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    SNP芯片評(píng)估柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

    2023-02-27 14:18:36李隱俠牙生江那斯?fàn)?/span>賽里克都曼曹少先王偉列孟春花張建麗
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2023年2期
    關(guān)鍵詞:柯?tīng)柨俗?/a>多態(tài)親緣

    李隱俠,牙生江·那斯?fàn)枺惱锟恕ざ悸?,錢(qián) 勇*,曹少先,王偉列,孟春花,張 俊,張建麗

    (1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所, 南京 210014; 2.新疆克孜勒蘇柯?tīng)柨俗巫灾沃菘酥菪竽莲F醫(yī)局, 阿圖什 845350;3.新疆克孜勒蘇柯?tīng)柨俗巫灾沃菹樘┠翗I(yè)有限公司, 阿圖什 845350)

    柯?tīng)柨俗窝蚴切陆胤教厣d羊品種,以四肢高長(zhǎng)、體型勻稱(chēng)、緊湊而著稱(chēng),具有耐粗飼、抗病和抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)好、風(fēng)味獨(dú)特等優(yōu)良特性[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),柯?tīng)柨俗窝蝮w格較大,周歲公羊平均體重為36.65 kg,體高為64.77 cm,體長(zhǎng)為65.63 cm[3]???tīng)柨俗窝蚬蝮w重與體尺指標(biāo)均大于母羊,且體重與各項(xiàng)體尺相關(guān)性顯著[4]???tīng)柨俗窝蛉獯种?、粗蛋白、不飽和脂肪酸、油酸、亞油酸和微量元?鈣、銅和鐵)含量?jī)?yōu)勢(shì)明顯,重金屬含量低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),在生產(chǎn)有機(jī)食品上具有品種優(yōu)勢(shì)[5-6]。雖然柯?tīng)柨俗窝驈纳鲜兰o(jì)90年代已經(jīng)開(kāi)始選育,但是從未對(duì)其進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)保種、遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)評(píng)估等工作,導(dǎo)致其品種特性退化嚴(yán)重,現(xiàn)有群體遺傳結(jié)構(gòu)不清晰,嚴(yán)重阻礙了柯?tīng)柨俗窝虻馁Y源保護(hù)和利用。

    單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是最早廣泛應(yīng)用于基因組水平的遺傳標(biāo)記基因分型方法,通過(guò)對(duì)群體內(nèi)的個(gè)體進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的SNPs位點(diǎn)分析,得到群體的遺傳多樣性、親緣關(guān)系及家系結(jié)構(gòu)[7-9]。SNP芯片具有密度大、覆蓋廣、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn),是現(xiàn)階段重要的育種工具之一,在豬[10-11]、牛[12-13]、山羊[14-15]上均有廣泛應(yīng)用。利用SNP芯片評(píng)估馬身豬保種群的遺傳結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性豐富,但近交程度高,家系較少,需要從原種場(chǎng)引入新的血統(tǒng),擴(kuò)大保種群數(shù)量,降低近交系數(shù)[10]?;赟NP芯片對(duì)里岔黑豬進(jìn)行遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析,表明里岔黑豬遺傳多樣性豐富,但群體近交現(xiàn)象明顯[11];利用SNP芯片信息評(píng)估新疆近交牛基因組純合度,為新疆近交牛遺傳資源的育種規(guī)劃及未來(lái)該群體的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)[12]?;诟咄縎NP芯片建立了一種可評(píng)估牛早期胚胎染色體質(zhì)量和生產(chǎn)性能的方法,為胚胎牛育種提供了技術(shù)支撐[13],使用60K山羊SNP 芯片分析云上黑山羊的遺傳結(jié)構(gòu),顯示其在基因組水平具備較好的品種一致度和群體穩(wěn)定性,已具備獨(dú)立的品種特點(diǎn)[14];利用50K芯片解析巴基斯坦山羊品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu),為巴基斯坦國(guó)家育種計(jì)劃提供了寶貴的基因庫(kù)[15]。

    ROH(runs of homozygosity)指長(zhǎng)的純合基因型的連續(xù)片段,被定義為來(lái)自同一個(gè)祖先,是使用基因型評(píng)估遺傳多樣性的最新方法[16-18]?;赗OH的基因組近交系數(shù)FROH與基于系譜的近交系數(shù)相比更接近于真實(shí)的近交系數(shù)[19],長(zhǎng)ROH片段反映最近世代發(fā)生過(guò)近交,而短ROH說(shuō)明較遠(yuǎn)世代產(chǎn)生的近交[20-22]。

    新疆克州阿圖什市柯?tīng)柨俗窝蛄挤敝行默F(xiàn)有種公羊31只,能繁母羊1 000余只,其遺傳多樣性、親緣關(guān)系和家系結(jié)構(gòu)并不清晰,不利于后續(xù)保種和選育工作的開(kāi)展。本試驗(yàn)采用高密度SNP芯片對(duì)該柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,為柯?tīng)柨俗尉d羊的保護(hù)、選育及種質(zhì)創(chuàng)新利用等提供分子水平的參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    本研究中柯?tīng)柨俗窝騺?lái)自新疆克州阿圖什市柯?tīng)柨俗窝蛄挤N繁育中心,共采集61頭年齡2~3歲種羊,其中公羊31頭,母羊30頭,所有個(gè)體的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)境條件一致。采集61頭種羊的靜脈血于EDTA抗凝管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 DNA提取和鑒定

    采用磁珠法提取柯?tīng)柨俗窝駾NA,通過(guò)NanoDrop2000、Agilent 2100和Qubit方法測(cè)定基因組DNA的濃度和純度,采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性。

    1.3 柯?tīng)柨俗窝蚧蚪MDNA的SNP分型

    DNA基因組分型在北京康普森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行,采用InfiniumTM Ovine SNP50K Genotyping Array v3芯片進(jìn)行測(cè)序和基因分型。

    1.4 SNP 芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控

    數(shù)據(jù)分析前進(jìn)行重復(fù)樣本的檢測(cè),使用Plink (V1.90)軟件對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為:使用常染色體上的位點(diǎn),最小等位基因頻率(MAF)≥ 0.01,哈代溫伯格平衡檢驗(yàn)P值≥0.000 001,SNP檢出率(call rate)≥90%,個(gè)體檢出率≥90%。

    1.5 柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳多樣性分析

    采用Plink (V 1.90) 軟件對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)算柯?tīng)柨俗窝蛉后w的多態(tài)標(biāo)記比例 (PN)、期望雜合度 (He)、觀察雜合度 (Ho)、多態(tài)性信息含量 (PIC)、有效等位基因數(shù) (Ne) 和最小等位基因頻率(MAF)。

    1.6 柯?tīng)柨俗窝蛉后wROH分析

    使用Plink (V1.90) 軟件計(jì)算柯?tīng)柨俗窝蛉后w中每個(gè)樣本基因組上的長(zhǎng)純合片段ROH,統(tǒng)計(jì)ROH在柯?tīng)柨俗窝蛉后w中的分布、長(zhǎng)度、數(shù)目等,根據(jù)每個(gè)樣本中ROH片段的總長(zhǎng)度占常染色體基因組總長(zhǎng)的比例計(jì)算基于ROH的近交系數(shù)(FROH)[23],采用R軟件(https://www.r-project.org/)繪制FROH小提琴圖。

    1.7 柯?tīng)柨俗窝蛉后wIBS距離矩陣和G矩陣分析

    利用Plink (V1.90) 軟件計(jì)算群體個(gè)體間的狀態(tài)同源性(identical by state, IBS),計(jì)算個(gè)體間的遺傳距離,同時(shí)根據(jù)VanRaden[24]提出的基因組關(guān)系G 矩陣構(gòu)建方法構(gòu)建柯?tīng)柨俗窝蛉后wG矩陣,分析群體個(gè)體間的親緣關(guān)系,并使用R軟件繪制IBS距離矩陣和G矩陣結(jié)果熱圖。

    1.8 柯?tīng)柨俗窝蛉后w家系構(gòu)建分析

    采用MegaX (V10.0)[25]軟件對(duì)質(zhì)控后的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行分析,采用鄰接法 (neighhor-Joining, NJ) 構(gòu)建群體進(jìn)化樹(shù),分析柯?tīng)柨俗窝蛉后w中種公羊的家系結(jié)構(gòu),統(tǒng)計(jì)不同家系種公羊的數(shù)量。

    2 結(jié) 果

    2.1 柯?tīng)柨俗窝駾NA提取和結(jié)果檢測(cè)

    采用磁珠法提取柯?tīng)柨俗畏N公羊和種母羊的靜脈血DNA, 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DNA樣品平均濃度在50 ng·L-1左右,OD260 nm/OD280 nm為1.8~2.0。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DNA條帶清晰,無(wú)拖帶現(xiàn)象,說(shuō)明柯?tīng)柨俗窝蚧蚪MDNA質(zhì)量較好,達(dá)到芯片檢測(cè)要求,可以用于后續(xù)的試驗(yàn)研究(圖1)。

    M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1~61. 柯?tīng)柨俗窝蚧蚪MDNA

    2.2 柯?tīng)柨俗窝蛉后w基因組DNA的SNP分型和質(zhì)控

    使用InfiniumTM Ovine SNP50K Genotyping Array v3芯片對(duì)柯?tīng)柨俗窝蚧蚪MDNA進(jìn)行基因分型和質(zhì)控檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表1。61只柯?tīng)柨俗窝蚬矙z測(cè)到64 734個(gè)SNPs,表明此款芯片適用于分析柯?tīng)柨俗窝蚧蚪M的SNP位點(diǎn);質(zhì)控后的SNPs數(shù)量為56 763,其中1號(hào)染色體上SNPs位點(diǎn)分布最多(6 305個(gè)),24號(hào)染色體上SNPs位點(diǎn)分布較少(845個(gè))(圖2)。

    圖2 柯?tīng)柨俗窝騍NPs在每條染色體上的分布

    2.3 柯?tīng)柨俗窝蛉后w的遺傳多樣性分析

    柯?tīng)柨俗窝蛉后w的遺傳多樣性見(jiàn)表2。SNPs位點(diǎn)的平均多態(tài)信息含量為0.273±0.112, 其中多態(tài)性信息含量在0~0.15之間的SNPs位點(diǎn)較少(占15.6%);多態(tài)性信息含量在0.30~0.45之間的SNPs位點(diǎn)較多(56.9%),27.5%的SNPs位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量處于0.15~0.30之間(圖3A)。具體來(lái)說(shuō),多態(tài)性信息含量在0~0.25之間的SNPs位點(diǎn)有12 419個(gè),占比21.9%,多態(tài)信息含量在0.25~0.5之間的SNPs位點(diǎn)有44 344個(gè),占比78.1%,說(shuō)明柯?tīng)柨俗窝蛉禾幱谥卸冗z傳性。61只柯?tīng)柨俗窝蚬矙z測(cè)到有效等位基因數(shù)為96.567,平均有效等位基因數(shù)為1.583。SNPs位點(diǎn)的多態(tài)性標(biāo)記比例為0.889,此群體的平均期望雜合度和觀察雜合度均為0.368,說(shuō)明現(xiàn)在的柯?tīng)柨俗窝蛉后w無(wú)外源血統(tǒng)的引入和近交現(xiàn)象發(fā)生。平均最小等位基因頻率為0.263±0.147,分布相對(duì)均勻,0.1~0.2占比最少(17.0%),0.4~0.5占比最多(23.0%)(圖3B)。

    表2 柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳多樣性

    A.多態(tài)信息含量分布;B.最小等位基因頻率分布

    2.4 柯?tīng)柨俗窝蛉后w的親緣關(guān)系分析

    2.4.1 ROH分析 61只柯?tīng)柨俗窝蚬矙z測(cè)到200個(gè)ROHs,ROHs在柯?tīng)柨俗窝蛉后w的染色體上均有分布,其中在2號(hào)染色體上分布最多,24號(hào)染色體上分布最少(圖4A)。在61只柯?tīng)柨俗窝蛑校?6只羊的ROH長(zhǎng)度在0~50 Mb之間(圖4B)。在柯?tīng)柨俗窝蛉褐?,長(zhǎng)度1~5 Mb的ROHs最多,占67.5%左右,長(zhǎng)度為15~20 Mb的ROHs最少,占4% 左右 (圖4C)???tīng)柨俗窝蛉后w基于ROH的平均近交系數(shù)FROH為0.008 19±0.018 8,其中D8392的FROH最大為0.115,31只柯?tīng)柨俗喂虻腇ROH為0.004 65±0.008,其中9只公羊的FROH近交系數(shù)為0(圖5)。

    A. ROH在染色體上分布; B. 柯?tīng)柨俗窝騻€(gè)體ROH長(zhǎng)度的分布情況; C. 柯?tīng)柨俗窝虿煌L(zhǎng)度ROH分布

    圖中心的白色點(diǎn)代表群體FROH的中位數(shù),中間黑色方框的上緣和下緣分別為群體FROH的上四分位數(shù)和下四分位數(shù)。小提琴圖的寬窄表示群體FROH的概率密度分布,圖越寬表示處于該水平的樣本數(shù)目越多,反之越少

    2.4.2 基于G矩陣的柯?tīng)柨俗窝蛉后w間的親緣關(guān)系分析 利用全基因組SNPs位點(diǎn)構(gòu)建的G矩陣能真實(shí)反映個(gè)體間的親緣關(guān)系,柯?tīng)柨俗窝蛉后w親緣關(guān)系結(jié)果見(jiàn)圖6,顏色越接近紫色表示親緣關(guān)系越近,G 矩陣結(jié)果顯示柯?tīng)柨俗窝蛉后w間親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

    該圖展示兩兩個(gè)體間的基因組親緣關(guān)系系數(shù),顏色越接近紫色表示親緣關(guān)系越近

    2.4.3 基于IBS距離矩陣的柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳距離分析 61只柯?tīng)柨俗窝蛑g的IBS遺傳距離在0.229~0.307之間,平均遺傳距離為0.294;31只種公羊間IBS遺傳距離在0.229~0.306之間,平均遺傳距離為0.294。柯?tīng)柨俗窝蛉后wIBS距離矩陣的結(jié)果見(jiàn)圖7,結(jié)果顯示柯?tīng)柨俗窝騻€(gè)體間IBS遺傳距離較遠(yuǎn),說(shuō)明此群體近交風(fēng)險(xiǎn)較低。

    該圖展示兩兩個(gè)體間的遺傳距離,顏色越接近綠色表示親緣關(guān)系越近

    2.5 柯?tīng)柨俗窝蛉后w中公羊的家系結(jié)構(gòu)分析

    鑒于公羊?qū)τ谡麄€(gè)群體的重要性,采用MegaX (V10.0) 軟件構(gòu)建柯?tīng)柨俗窝?1只種公羊群體進(jìn)化樹(shù),結(jié)合基因組親緣關(guān)系分析結(jié)果,以公羊間基因組親緣關(guān)系系數(shù)大于等于0.1為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類(lèi)分析,將現(xiàn)有種公羊劃分為25個(gè)家系(圖8),其中家系17包含4只公羊,家系18包含2只公羊,家系20包含3只公羊,其余家系目前均只有1只公羊。

    圖8 基于基因組親緣關(guān)系系數(shù)的柯?tīng)柨俗喂蛉后w進(jìn)化樹(shù)

    3 討 論

    柯?tīng)柨俗窝蚴切陆畠?yōu)良的綿羊品種之一,具有獨(dú)特的形態(tài)特征,但是其遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)尚未得到系統(tǒng)的研究,尤其是在基因組水平上。本研究采用50K高密度SNP芯片技術(shù)檢測(cè)阿圖什市良繁中心柯?tīng)柨俗窝?,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量的全基因組SNPs,并基于這些高質(zhì)量SNPs對(duì)柯?tīng)柨俗窝虻倪z傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn),遺傳雜合度越高,群體的變異越大,雜合度高于0.5表明群體沒(méi)有受到高強(qiáng)度選擇[26]。本研究發(fā)現(xiàn),柯?tīng)柨俗窝蛉后w平均預(yù)期雜合度和觀測(cè)雜合度均為0.368,說(shuō)明此柯?tīng)柨俗窝蛉簾o(wú)血統(tǒng)流失或者外來(lái)血統(tǒng)的引入。趙冰茹等[27]采用9個(gè)微衛(wèi)星檢測(cè)了南疆地區(qū)4個(gè)綿羊品種的平均雜合度,發(fā)現(xiàn)柯?tīng)柨俗窝虻钠骄s合度為0.737,預(yù)期雜合度為0.857,與本研究的結(jié)果相差很大,這可能與微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇有關(guān),也與采樣地區(qū)和樣本量有關(guān)。不同地方綿羊群體的雜合度不同,西藏浪卡子綿羊的觀測(cè)雜合度為0.235,青海山谷型藏羊的觀測(cè)雜合度為0.323[28],甘肅灘羊的觀測(cè)雜合度高達(dá)0.875[29],說(shuō)明不同品種綿羊的群體變異與地域環(huán)境及其選育程度有較大的關(guān)系。

    多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因片段多態(tài)性的常用有效指標(biāo)[30-32], Botstein 等[33]認(rèn)為,對(duì)于微衛(wèi)星位點(diǎn)來(lái)說(shuō),PIC>0.5時(shí)定義為高度多態(tài)位點(diǎn),PIC<0.25時(shí)定義為低度多態(tài)位點(diǎn),PIC位于0.5和0.25之間為中度多態(tài)位點(diǎn),柯?tīng)柨俗窝騍NPs位點(diǎn)的平均多態(tài)信息含量為0.273,但是56.9%的SNPs多態(tài)信息含量分布在0.30~0.45之間,78.1%的多態(tài)信息含量在0.25~0.5之間,說(shuō)明柯?tīng)柨俗窝蛉禾幱谥卸冗z傳[33],且柯?tīng)柨俗窝蛉后w間個(gè)體差異很大。以上結(jié)果顯示,阿圖什良繁中心柯?tīng)柨俗窝蛉后w具有中度遺傳變異,雖然沒(méi)有經(jīng)過(guò)系統(tǒng)選育、合理利用和保種,但是從二十世紀(jì)90年代開(kāi)始對(duì)柯?tīng)柨俗窝蜻M(jìn)行不斷的選育,導(dǎo)致其遺傳變異下降。

    根據(jù)ROH覆蓋的基因組比例評(píng)估近親繁殖系數(shù)被認(rèn)為是檢測(cè)近親繁殖效益的一種強(qiáng)大而準(zhǔn)確的方法[34],也是一種有效的替代譜系近親繁殖的系數(shù)[35-36]。全基因組SNP芯片顯示,通城豬平均ROH長(zhǎng)度為23.7 Mb, 范圍為11.26~69.02 Mb,基于ROH的平均近交系數(shù)為0.04%,表明近交水平較低,研究結(jié)果為制定通城豬的管理和保種策略提供了理論依據(jù)[37]; 用ROH檢測(cè)8個(gè)印度牛品種的遺傳多樣性,表明在較小的本地種群中近交水平達(dá)到臨界狀態(tài),研究結(jié)果為保護(hù)生物多樣性提供了有用的工具[38]。本研究在61只柯?tīng)柨俗窝蛉褐邪l(fā)現(xiàn),91.8 %的ROH長(zhǎng)度在0~50 Mb之間,ROH總長(zhǎng)度較短,且基于ROH的近交程度分析發(fā)現(xiàn),此柯?tīng)柨俗窝蛉后w平均近交系數(shù)為0.008,近交系數(shù)較低。但是隨著保種時(shí)間延長(zhǎng),加上群體規(guī)模局限性和相對(duì)封閉的運(yùn)行模式,近交系數(shù)必然上升[39]。所以在日常管理中應(yīng)該加強(qiáng)系譜檔案的管理,完善配種記錄,避免系譜錯(cuò)誤導(dǎo)致近親繁殖,維持柯?tīng)柨俗窝蛉后w的遺傳多樣性。同時(shí),加強(qiáng)柯?tīng)柨俗窝虮酒贩N選育,進(jìn)一步提純復(fù)壯。

    遺傳距離是指不同種群或個(gè)體間基因差異的程度,是探究物種起源、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和分析群體間親緣關(guān)系的基礎(chǔ),對(duì)育種工作中指導(dǎo)親本選育有重要作用[40]。本研究也分析了柯?tīng)柨俗窝蛉后w間IBS遺傳距離,以此評(píng)價(jià)個(gè)體間的親緣關(guān)系[33]???tīng)柨俗窝蛉后w的IBS平均遺傳距離為0.294 2,31只公羊間平均遺傳距離為0.294 4,說(shuō)明柯?tīng)柨俗窝蚍N公羊和種母羊之間具有適中的遺傳距離[18]。因?yàn)榉N公羊在整個(gè)群體中的重要性,基于31只種公羊的遺傳距離構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),按照親緣關(guān)系小于0.1的標(biāo)準(zhǔn)將種公羊劃分為25個(gè)家系,大部分家系只有1只種公羊,后期應(yīng)注意后代的選育,避免血統(tǒng)流失。而測(cè)序的30只母羊與所有檢測(cè)的公羊血緣關(guān)系都比較遠(yuǎn),可以任意進(jìn)行交配。

    4 結(jié) 論

    本研究基于InfiniumTM Ovine SNP50K Genotyping Array v3芯片分析了柯?tīng)柨俗窝蛉后w的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳多樣性較豐富,群體內(nèi)近交程度低,雖然家系較多,但是每個(gè)家系種公羊數(shù)量太少,需要加強(qiáng)種公羊的后代選育,避免血統(tǒng)流失。

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