋白序列信息

2 結(jié) 果

2.1 山羊IFN-α蛋白序列特性分析

山羊IFN-α蛋白全長189aa，NCBI登錄號為NP_001272633.1，預(yù)期分子質(zhì)量約19.4 ku。1～18aa為信號肽，同時有一個糖基化位點，位于101aa。TMHMM軟件預(yù)測其存在一個跨膜區(qū)，位于7～29aa(圖1A)。序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，山羊IFN-α與山羊IFN-α-H蛋白同源性最高，同源性為96.3%，其與牛源及綿羊源IFN-α-H蛋白序列同源性分別為92.1%及93.7%，其與人源、豬源及鼠源IFN-α蛋白序列同源性較低，約為55%至70%，而其與犬源IFN-α蛋白序列同源性最低，僅有52.9%(圖1B、1C)。

A. 山羊IFN-α蛋白跨膜區(qū)分析；B. 不同種屬IFN-α蛋白序列同源性分析；C. 不同種屬IFN-α蛋白序列Clustal V對齊

2.2 山羊IFN-α原核表達、純化及鑒定

將重組質(zhì)粒pET-30a(+)-gIFN-α轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞Rosetta(DE3)，IPTG誘導(dǎo)后收集菌液，超聲破碎并離心后收集上清，進行His鎳柱和親和純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在20 ku處有一明顯的條帶，條帶單一，與預(yù)期重組蛋白的相對分子質(zhì)量一致，其濃度為0.20 mg·mL-1(圖2A)；Western blot結(jié)果顯示，該重組蛋白能與His單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)(圖2B)，證明重組蛋白被成功表達。

A.山羊IFN-α表達與純化；B.Western blot鑒定山羊IFN-α。M.蛋白Marker；1. pET-30a(+)空載體；2. pET-30a(+)-gIFN-α純化產(chǎn)物

2.3 RT-qPCR檢測山羊IFN-α作用MDBK細胞后干擾素刺激因子的表達

山羊IFN-α孵育MDBK細胞后，收集細胞的RNA，RT-qPCR檢測6種ISGs的轉(zhuǎn)錄水平，同時設(shè)置陰性對照組(pET-30a表達產(chǎn)物處理組)及陽性對照組(Poly(I:C)處理組)。結(jié)果如圖3所示，山羊IFN-α孵育細胞后，干擾素刺激因子RSAD2、STAT1、MX1、MX2、ISG15及IFI6的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)，以RSAD2上調(diào)最明顯，表明原核表達的山羊IFN-α可以刺激細胞產(chǎn)生干擾素刺激因子(ISGs)。

**. P<0.01，下同

2.4 山羊IFN-α對CPIV3病毒滴度的影響

CPIV3 JS2013株第8代(P8)以MOI比值為1感染MDBK細胞，感染后3 d滴度達到病毒滴度峰值，約108.0TCID50·0.1 mL-1，表明CPIV3 JS2013株在MDBK細胞中可有效增殖(圖4A)。山羊IFN-α孵育MDBK細胞1 d后，以MOI比值為1感染CPIV3 JS2013株，收集感染后48及72 h的細胞培養(yǎng)上清。TCID50結(jié)果表明，與空白對照相比，pET-30a表達產(chǎn)物不影響CPIV3的復(fù)制，而山羊IFN-α處理的細胞對CPIV3復(fù)制表現(xiàn)出顯著的抑制作用。與陰性對照相比，山羊IFN-α處理組感染后48 h病毒滴度下降98.88%，感染后72 h病毒滴度下降99.47%，表明山羊IFN-α能夠在體外顯著抑制CPIV3對MDBK細胞的感染能力(圖4B)。

A. CPIV3在MDBK細胞中生長曲線； B. 山羊IFN-α抑制CPIV3在MDBK細胞中增殖

2.5 山羊IFN-α對CPIV3病毒非結(jié)構(gòu)蛋白C表達的影響

山羊IFN-α孵育MDBK細胞1 d后，以MOI比值為1感染CPIV3 JS2013株，收集感染后48 h的細胞沉淀，同時設(shè)置空白細胞對照組及陰性對照組(pET-30a表達產(chǎn)物處理組)。Western blot結(jié)果表明，與病毒滴度結(jié)果相一致，山羊IFN-α顯著下調(diào)CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C的表達(圖5)。

A. Western blot分析山羊IFN-α對CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C表達水平；B. CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C與內(nèi)參β-actin間灰度值比

3 討 論

干擾素(IFN)是細胞分泌的一種重要的抗病毒因子[22-23]，目前I型IFN已報道有9個亞型，其中IFN-α 的抗病毒活性最強[24-25]。山羊IFN-α孵育MDBK細胞后，可顯著刺激RSAD2、STAT1、MX1、MX2、ISG15及IFI6等6種ISGs的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，其分別編碼Viperin、STAT1、MX1、MX2、ISG15及IFI6蛋白。其中STAT1是JAK/STAT通路中關(guān)鍵銜接蛋白，而Viperin、MX1、MX2、ISG15及IFI6已報道可顯著抑制CPIV3在MDBK細胞內(nèi)的復(fù)制能力[21, 26]，說明山羊IFN-α通過誘導(dǎo)多種抗病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄表達而從病毒增殖的不同階段抑制CPIV3感染過程。

在針對CPIV3對山羊IFN-α抗病毒效應(yīng)敏感性的研究中，本試驗試圖尋求一種快速、基于抗體的病毒生長檢測方法。副黏病毒的P基因編碼形成相應(yīng)P蛋白及其他多種非結(jié)構(gòu)蛋白[18, 27-28]，其中非結(jié)構(gòu)蛋白是副黏病毒在感染過程中產(chǎn)生的編碼產(chǎn)物，其是否表達可有效區(qū)別活病毒與死病毒，其表達水平能真實反映病毒在感染細胞內(nèi)的的復(fù)制能力[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，山羊IFN-α孵育1 d后可顯著下調(diào)CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C的表達水平，其結(jié)果與病毒滴度變化趨勢相一致，進一步證實山羊IFN-α對CPIV3復(fù)制具有抑制能力。

干擾素作為一種廣譜的抗病毒因子，許多病毒進化出不同策略拮抗JAK/STAT通路抑制下游ISGs的轉(zhuǎn)錄激活。已有研究表明，CPIV3感染宿主細胞后再添加山羊IFN-α，其不具有抗病毒效應(yīng)[20]。而本研究將山羊IFN-α提前孵育細胞后再感染CPIV3，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗病毒效應(yīng)，提示山羊IFN-α對CPIV3感染具有預(yù)防效應(yīng)而不具有治療效應(yīng)，指示在防控CPIV3感染過程中山羊IFN-α的給藥時機至關(guān)重要。

血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，CPIV3在山羊及綿羊群體內(nèi)感染率較高，其中青海及甘肅地區(qū)的抗體陽性率高達70%以上，且其可通過氣溶膠傳播，引起感染動物呼吸道疾病，而目前針對該病原尚無有效的防治策略[19, 30-31]，應(yīng)給予重視并采取以預(yù)防為主的措施。本研究發(fā)現(xiàn)，原核表達的山羊IFN-α孵育MDBK細胞后，可顯著抑制CPIV3的體外復(fù)制，提示其對CPIV3具有較好的預(yù)防作用。同時，山羊IFN-α編碼基因與牛、綿羊等反芻動物的同源基因間同源性達到90%以上，而山羊IFN-α對其他反芻動物疫病病原在體外復(fù)制的影響尚不明確，進一步探索其作為一種廣譜的抗病毒分子的潛能具有較大的臨床意義。

4 結(jié) 論

本研究通過原核表達系統(tǒng)制備的山羊IFN-α，其孵育MDBK細胞可增強ISGs的轉(zhuǎn)錄表達，顯著抑制CPIV3的復(fù)制及非結(jié)構(gòu)蛋白C的表達，為后續(xù)CPIV3的防治提供理論基礎(chǔ)，并擴展了動物源I型干擾素的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和研究資料。