豬繁殖與呼吸綜合征抗病育種研究進展

劉 鈴，王丹丹，崔 凱，馬月輝，蔣 琳*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，青島 266109)

我國是全球規(guī)模最大的生豬養(yǎng)殖國，也是全球最大豬肉進口國，占全球豬肉進口量近四成[1]。豬是我國最重要的經(jīng)濟動物之一[2]，豬肉占我國國內(nèi)豬牛羊禽肉總產(chǎn)量的60%，然而近年來，豬傳染病對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害，如非洲豬瘟、口蹄疫和藍耳病等。其中，藍耳病是指豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，是我國重點防控的一類動物疫病。

1987年PRRS在美國被首次發(fā)現(xiàn)。隨后在1992年美國明尼蘇達州圣保羅舉行的第一屆SIR/PRRS國際研討會上，“豬繁殖和呼吸綜合征(PRRS)”及其病毒“豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)”被正式冠名。PRRSV被歸列為尼多病毒目(Nidovirales)，動脈炎病毒科(Arteriviviridae)，動脈炎病毒屬(Arterivirus)[3]，是一種單股正鏈RNA病毒[4]，具有高度的遺傳多樣性，因此被進一步分為兩種，即PRRSV-1(原歐洲Ⅰ型)和PRRSV-2(原北美Ⅱ型)[5]，每個基因型包含數(shù)千種遺傳和抗原異源毒株。目前研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV只對豬造成感染，主要靶向豬肺泡巨噬細胞(pulmonary alveolar macrophages, PAMs)及其衍生細胞系。由于病死豬呈特征性耳朵發(fā)紺現(xiàn)象，因此該病又被稱為藍耳病。自1995年PRRS在中國爆發(fā)以來，流行毒株復雜多樣，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失。2006年6月爆發(fā)的高致病性藍耳病(HP-PRRS)給我國造成的經(jīng)濟損失高達100億人民幣，成為危害我國乃至全球養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一[6-7]。目前，針對PRRSV的研究尚不夠透徹，疫苗等防治方法有限，導致PRRS治療效果不佳，因此本文旨在回顧并總結目前PRRS抗病育種的研究進展，為深入研究PRRSV致病機制和未來開發(fā)PRRS抗病品種提供理論依據(jù)。

1 臨床癥狀與致病機制

1.1 臨床癥狀與病理變化

PRRS主要表現(xiàn)為嚴重的生殖與呼吸系統(tǒng)癥狀，常引發(fā)高熱、精神沉郁、厭食等癥狀，感染豬群表現(xiàn)高死亡率和高發(fā)病率。不同年齡豬均表現(xiàn)出對PRRS的易感性，但臨床癥狀表現(xiàn)不同，并且對仔豬和懷孕母豬影響最嚴重[8]。仔豬感染后幾乎均會發(fā)病，主要表現(xiàn)為體溫升高、腹瀉、貧血和黃疸，病情發(fā)展到后期皮膚發(fā)紺、呼吸不暢，病死率可達85%[9-10]；母豬急性感染后體溫升高，精神不振，出現(xiàn)心跳、脈搏加速以及呼吸癥狀，懷孕母豬發(fā)病3～5 d后即可終止妊娠，出現(xiàn)流產(chǎn)或早產(chǎn)現(xiàn)象，流產(chǎn)率高達50%～70%，生出的也多為死胎、木乃伊胎等[8]；母豬慢性感染后逐漸消瘦、體質(zhì)變差，且伴隨呼吸癥狀，病程較長者耳朵、四肢發(fā)紺，發(fā)病母豬若缺乏科學護理，會導致病情加重甚至死亡。公豬癥狀較輕，持續(xù)時間短，主要表現(xiàn)為咳嗽、打噴嚏，食欲降低、昏睡、呼吸不暢，并可見精液質(zhì)量下降。

致病豬病理剖檢有明顯病變，氣管及肺部病變最為嚴重，胸腔內(nèi)大量積液[11]。肺部肉眼可見水腫、出血，肺門淋巴結腫大，氣管、支氣管充滿泡沫性物質(zhì)，呈特征性彌漫性間質(zhì)性肺炎和肺水腫[12-13]；脾腫大，邊緣及表面有發(fā)黑、變硬、梗死；腎有腫大，表面有壞死灶，包膜下有大量點狀出血，顏色異常；心臟內(nèi)膜充血，心包內(nèi)大量積液；扁桃體及身體各處淋巴結出血和腫大。細菌性感染常繼發(fā)于PRRS，可在肺、脾、肝等處發(fā)現(xiàn)黏連或菌斑等。

1.2 致病機制

動脈炎病毒科的成員以生物體內(nèi)的特定細胞為宿主，豬是PRRSV已知的唯一動物宿主[14]，PRRSV通過呼吸道、接觸或交配等多種途徑進入豬體內(nèi)，PAMs是其主要靶細胞[15]。感染后PRRSV立即在體內(nèi)大量復制，12 h左右即可進入血液引發(fā)病毒血癥，繼而擴散到全身，感染機體各器官及免疫系統(tǒng)內(nèi)的單核-巨噬細胞，使機體出現(xiàn)臨床癥狀。

經(jīng)證明，硫酸乙酰肝素(heparan sulphate，HS)[16]、CD163(cluster of differentiation 163)和唾液酸黏附素(sialoadhesin，Sn)[17]是介導PRRSV入侵豬肺泡巨噬細胞(PAMs)的主要表面受體[18]。PRRSV在感染靶細胞時，先黏附并聚集于受體細胞表面，通過細胞膜胞吞過程進入受體細胞。HS主要促進PRRSV在PAMs表面的黏附、富集[19]，完成富集后的病毒與Sn共價結合，被內(nèi)吞入受體細胞形成包涵體，并在CD163蛋白的介導下完成衣殼裂解，在胞內(nèi)完成病毒基因組RNA的釋放[17,20]。被釋放的病毒基因組首先在胞內(nèi)合成多種非結構蛋白(non-structural proteins，Nsps)[21]，這些Nsps合成的基因組RNA和信使RNA，用于翻譯為病毒主要結構蛋白和次要結構蛋白，其中最重要的N蛋白與基因組RNA裝配為新的核衣殼復合物[22-23]，經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體包被囊膜蛋白，最終通過胞吐擴散出去，繼續(xù)黏附下一個受體細胞。

PRRSV感染后在機體內(nèi)大量復制，機體呈多種反應。首先，PRRSV復制可引發(fā)體內(nèi)炎性因子活性增強，通過血液循環(huán)到達中樞神經(jīng)體溫調(diào)節(jié)中樞，引發(fā)機體產(chǎn)熱，體溫異常升高。第二，PRRSV引起的肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞死亡脫落，肺部氣體交換功能受損，致使呼吸急促[24]。第三，血液中血紅蛋白含量增多引發(fā)血液循環(huán)異常，致使皮膚出現(xiàn)發(fā)紅發(fā)紺。第四，內(nèi)皮細胞感染還會引發(fā)懷孕母豬的臍動脈炎，造成胎豬營養(yǎng)不良、早產(chǎn)及死胎[25]。此外，PRRSV 對肺部的感染和損害使機體產(chǎn)生免疫抑制，容易引發(fā)例如豬瘟、豬圓環(huán)病毒等其它病毒性或細菌性的繼發(fā)感染[23]，從而進一步增進癥狀的發(fā)展，提高死亡率。

2 豬PRRS抗病育種

抗病性是指動物體內(nèi)抑制入侵病原體生長的能力，它受宿主免疫系統(tǒng)、宿主遺傳和病原體相互作用的影響?？共∮N，是通過定向選擇或改變家畜某個特定基因型以產(chǎn)生對某些疾病具有抗性的新品種。

2.1 豬PRRS抗病性遺傳差異

豬不同品種或種群對PRRS抗性具有天然遺傳差異。1998年，Meng等[26]初次發(fā)現(xiàn)豬對PRRS的抗性具有遺傳差異的證據(jù)，他們發(fā)現(xiàn)與梅山豬相比，杜洛克豬在感染PRRSV后表現(xiàn)出較低的性能以及肺部病變嚴重程度和抗體滴度的增加。Petry等[27-28]發(fā)現(xiàn)瘦肉型豬種(杜洛克和漢普夏)比選育的高繁品系更容易感染PRRSV。Ait-Ali等[29]通過對比5種商業(yè)豬品系發(fā)現(xiàn)，長白豬肺泡巨噬細胞在體外對PRRSV感染具有先天免疫反應。并且在上述研究中發(fā)現(xiàn)CD169、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素(IL)-8的表達水平和分布是影響豬對PRRSV抗性的關鍵因素。這些研究證明PRRS抗性在不同品種或者種群豬之間存在顯著遺傳差異。因此，選擇或培育對PRRSV具有更高抵抗力的新品種豬，以替代常規(guī)抗PRRS療法，是幫助解決疫苗低效和大量使用抗生素問題的有效手段。

2.2 定向選擇

最為常見的抗病育種手段是通過資源庫篩選培育抗逆性和抗病性強的個體，經(jīng)人工選育獲得抗病新品種。但是迄今為止這種基于自然抗性而進行遺傳選擇的成功案例十分有限，PRRS宿主遺傳學聯(lián)盟(PHGC)自2007年成立起，就通過對保育豬進行大型試驗性感染來研究宿主對PRRSV感染反應的遺傳基礎[30]，但是尚未鑒定出對PRRS具有完全天然抗性的豬[31]，這可能是由于病毒具有較高的遺傳多樣性[32-33]。此外，大量證據(jù)表明豬在應對病原體入侵或免疫系統(tǒng)受到挑戰(zhàn)時會發(fā)生遺傳變異[34-36]。因此，可以將選擇后的表型與經(jīng)過篩選追蹤到的SNP位點，在基因型上篩選出編碼對某些病原體具有抗性的候選基因[27]。

最初，數(shù)量性狀基因座(QTL)分析和全基因組關聯(lián)研究(GWAS)用于識別與PRRS表型相關的染色體區(qū)域、相關基因及其關鍵SNP突變位點，然后研究PRRSV感染后抗體反應和差異表達基因(DEG)，通過在易感和抗病豬中的基因表達水平差異來篩選基因。這種技術可能有助于我們更加深入理解宿主與PRRSV的相互作用，對抗病基因型選擇提供新的思路。

2.3 分子遺傳育種

分子生物學和基因工程技術飛速發(fā)展，分子遺傳育種成為豬抗病育種的新方法。PRRS的高致病性和高致死率不僅影響生產(chǎn)效益，對食品安全和公眾健康也具有重大威脅，并且傳統(tǒng)藥物治療和疫苗預防都無法產(chǎn)生良好療效。因此隨著研究不斷深入，PRRSV感染機制逐漸清晰，結合分子遺傳學進行抗病育種的效果更為顯著。近年來，利用RNA干擾(RNAi)、抗病毒酶轉基因技術、基因編輯技術對PRRS抗病進行了研究[37-38]。例如，對已確定的在PRRS發(fā)病機制中占據(jù)關鍵位置的關鍵基因進行修飾。

2014年，Whitworth等[39]首次使用CRISPR/Cas9技術對豬細胞進行基因編輯，生產(chǎn)出敲除CD163的基因編輯豬，并發(fā)現(xiàn)它們能完全抵抗PRRSV分離株NVSL 97-7895的感染[32]，這被視為現(xiàn)代豬育種的一個里程碑。

2.3.1 CD163 CD163是富含半胱氨酸的清道夫受體(SRCR)超級家族的成員，在來自單核細胞/巨噬細胞譜系的細胞上限制性表達[40-41]，僅在活化的組織巨噬細胞中表達。多項研究報道，CD163是PRRSV感染的必需受體[42]，而清道夫受體富含半胱氨酸的結構域5(SRCR5)是病毒識別的核心結構域[43-46]。CD163最主要的一個功能是其作為受體介導的內(nèi)吞作用，將細胞外底物輸送到清道夫細胞的內(nèi)切酶體和溶酶體，以進行細胞內(nèi)代謝和激活配體特異性信號通路，誘導促炎細胞因子的產(chǎn)生[47]。

細胞水平上的研究發(fā)現(xiàn)，在BHK-21、PK-15等多種不易感PRRSV的細胞系中過表達CD163，均使此細胞系對PRRSV變得易感[43,48]，同樣的，易感細胞中CD163下調(diào)，能夠完全阻斷PRRSV感染[49]。2016年，CD163的作用率先在Whitworth等[32]的基因編輯試驗中得到證實，他們利用CRISPR/Cas9技術生成靶向CD163基因SRCR5域敲除豬，該豬對Ⅱ型PRRSV感染具有完全抗性。隨后，許多實驗室針對CD163進行編輯，均產(chǎn)生了多種PRRSV抗性豬。例如，用人CD163L1的SRCR8結構域替換豬CD163的SRCR5域?qū)Β裥蚉RRSV產(chǎn)生了抗性[50]；刪除SRCR5結構域使豬對兩種基因型PRRSV均產(chǎn)生了抗性[51]，抑或是產(chǎn)生了能抗HP-PRRSV的杜洛克豬[52]；還有報道，刪除SRCR5的LBP區(qū)域產(chǎn)生了Ⅱ型PRRSV抗性豬[53]。這些研究充分證明了CD163基因是豬抗PRRS的關鍵基因，有助于產(chǎn)生抗PRRSV的豬新品種，從而減輕豬患病癥狀、充分減少經(jīng)濟損失。

2.3.2 HDAC6 組蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一組能夠誘導組蛋白去乙?；瘉碚{(diào)控一系列生物學效應的酶[54]，包括染色質(zhì)重組、轉錄活化與抑制、細胞分化與調(diào)亡等過程。HDACs通常僅有一個催化結構域，能對細胞核內(nèi)與染色體結合的組蛋白去乙?；?，從而調(diào)控基因的表達。HDAC6是組蛋白HDACs家族一個重要成員，但與普通HDACs不同，結構上，HDAC6蛋白分子含有2個催化結構域和一個鋅指結構域，使其擁有了功能上的特殊性，即除了調(diào)控組蛋白的乙酰化水平外，對胞質(zhì)中非組蛋白例如α-微管蛋白等的去乙?；^程同樣具有調(diào)節(jié)作用，從而對細胞的遷移、抗病毒等方面發(fā)揮重要作用[55-57]。可以通過多種機制阻止病毒入侵[58]、抑制病毒包裝、加速被感染細胞的清除[59]以及促進干擾素表達[60]等過程，實現(xiàn)對多種病毒的抗性。并且，體外及體內(nèi)試驗證實，HDAC6過表達增強了細胞及小鼠抗病毒能力。

有研究者通過體細胞核移植(SCNT)生產(chǎn)出了過表達HDAC6的轉基因豬，并且體外和體內(nèi)試驗均證實了其對PRRSV具有較強的抗性，這種過表達可以穩(wěn)定遺傳至下一代[38]。值得一提的是，HDAC6過表達抑制了由PRRSV感染的MARC-145和PAMs中α-微管蛋白(actub)乙?；缴撸@表明HDAC6和細胞骨架可能確實參與了PRRSV體內(nèi)免疫反應，這為抗PRRS提供了一種全新的思路。

2.3.3 CD169 唾液酸粘附素Sn，又名SIGLEC1或CD169，是一種跨膜蛋白，屬于與免疫球蛋白樣凝集素結合的唾液酸家族。CD169在巨噬細胞上表達，通過與紅細胞、中性粒細胞、單核細胞、NK細胞、B細胞、T細胞等細胞上的唾液酸配體結合，在細胞的相互作用中發(fā)揮作用。

用CD169轉染CD169陰性細胞(例如 PK-15)足以介導病毒內(nèi)化，但細胞與抗CD169單克隆抗體(mAb)一起孵育可阻斷 PRRSV 的結合和內(nèi)化[61]，并且從病毒體表面去除唾液酸或?qū)⒉《九c唾液酸特異性凝集素預孵育也可阻斷感染[62-64]。因此，Van Breedam等[65]基于體外PRRSV表面唾液酸的結合，假設CD169是巨噬細胞表面上PRRSV附著和內(nèi)化為巨噬細胞所需的受體。然而，2013年Prather等[66]的研究結果證明了CD169基因的表達不是感染PRRSV所必需的，并且通過基因敲除引起CD169缺失獲得的豬，在感染PRRSV后發(fā)生PRRSV病毒血癥的程度與野生型豬相似，被證明不具備抗藍耳病的能力。

3 基因組編輯

3.1 基因編輯工具及其優(yōu)勢與局限

基因編輯是一種可以精確修改幾乎任何特定基因序列的生物技術。目前，基因編輯工具主要包括鋅指核酸酶(ZFNs)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)和成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相關蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)3種系統(tǒng)。ZFN制備成本高、技術困難、所需時間長，應用一直較為局限，相比而言TALENs制備過程更簡單，特異性更高[67]。而Cas9蛋白被發(fā)現(xiàn)能在CRISPR RNA(crRNA)引導下造成特異性的雙鏈DNA斷裂(doublestrand break, DSB)，并且可以同時靶向多個位點[68-69]。麻省理工和哈佛大學的張鋒團隊首次展示了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在哺乳動物細胞基因組編輯中的應用，其構建與使用十分簡便，僅需Cas9蛋白和向?qū)NA(sgRNA)，載體構建時間短，基因編輯效率很高[70]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)改變了畜牧業(yè)中轉基因動物生產(chǎn)的困境，其高效、穩(wěn)定、成本低的優(yōu)勢開啟了這項技術在哺乳動物基因組編輯中的應用。

3.2 基因組編輯對豬育種的意義

中國家豬馴化已有近一萬年歷史，對其品種的改良一以貫之。傳統(tǒng)的人工選擇通過雜交培育動物新品種所需周期長、內(nèi)容繁瑣，主要被用于豬生產(chǎn)性能改良。而基因修飾技術的成功建立大大縮短了動物育種時間。與嚙齒類模式動物相比，豬在體型及器官大小、解剖學、生理學和代謝水平等方面均與人更相近，而與非人類靈長動物相比，以豬為動物模型成本低、世代間隔短，胚胎操作技術相對成熟，可以彌補嚙齒動物與非靈長動物作為模式動物的不足。

遺傳修飾育種縮短了產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳新品種豬的時間，并且可以引入物種本身不具有的基因或性狀，是傳統(tǒng)的品種改良無法實現(xiàn)的。在高效的基因編輯技術建立之前，傳統(tǒng)的引發(fā)同源重組的方式效率低，產(chǎn)生的基因編輯豬較少，而基因編輯技術的建立加速了豬新品種制備，在提高產(chǎn)肉量、飼料轉化率、產(chǎn)仔數(shù)、肉質(zhì)以及抗病能力等方面取得了大量成果，這項技術在特定位點引發(fā)的DSB將同源重組概率提高了上百倍[71]，快速影響目標性狀關鍵基因，大大縮短了育種時間。目前，基因編輯在豬育種中主要應用在改良生產(chǎn)性狀和生物醫(yī)學研究兩大方面[72]，而近年來，基因編輯豬的研究為正等待器官移植患者的器官供體提供了更多可能性[73]。

4 PRRS抗病育種的不足與發(fā)展方向

培育抗病豬可能是抵抗PRRS的最終途徑，PRRS抗病品種可以有效降低種群內(nèi)和種群間的感染，進而降低發(fā)病率、提高生產(chǎn)性能和產(chǎn)品質(zhì)量、減少抗生素使用以及增加動物福利。然而，在抗病育種技術發(fā)展的早期階段，社會對基因編輯產(chǎn)品接受程度普遍較低，監(jiān)管薄弱，道德和法律層面也會出現(xiàn)例如專利等許多未知的問題。因此，目前對諸如CD163基因敲除豬等抗PRRS的成功案例，需要更多研究深入驗證其對豬體內(nèi)平衡、防御和免疫等方面的影響?？梢郧宄赖氖?，無論何種技術的應用，都將改善感染豬群的大范圍死亡狀況，對動物福利、生產(chǎn)性能、抗生素使用和消費者保護產(chǎn)生重大影響[74]。

5 結 語

盡管現(xiàn)有的PRRS抗病育種研究還不夠透徹，但與疫苗接種和傳統(tǒng)人工選育的效果相比，它仍具有高效的優(yōu)勢并取得了顯著成果。隨著PRRS致病機制研究的深入、基因編輯技術的準確率和安全性的提高，將有望產(chǎn)生對PRRS具有抗性的新品種豬。