生物鐘基因BMAL1調(diào)控頜骨及全身骨發(fā)育的研究進(jìn)展

胥鵬 唐丁炫 張疆弢

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科一組，貴州 遵義 563000

在人體內(nèi)，晝夜節(jié)律參與并調(diào)控體內(nèi)各項(xiàng)生理活動(dòng)并呈現(xiàn)出以24 h為周期的波動(dòng)，其產(chǎn)生的基礎(chǔ)是生物鐘基因的節(jié)律性表達(dá)。晝夜節(jié)律由中央生物鐘和外周生物鐘組成[1]。外周生物鐘由分子振蕩器維持，包括轉(zhuǎn)錄因子腦和肌肉ARNT樣蛋白1(brain and muscle arntlike 1，BMAL1)、生物鐘循環(huán)輸出蛋白(circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK )、周期蛋白(period，PERs)、隱花色素(cryptochrome，CRYs)、核受體亞家族1組D成員(nuclear receptor subfamily 1 group D members，REVERBs)、RAR相關(guān)的孤兒受體(retinoic acidrelated orphan receptors，RORs)和Dbox結(jié)合蛋白(Dbox binding protein，DBP)[2]。BMAL1與CLOCK在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域形成異源二聚體復(fù)合物并與PER、CRY、REVERB和ROR的E-box元件結(jié)合促使其轉(zhuǎn)錄。PER/CRY復(fù)合物可抑制CLOCK及BMAL1的轉(zhuǎn)錄活性，形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)[3]。此外，ROR和REVERBα的轉(zhuǎn)錄翻譯分別正性或負(fù)性調(diào)控BMAL1基因[4]。DBP的轉(zhuǎn)錄受BMAL1/CLOCK驅(qū)動(dòng)并且與其共同激活PER1的轉(zhuǎn)錄[5]。

正常的晝夜節(jié)律是機(jī)體各項(xiàng)生理功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)的必要因素，晝夜節(jié)律紊亂可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，成骨/破骨細(xì)胞[6]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[7]和髁突軟骨細(xì)胞[8]等均表達(dá)生物鐘基因，并呈現(xiàn)出典型的晝夜節(jié)律性震蕩。晝夜節(jié)律紊亂可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[9]和骨關(guān)節(jié)炎[10]等。此外，晝夜節(jié)律紊亂和鐘基因異?？蓽p緩兒童及青少年生長(zhǎng)發(fā)育速率，造成頜骨發(fā)育不全[11]和機(jī)體發(fā)育遲緩[12]。BMAL1作為生物鐘基因的核心組成部分[13]，由于僅刪除BMAL1基因就足以消除細(xì)胞和整個(gè)動(dòng)物的晝夜節(jié)律，被廣泛用作晝夜節(jié)律分子破壞的模型。因此，研究生物鐘基因BMAL1調(diào)控骨發(fā)育的相關(guān)作用及分子機(jī)制有助于探尋防治頜骨及全身骨發(fā)育障礙的新方法。本文就BMAL1基因調(diào)控頜骨及全身骨發(fā)育的研究進(jìn)展作一綜述，分析生物鐘基因BMAL1調(diào)控骨發(fā)育可能的機(jī)制，探討其在頜骨及全身骨疾病中可能發(fā)揮的作用，以期為尋求新的治療策略提供潛在價(jià)值。

1 BMAL1基因在軟骨發(fā)育中的作用

1.1 BMAL1基因調(diào)控軟骨內(nèi)成骨及軟骨細(xì)胞分化

在哺乳動(dòng)物中，間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞后產(chǎn)生無(wú)血管的軟骨模型，最終礦化成骨，此過(guò)程稱為軟骨內(nèi)骨化，主要出現(xiàn)在下頜骨髁突和四肢骨等處[14]。軟骨內(nèi)骨化異?？蓪?dǎo)致嚴(yán)重的骨骼發(fā)育不良，包括身材矮小和顱面畸形[15]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠髁突軟骨的生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)顯著的晝夜節(jié)律現(xiàn)象，并且可能在白天增殖最為活躍[16]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BMAL1基因在髁突軟骨組織中具有晝夜節(jié)律性震蕩，且振幅隨小鼠年齡增長(zhǎng)而減小[8]。Yu等[17]使用微正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)證實(shí)髁突軟骨中心的骨化具有晝夜變化，并且夜間軟骨內(nèi)骨化代謝相對(duì)活躍。此外，BMAL1-/-小鼠下頜骨髁突的軟骨生成減少和軟骨內(nèi)成骨延遲，并且BMAL1-/-小鼠胎兒出現(xiàn)了顱骨軟骨鈣化不足，下頜骨髁突較小和較短的表征[8]。與此一致的是，Samsa等[18]發(fā)現(xiàn)敲除BMAL1-/-的小鼠生長(zhǎng)板關(guān)閉較早，體型較小等特征。

由于軟骨細(xì)胞分化是骨骼發(fā)育和軟骨內(nèi)骨化的關(guān)鍵過(guò)程，因此在分化過(guò)程中，軟骨細(xì)胞生物鐘的特征和功能非常重要。研究發(fā)現(xiàn)[19]，軟骨細(xì)胞在分化過(guò)程中同樣存在晝夜節(jié)律性，在ATDC5Bmal1:luc細(xì)胞的成軟骨分化過(guò)程中，軟骨細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著增加。而在ATDC5-PER1軟骨細(xì)胞中，堿性磷酸酶活性和軟骨分化標(biāo)志物的表達(dá)均顯著下降[20]。結(jié)果表明，BMAL1能促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化及軟骨形成。此外，隨著B(niǎo)MAL1-/-小鼠年齡的增長(zhǎng)，出現(xiàn)類似早衰的表型[21]。因此，BMAL1的缺失通過(guò)減少軟骨細(xì)胞的序貫分化而抑制軟骨生成和軟骨內(nèi)成骨。

1.2 BMAL1基因調(diào)控軟骨發(fā)育的分子機(jī)制

刺猬信號(hào)通路(Hedgehog，Hh)在哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。敲除小鼠生長(zhǎng)板軟骨的印度刺猬蛋白(India Hedgehog，Ihh)會(huì)降低堿性磷酸酶活性和軟骨細(xì)胞的礦物質(zhì)沉積[22]。Takarada等[20]揭示了在ATDC5-BMAL1軟骨細(xì)胞中，Ihh的表達(dá)明顯增加，表明BMAL1基因可能通過(guò)Hh信號(hào)通路調(diào)控軟骨生成。研究發(fā)現(xiàn)[8]，敲除小鼠BMAL1基因可直接激活Hh信號(hào)的負(fù)性調(diào)控因子受體修補(bǔ)1(patch1，Ptch1)的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)Hh信號(hào)來(lái)抑制髁突軟骨細(xì)胞的增殖和軟骨蛋白的產(chǎn)生。因此，可以合理推測(cè)BMAL1基因可能通過(guò)Hh信號(hào)通路調(diào)控髁突軟骨的發(fā)育。

Runt結(jié)構(gòu)域相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt domain-related transcription factor 2，Runx2)調(diào)控成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化并促進(jìn)骨骼發(fā)育[23]。Runx2對(duì)軟骨膜前體細(xì)胞的成骨分化和骨齡成熟至關(guān)重要，若其發(fā)生雜合突變將會(huì)導(dǎo)致鎖骨顱骨發(fā)育不良，表現(xiàn)為牙齒異常和骨骼發(fā)育遲緩[24]。研究發(fā)現(xiàn)[25]，敲除小鼠軟骨細(xì)胞Runx2后髁突軟骨肥大層消失，軟骨基質(zhì)蛋白多糖和肥大分化相關(guān)蛋白表達(dá)降低，表明Runx2的正常表達(dá)能夠協(xié)調(diào)和維持小鼠髁突軟骨細(xì)胞的分化。Reale等[26]證明小鼠大腦中Runx2表達(dá)具有晝夜節(jié)律性，且在BMAL1-/-小鼠中，Runx2表達(dá)的節(jié)律被消除。因此，可以推測(cè)BMAL1基因可能通過(guò)上調(diào)Runx2表達(dá)從而調(diào)控軟骨細(xì)胞的分化。

新近研究發(fā)現(xiàn)[27]，髁突作為下頜骨重要的生長(zhǎng)區(qū)，存在于低氧微環(huán)境中，條件性敲除小鼠顳下頜關(guān)節(jié)(TMJ)破骨細(xì)胞HIF-1α基因后髁突嚴(yán)重畸形，伴有髁突長(zhǎng)度縮短和纖維軟骨紊亂，其機(jī)制是HIF1α通過(guò)AMPK/TSC2信號(hào)通路加速破骨細(xì)胞形成，介導(dǎo)下頜髁突鈣化軟骨基質(zhì)的降解及軟骨內(nèi)骨化。由于缺氧誘導(dǎo)因子HIF1α與BMAL1都含有相似的PAS結(jié)構(gòu)域[28]，在敲除BMAL1的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞后，HIF1α的表達(dá)明顯下降[10]。因此，BMAL1缺失可能通過(guò)減少HIF-1α表達(dá)造成髁突發(fā)育畸形。

2 BMAL1基因在骨形成中的作用

2.1 BMAL1基因調(diào)控膜內(nèi)成骨及成骨細(xì)胞分化

膜內(nèi)成骨主要發(fā)生于顱腔、上下頜骨及鎖骨等處[14]。研究發(fā)現(xiàn)，處于生長(zhǎng)發(fā)育高峰期的青少年下頜骨中存在強(qiáng)烈的晝夜節(jié)律，并且BMAL1基因在下頜骨中出現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律變化。此外，在青少年下頜骨發(fā)育不良的患者中，BMAL1在下頜骨中的表達(dá)顯著下降，并且晝夜節(jié)律紊亂會(huì)造成小鼠下頜骨的體積和骨量減小[11]。Zhou等[29]通過(guò)敲除小鼠BMAL1基因后發(fā)現(xiàn)，下頜骨骨量和體積明顯減小。Samsa等[18]發(fā)現(xiàn)，BMAL1基因敲除小鼠的股骨骨量顯著減少，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成骨分化減少，此外隨著壽命的延長(zhǎng)而逐漸減少，從而導(dǎo)致長(zhǎng)骨發(fā)育不良。因此，BMAL1基因和晝夜節(jié)律在下頜骨生長(zhǎng)和重塑過(guò)程中發(fā)揮成骨功能。

間充質(zhì)干細(xì)胞存在于多種組織器官中，具有自我更新及多項(xiàng)分化潛能。將靜止的BMSCs暴露在地塞米松中，表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律性震蕩[7]。He等[30]研究表明，BMAL1可能通過(guò)Wnt信號(hào)通路促進(jìn)來(lái)源于BMSCs的成骨細(xì)胞數(shù)量。此外，老年人骨量的減少是由于BMSCs向脂肪細(xì)胞分化所造成的，從而擾亂了成脂-成骨平衡[31]。目前研究表明BMAL1參與BMSCs的成骨分化，且BMAL1水平和BMSCs的增殖活性之間存在正相關(guān)關(guān)系[32]。

2.2 BMAL1基因在調(diào)控骨形成的分子機(jī)制

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在成骨細(xì)胞的成熟過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)[24]，敲除前成骨細(xì)胞中的β-catenin將會(huì)導(dǎo)致成骨分化停滯。Lin等[33]過(guò)表達(dá)BMAL1導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化增加。盡管已有研究[34]證明，β-catenin是BMAL1基因的靶基因，但二者相互作用的具體機(jī)制尚不清楚。新近研究發(fā)現(xiàn)[35]，BMAL1-/-小鼠通過(guò)下調(diào)Rorα或上調(diào)Rev-erbα的表達(dá)來(lái)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，而這可能是BMSCs成骨分化的負(fù)向調(diào)節(jié)的機(jī)制。He等[30]發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)抑制劑Dkk1在誘導(dǎo)成骨過(guò)程中，BMAL1和骨相關(guān)因子的表達(dá)均顯著下降。因此，經(jīng)典Wnt途徑和BMAL1基因在促進(jìn)成骨分化過(guò)程中具有協(xié)同作用。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)是誘導(dǎo)骨形成的重要途徑，并且在哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中對(duì)骨骼的形成具有廣泛的作用[36]。Huang等[37]研究證明，BMAL1過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了成骨相關(guān)基因BMP2表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。Min等[38]研究結(jié)果表明，BMAL1通過(guò)調(diào)節(jié)MC3T3-E1細(xì)胞中BMP2的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。

此外，Zhou等[29]減少小鼠BMSCs和MC3T3-E1細(xì)胞中的BMAL1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OPG蛋白被高度下調(diào)，成骨能力明顯減小。Cha等[39]研究報(bào)道，BMAL1通過(guò)抑制YAP的表達(dá)以促進(jìn)BMSCs的成骨。因此，為基于晝夜節(jié)律介導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞治療和骨組織再生提供了良好的臨床前景。

3 BMAL1基因在骨吸收中的作用

在巨噬細(xì)胞集落刺激因子1(CSF1)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的調(diào)控下，破骨細(xì)胞由來(lái)自造血干細(xì)胞的單核前體細(xì)胞發(fā)展而來(lái)，并與成骨細(xì)胞共同確保骨骼的發(fā)育和持續(xù)重塑[40]。研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞相關(guān)基因組織蛋白酶K(CTSK)和活化T細(xì)胞核因子胞漿1(Nfatc1)表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律性[41]。Xu等[42]通過(guò)特異性敲除小鼠破骨細(xì)胞中BMAL1基因后，破骨細(xì)胞分化減少及高骨量表型。Takarada等[6]發(fā)現(xiàn)BMAL1-/-的小鼠成骨細(xì)胞具有更高的支持破骨細(xì)胞生成的能力。

破骨細(xì)胞在分化過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP3)已被證實(shí)可以抑制小鼠mBMSCs的成骨分化，以確保正常的骨形成過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)[11]，BMAL1的缺失可以通過(guò)p65磷酸化間接上調(diào)MMP3的表達(dá)，而有效促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松及下頜骨發(fā)育不良。因此，MMP3可能是BMAL1的潛在目標(biāo)。骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)通過(guò)阻止RANKL與其受體RANK的相互作用來(lái)抑制破骨細(xì)胞的形成和成熟[43]。研究表明[29]，BMAL1直接與OPG啟動(dòng)子結(jié)合并上調(diào)其表達(dá)，從而抑制下頜骨破骨細(xì)胞的分化。此外，BMAL1的過(guò)表達(dá)抑制了NF-κB通路的活性，恢復(fù)了BMSCs的成骨能力而抑制了其誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的能力[44]。Xie等[45]發(fā)現(xiàn)正畸力可誘導(dǎo)BMAL1表達(dá)增加，增強(qiáng)牙周膜干細(xì)胞中CCL2和RANKL的分泌水平，從而促進(jìn)單核細(xì)胞的募集和破骨向分化，可作為加速正畸牙移動(dòng)和控制病理性骨改建的潛在治療靶點(diǎn)。

4 BMAL1基因的異常表達(dá)與骨疾病

4.1 頜骨發(fā)育不良

頜骨的生長(zhǎng)方式分為膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨。膜內(nèi)成骨主要發(fā)生于上頜骨和下頜骨體，而軟骨內(nèi)成骨則主要發(fā)生于下頜骨髁突軟骨。下頜骨髁突軟骨(mandibular condylar cartilage，MCC)屬于繼發(fā)性軟骨，作為一個(gè)區(qū)域性生長(zhǎng)點(diǎn)，對(duì)顱面部發(fā)育起到繼發(fā)性、適應(yīng)性反應(yīng)，其生長(zhǎng)偏差會(huì)造成下頜畸形、咬合干擾和顳下頜關(guān)節(jié)紊亂，進(jìn)而影響顱面發(fā)育[46]。近年來(lái)，青少年正畸臨床患者比例居高不下，正合手術(shù)仍是面部骨性畸形的主要治療策略，但這種手術(shù)需患者成年后，并且不良反應(yīng)嚴(yán)重。Yu等[8]通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Hh信號(hào)激活劑(SAG)注射液可能通過(guò)GLI1-RUNX2-Ihh信號(hào)軸在軟骨細(xì)胞中增加Ihh表達(dá)，明顯改善青春期前和青春期早期因BMAL1基因敲除引起的下頜骨量減少。因此，SAG可能是預(yù)防青春期及以前面部畸形的潛在候選新治療策略，但青春期以后注射SAG作用不明顯。Zhou等[29]研究報(bào)道，通過(guò)向小鼠腹膜內(nèi)注射外源性O(shè)PG可顯著逆轉(zhuǎn)BMAL1基因敲除對(duì)破骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，從而逆轉(zhuǎn)因BMAL1基因敲除引起的骨丟失，為預(yù)防SMH提供了一種潛在的治療策略。

4.2 骨關(guān)節(jié)炎

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以軟骨基質(zhì)破壞、軟骨下骨硬化、骨贅形成、滑膜炎和關(guān)節(jié)軟骨吸收為特征的全身關(guān)節(jié)疾病[47]。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠OA軟骨細(xì)胞中，Per2表達(dá)升高，而B(niǎo)MAL1表達(dá)顯著降低[48]。通過(guò)靶向消融小鼠軟骨細(xì)胞中的BMAL1消除了其晝夜節(jié)律并導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退化[49]。此外，缺氧和晝夜節(jié)律之間在基因組水平上互相串?dāng)_[50]。HIF-2α誘導(dǎo)與軟骨分化相關(guān)基因以及與軟骨退化相關(guān)基因的表達(dá)，因此，通過(guò)向關(guān)節(jié)內(nèi)注射HIF-2α抑制劑可能是一個(gè)治療骨關(guān)節(jié)炎的策略[51]。近年來(lái)，由于顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(TMJ-OA)可能會(huì)干擾兒童及青少年下頜骨的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致牙頜面畸形而引起了人們的廣泛關(guān)注。Xie等[52]發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂可導(dǎo)致大鼠TMJ出現(xiàn)OA樣損傷，表明晝夜節(jié)律紊亂是TMJ-OA的危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)BMAL1可以減少細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的磷酸化、抑制白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)，進(jìn)而延緩TMJ-OA發(fā)展。此外，He等[53]研究發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度脈沖超聲上調(diào)生物鐘基因PER-2的表達(dá)，抑制TMJ-OA血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)來(lái)減少軟骨中的炎癥因子。

4.3 骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松是一種全身性骨骼疾病，主要發(fā)生于絕經(jīng)后婦女，其特點(diǎn)為骨吸收大于骨形成，最終導(dǎo)致骨折的發(fā)生[54]。隨著社會(huì)的發(fā)展，全天候輪班工作造成晝夜生物鐘紊亂，表現(xiàn)為骨密度降低和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[55]。此外，骨質(zhì)疏松癥還與衰老密切相關(guān)，這與BMAL1基因隨年齡的增長(zhǎng)表達(dá)相一致。BMAL1過(guò)表達(dá)可恢復(fù)BMSCs的成骨能力，抑制了破骨誘導(dǎo)能力，改善了骨代謝和功能，從而延緩骨質(zhì)疏松進(jìn)程。據(jù)報(bào)道[9]，生物鐘基因BMAL1和PERs是骨代謝異常的治療靶點(diǎn)，為臨床上治療骨質(zhì)疏松提供可行的治療思路。新近研究[39]發(fā)現(xiàn)，向老年小鼠股骨內(nèi)注射注入BMAL1過(guò)表達(dá)劑和miR-142-3p抑制劑后，股骨干骺端的再生能力更強(qiáng)，顯示出更多的礦化沉積，并且骨量和骨小梁數(shù)量增加，顯著改善老年小鼠的骨質(zhì)疏松癥。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，BMAL1基因作為生物鐘基因的核心組成部分，廣泛參與并調(diào)控成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的分化及骨形成過(guò)程。BMAL1基因異常表達(dá)可能造成頜骨發(fā)育不良、骨質(zhì)疏松及骨關(guān)節(jié)炎等骨骼疾病。但近年來(lái)BMAL1基因調(diào)控骨發(fā)育的研究也具有一定局限性，有待進(jìn)一步闡明。首先，核心生物鐘基因BMAL1常與CLOCK基因形成異二聚體后才發(fā)揮相應(yīng)效應(yīng)，此外還有CRY和PER的干擾，這也在一定程度上阻礙了對(duì)BMAL1基因功能的認(rèn)識(shí)。其次，生物鐘基因BMAL1依賴性控制成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的信號(hào)通路眾多，需厘清其中的核心信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)探索骨性錯(cuò)合畸形及全身骨病的防治具有深遠(yuǎn)意義。最后，盡管有研究證明了通過(guò)調(diào)控BMAL1基因在骨發(fā)育及代謝疾病的相關(guān)防治方法，但目前通過(guò)靶向生物鐘基因治療骨疾病的研究尚且罕見(jiàn)，需要進(jìn)一步研究其作用。