CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在老年骨質(zhì)疏松癥中的表達(dá)

張恒林 吳克弟 王聲威 劉景新

海南西部中心醫(yī)院骨科，海南 儋州 571799

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種老年人常見(jiàn)的全身代謝性骨病，以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)損壞、骨脆性增加和極易發(fā)生骨折為主要特征，已成為全球重大的公共健康問(wèn)題[1]。探索一種早期診斷和篩查OP的可靠生物標(biāo)志物對(duì)該病的防治具有重大意義。近年來(lái)研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA(circular RNA, CircRNA)作為重要的分子調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的功能和分化，其突變、過(guò)表達(dá)或缺失與骨代謝疾病密切相關(guān)，有望成為OP的潛在標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。有研究[4-5]指出，CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在OP中存在異常表達(dá)，其通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)和蛋白相互作用參與OP的發(fā)生和進(jìn)展，可能為預(yù)測(cè)OP的發(fā)生及治療提供重要的信息。然而，關(guān)于CircRNA_0001795及CircRNA_0048211對(duì)老年OP診斷及其與骨密度(bone mineral density，BMD)的關(guān)系尚未明確。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)老年OP患者血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211的表達(dá)情況，探討其對(duì)老年OP的診斷價(jià)值及其與BMD的關(guān)系，以期為老年OP患者的診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年12月在海南西部中心醫(yī)院進(jìn)行體檢的老年人350名，男性152名，女性198名，年齡65～87(74.58±9.63)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥65歲，臨床資料完整；(2)生活能自理，全程配合本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕免疫疾病、感染性疾病、血液病、惡性腫瘤以及嚴(yán)重心肺、肝腎、腦血管疾病者；(2)3個(gè)月內(nèi)服用影響骨代謝藥物者；(3)妊娠期、哺乳期女性及精神障礙者。收集所有研究對(duì)象體檢時(shí)的年齡、體質(zhì)量指數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血鈣 (Ca)、鎂(Mg)、磷(P)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、堿性磷酸酶(ALP)、空腹血糖(FBG)及甲狀旁腺素(PTH)水平等資料。本研究對(duì)象自愿參與并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1OP診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南(2017)版》[6]，用T值來(lái)判定骨質(zhì)疏松和骨量情況，T值=(骨密度測(cè)定值-同種族、同性別健康成人的骨峰值)/健康成人骨峰值的標(biāo)準(zhǔn)差。T值≤- 2.5為OP，- 2.5

1.2.2BMD測(cè)定：所有研究對(duì)象均在體檢時(shí)采用美國(guó)GE公司的雙能X線骨密度儀測(cè)定腰椎(L1～4)、股骨頸及全髖骨密度，單位為g/cm2，CV 值為1.0 %。

1.2.3CircRNA_0001795及CircRNA_0048211檢測(cè)：采集研究對(duì)象體檢時(shí)血標(biāo)本3 mL，離心分離血清置于- 70 ℃冰箱保存待測(cè)。使用ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，PCR試劑相關(guān)試劑盒均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，試劑批號(hào):20170625。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time PCR, RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)CircRNA_0001795(上游：5′-AGCTGTGCAATATGACTCG AGTA-3′，下游：5′-TACAGCTGACGAGTACAGTAG-3′)及CircRNA_0048211(上游：5′-AGTCTAGCCA TCTGATGAAGATA-3′，下游：5′-TACGGCATACAGC TGATCCTG-3′)水平，反應(yīng)條件為：95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPADH)為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算CircRNA_0001795及CircRNA_0048211水平。

1.2.4質(zhì)量控制方法：BMD測(cè)定由同一組影像科醫(yī)師嚴(yán)格按照技術(shù)規(guī)范進(jìn)行測(cè)量，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程和試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。資料收集過(guò)程進(jìn)行審核和校對(duì)，最終由雙人雙錄入系統(tǒng)保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基本情況

350名體檢者中骨量正常者占14.0%(49人)，骨量減少者占44.6%(156人)，OP者占41.4%(145人)。>80歲年齡段發(fā)生OP的人數(shù)較多，占62.1%(90/145)。見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象基本情況 (n)Table 1 Basic information of the research objects (n)

2.2 各組臨床資料及指標(biāo)比較

OP組年齡和PTH水平明顯高于骨量減少組和正常組，OP組BMD明顯低于骨量減少組和正常組，OP組和骨量減少組體質(zhì)量指數(shù)明顯低于正常組，OP組和骨量減少組TC水平明顯高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組間其他指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組臨床資料及指標(biāo)比較Table 2 Comparison of clinical data and indicators in each

2.3 各組血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達(dá)水平比較

OP組血清CircRNA_0001795表達(dá)水平為0.31±0.08，明顯低于正常組2.28±0.96(t=16.814，P<0.001)和骨量減少組1.24±0.51(t=11.983，P<0.001)，而且骨量減少組明顯低于正常組(t=12.275，P<0.001)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.613，P<0.001)；OP組血清CircRNA_0048211表達(dá)水平為0.26±0.05，明顯低于正常組1.63±0.58(t=13.907，P<0.001)和骨量減少組0.91±0.40(t=9.728，P<0.001)，而且骨量減少組明顯低于正常組(t=10.116，P<0.001)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.950，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of serum CircRNA_0001795 and CircRNA_0048211 expression levels in each group

2.4 多因素Logistic回歸分析老年OP發(fā)生的影響因素

以是否發(fā)生OP為因變量，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析顯示，年齡(OR=1.684，95%CI：1.163～2.995)、PTH(OR=2.416，95%CI：1.702～5.883)、CircRNA_0001795(OR=3.108，95%CI：2.493～9.428)及CircRNA_0048211(OR=1.942，95%CI：1.335～4.117)是老年OP發(fā)生的影響因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 多因素Logistic回歸分析老年OP發(fā)生的影響因素Table 3 Multivariate logistic regression analysis of influence factor of OP in the Elderly

2.5 CircRNA_0001795及CircRNA_0048211對(duì)老年OP的診斷價(jià)值

以正常組作為對(duì)照組，CircRNA_0001795為0.85及CircRNA_0048211為0.68時(shí)，其診斷OP的曲線下面積(AUC)均大于0.800，二者聯(lián)合診斷老年OP的AUC最大(0.918，95%CI：0.857～0.977)，其準(zhǔn)確性為91.2%。見(jiàn)表4。

表4 CircRNA_0001795及CircRNA_0048211對(duì)老年OP的診斷價(jià)值Table 4 Diagnostic value of CircRNA_0001795 and CircRNA_0048211 for elderly OP

2.6 老年OP患者血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達(dá)水平與BMD的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析顯示，老年OP患者血清CircRNA_0001795表達(dá)水平與BMD呈正相關(guān)(r= 0.804，P<0.001)，CircRNA_0048211表達(dá)水平與BMD呈正相關(guān)(r= 0.775，P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達(dá)水平與BMD的相關(guān)性Fig.2 Correlation between serum CircRNA_0001795, CircRNA_0048211 expression levels and BMD

3 討論

OP是一種全身性骨代謝異常的疾病，主要引起疼痛、骨折和脊柱變形等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅老年人的健康狀況和生活質(zhì)量。OP早期的骨密度變化不大，其早期診斷存在困難。因此，迫切需要尋找新的生物標(biāo)志物來(lái)早期發(fā)現(xiàn)OP。CircRNA是一類具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA成員，參與骨代謝的基因調(diào)控，并通過(guò)上調(diào)或下調(diào)相關(guān)基因表達(dá)，對(duì)破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化、增生、遷移和凋亡產(chǎn)生影響，在OP調(diào)控中發(fā)揮重要作用[7-8]。越來(lái)越多的證據(jù)[9-10]證明，CircRNA不僅可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的代謝，而且對(duì)破骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等方面均起重要的調(diào)控作用，有望成為OP診斷及治療的潛在分子標(biāo)志物。Liu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，OP患者存在CircRNA的差異表達(dá)，其通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞的相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，進(jìn)而參與OP的發(fā)病機(jī)制。Chen等[12]研究表明，CircRNA_0048211可通過(guò)調(diào)控相關(guān)成骨分化基因的表達(dá)來(lái)參與骨代謝的過(guò)程，對(duì)骨的形成或吸收產(chǎn)生影響，是OP發(fā)生的潛在積極調(diào)節(jié)因子。

本研究的350名體檢者中發(fā)生OP者占41.4%，其中>80歲年齡段發(fā)生OP的人數(shù)較多，與付夢(mèng)菲等[13]研究結(jié)果一致。高齡是發(fā)生OP的影響因素，可能是隨著年齡增長(zhǎng)，骨重建功能減退，性激素缺乏導(dǎo)致骨吸收加速，骨量減少，進(jìn)而更易發(fā)生OP。本研究OP組血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達(dá)水平均明顯低于骨量減少組和正常組，而且骨量減少組明顯低于正常組。說(shuō)明CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在老年OP患者中呈低表達(dá)，隨著B(niǎo)MD減少，CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達(dá)水平明顯下降，其可能通過(guò)促進(jìn)骨量減少參與老年OP的發(fā)病過(guò)程。相關(guān)分析也顯示，CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達(dá)水平與BMD均呈正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明CircRNA_0001795及CircRNA_0048211能反映骨量變化狀況，其與老年OP的BMD減少密切相關(guān)，可能參與老年OP的發(fā)生發(fā)展。Zhi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CircRNA作為細(xì)胞信號(hào)和相關(guān)基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控成骨細(xì)胞的代謝和破骨細(xì)胞的分化，在OP的發(fā)生和進(jìn)展起著重要作用。Li等[15]研究表明，CircRNA通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生理和發(fā)育過(guò)程，參與了骨代謝及維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)，對(duì)骨微環(huán)境的細(xì)胞分化、增殖、凋亡和自噬產(chǎn)生影響，從而調(diào)控OP的發(fā)生。

PTH是調(diào)節(jié)人體內(nèi)鈣磷代謝的主要激素，通過(guò)影響其骨密度與骨質(zhì)的微結(jié)構(gòu)，提高對(duì)骨的分解及吸收作用，降低骨量，是老年OP發(fā)生的影響因素。李霞等[16]研究證實(shí)，高水平PTH可使破骨細(xì)胞的數(shù)目和活力增加從而使骨吸收強(qiáng)于骨形成，導(dǎo)致骨溶解，促進(jìn)了OP的發(fā)生與進(jìn)展，是導(dǎo)致OP發(fā)生的主要因素。本研究CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達(dá)水平異常均對(duì)老年OP發(fā)生產(chǎn)生極大影響，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞影響骨代謝有關(guān)[17]。本研究中CircRNA_0001795及CircRNA_0048211對(duì)老年OP診斷均具有一定的價(jià)值，二者聯(lián)合診斷老年OP的AUC最大，其準(zhǔn)確性最高。說(shuō)明CircRNA_0001795及CircRNA_0048211聯(lián)合檢測(cè)對(duì)老年OP的診斷效能較高，可作為診斷老年OP的分子標(biāo)志物。Xiang等[18]研究也表明，CircRNA在OP患者中呈低表達(dá)，對(duì)OP的診斷具有很大的價(jià)值，是一種有前途的無(wú)創(chuàng)性分子標(biāo)志物。

綜上所述，血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在老年OP患者中呈低表達(dá)，其與BMD密切相關(guān)，二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)老年OP診斷具有很好的價(jià)值，可作為診斷老年OP的分子標(biāo)志物。但本研究為單中心的臨床研究，無(wú)法全面評(píng)估CircRNA在老年OP中的長(zhǎng)期變化，未來(lái)仍需進(jìn)一步的深入證實(shí)。