“脾腎相關(guān)”理論探討脂肪源性外泌體在老年性骨質(zhì)疏松癥中的研究進(jìn)展

秦威城 尚奇 張鵬 張學(xué)來(lái) 張志達(dá) 余翔 梁德 任輝 江曉兵* 沈耿楊*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510405 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510405

老年性骨質(zhì)疏松癥(senile osteoporosis，SOP)及其導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥，在全球醫(yī)療、公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)等領(lǐng)域產(chǎn)生重大的負(fù)面影響，因此如何有效地防治SOP是當(dāng)今人口老齡化社會(huì)迫切需要解決的一個(gè)重要臨床科研課題。應(yīng)用中醫(yī)藥治療SOP是一項(xiàng)我國(guó)獨(dú)具特色的治療方法，且目前基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用皆證實(shí)其治療SOP具有顯著的治療效果[1-2]。但是中醫(yī)藥防治SOP的具體機(jī)制不明確，這在一定程度上對(duì)于其在臨床上的運(yùn)用會(huì)造成限制。

骨骼和脂肪在功能上相互聯(lián)系，這與中醫(yī)學(xué)“脾腎相關(guān)”理論相符[3]。最新研究表明，外泌體作為一種細(xì)胞外囊泡可攜帶多種生物活性分子，在“骨-脂肪 Crosstalk”(即骨與脂肪間存在交互作用的關(guān)系)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。因此，本文基于脾腎相關(guān)理論對(duì)脂肪源性外泌體在SOP中的作用進(jìn)行探討，以期為臨床防治SOP提供新思路。

1 中醫(yī)對(duì)“骨-脂”關(guān)系的認(rèn)識(shí)

腎與骨的關(guān)系最早出現(xiàn)在《黃帝內(nèi)經(jīng)》，其謂：“腎之合，骨也”，這其中是以“肢節(jié)內(nèi)合臟腑”作為理論依據(jù)進(jìn)行闡述。同時(shí)，腎作為五臟六腑中的先天之本，具有儲(chǔ)存和封藏精氣的作用，主骨骼的生長(zhǎng)和化生骨髓，說(shuō)明腎與骨之間有著密不可分的關(guān)系[4]。機(jī)體面對(duì)年齡的增長(zhǎng)，其生理狀態(tài)會(huì)呈現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的改變，《素問(wèn)·上古天真論》對(duì)此進(jìn)行明確的表述，實(shí)則揭示了人生長(zhǎng)發(fā)育的自然規(guī)律。即骨骼依靠腎精的濡養(yǎng)得以生長(zhǎng)發(fā)育，腎精的盈缺是骨健壯與否的關(guān)鍵。令骨骼獲得腎精的濡養(yǎng)則健壯，反之則髓減骨枯。因此，臨床中因?yàn)楣堑牟±碜兓瘜?dǎo)致的多種骨病，如骨痹、骨痿等，應(yīng)首當(dāng)責(zé)之于腎，辨證論治皆不離于腎。故此骨骼的固護(hù)，須依靠腎精的滋養(yǎng)[5]。

中醫(yī)學(xué)對(duì)脂肪相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行記載的古籍可以追溯至《黃帝內(nèi)經(jīng)》，其中的津液學(xué)說(shuō)和膏脂學(xué)說(shuō)以“有膏、有脂、有肉”來(lái)描述人體的組成[6]?！抖Y記·內(nèi)則》中對(duì)于膏脂的論述以“凝者為脂，釋者為膏”進(jìn)行區(qū)分；明代張景岳在《類經(jīng)》里也存在類似的評(píng)說(shuō)，即膏脂二者起源相同，形態(tài)不同。清代張志聰對(duì)于《內(nèi)經(jīng)》的注解中提及，津液經(jīng)由脾胃的運(yùn)化，“溢于外則皮肉膏肥，余于內(nèi)則膏盲豐滿”。結(jié)合中醫(yī)理論可知，膏脂，乃水谷精微經(jīng)由脾胃中焦所化生而成，歸屬津精。

腎藏精，為臟腑陰陽(yáng)之本，先、后天之精皆為腎所儲(chǔ)存及封藏。前者稟受于父母的生殖之精，后者是經(jīng)由脾胃生化產(chǎn)生的水谷之精氣。即膏脂同樣為“后天之精”所化生，身為后天之精的脂肪對(duì)于骨的生長(zhǎng)衰退同樣具有固護(hù)作用。目前鮮有人視脂肪為后天之精進(jìn)行深入分析，本文將首次基于中醫(yī)角度探討脂肪與骨質(zhì)疏松癥間的關(guān)系，以為將來(lái)提供新的研究思路及意義。

2 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)“骨-脂”關(guān)系的認(rèn)識(shí)

在生命過(guò)程中，骨骼的形成需要經(jīng)過(guò)建模和重建的過(guò)程。骨骼建模是骨骼根據(jù)生理狀況或所承受的機(jī)械力而改變形狀或大小的過(guò)程，與此同時(shí)伴行著骨骼重建，以維持骨骼的強(qiáng)度和礦物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡[7]。骨穩(wěn)態(tài)是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等細(xì)胞以及其所處的微環(huán)境構(gòu)成。微環(huán)境中，成骨細(xì)胞[8]和破骨細(xì)胞[9]相互調(diào)控，協(xié)同控制骨量，這對(duì)于持續(xù)性維持骨量的穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用。骨形成和吸收的失衡所引起的骨穩(wěn)態(tài)失調(diào)，進(jìn)而會(huì)誘發(fā)一系列骨代謝相關(guān)疾病，如骨質(zhì)硬化、骨質(zhì)軟化和骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)等[10]。同樣來(lái)源于BMSCs的骨髓脂肪細(xì)胞可能影響骨形成和骨吸收維持的骨穩(wěn)態(tài)平衡。脂肪細(xì)胞是人類骨髓中含量最豐富的細(xì)胞類型之一(15%～70%)[11]，骨髓脂肪細(xì)胞的數(shù)量和大小隨著年齡增長(zhǎng)和骨丟失疾病的發(fā)生(如OP)而發(fā)生明顯的變化[12]。因此，越來(lái)越多的研究開(kāi)始重視骨髓脂肪細(xì)胞在骨重建生理過(guò)程中的關(guān)鍵作用以及這些細(xì)胞與骨丟失疾病的相關(guān)性。

BMSCs作為一種共同的祖細(xì)胞，其嚴(yán)格控制的增殖分化機(jī)制在維持骨穩(wěn)態(tài)中起著尤為關(guān)鍵的作用。由于BMSCs可分化為多種細(xì)胞類型[13]，所以其成骨和成脂分化失衡與病理性骨重建密切相關(guān)[14-16]。相關(guān)研究表明，在包括年齡在內(nèi)的各種病理?xiàng)l件下，大多數(shù)骨丟失的過(guò)程皆存在骨髓脂肪增加[17-18]。

人體衰老過(guò)程中，由于BMSCs的成骨和成脂之間分化的平衡逐漸偏移，導(dǎo)致原本發(fā)生的骨丟失和某些病理過(guò)程將會(huì)伴隨著骨髓脂肪的增加[19]。然而，這種平衡改變的具體機(jī)制尚不清楚?；诋?dāng)前的研究表明，對(duì)比年輕BMSCs，衰老型BMSCs的成骨分化程度明顯降低，證明衰老限制BMSCs在骨再生方面的潛力[20]。同時(shí)，BMSCs的衰老是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，伴隨著代謝、轉(zhuǎn)錄組的遺傳和表觀遺傳調(diào)控以及多條信號(hào)通路的功能變化[21-22]。Hu等[23]通過(guò)篩選年輕和衰老的人BMSCs的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)核小體組裝蛋白1-樣蛋白2(NAP1L2)的表達(dá)上調(diào)與BMSCs衰老和成骨分化降低同時(shí)相關(guān)。隨著年齡的增長(zhǎng)，活性氧和氧化應(yīng)激增加將進(jìn)一步通過(guò)Wnt和PPARγ途徑在老年性骨丟失和脂肪成骨分化中發(fā)揮重要作用[24-25]。PPARγ作為成脂分化的中心轉(zhuǎn)錄因子，能夠抑制成骨細(xì)胞分化。Suo等[26]證明了通過(guò)敲除RNA結(jié)合蛋白Musashi2(MSI2)以增加衰老型BMSCs中PPARγ的表達(dá)，能夠促進(jìn)脂肪生成，抑制成骨。越來(lái)越多的證據(jù)表明，當(dāng)促進(jìn)BMSCs向成骨方向分化時(shí)，同時(shí)存在著B(niǎo)MSCs向成脂分化的減少。諸多因素嚴(yán)格調(diào)控著B(niǎo)MSCs的增殖分化，因此彼此間構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，以精確調(diào)節(jié)BMSCs。臨床和動(dòng)物研究也同樣支持這一觀點(diǎn)，即骨髓脂肪的含量與骨量呈負(fù)相關(guān)[17,27-28]。促進(jìn)脂肪生成的信號(hào)(如噻唑烷二酮[29]、地塞米松[30]和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21[31])抑制成骨，而抑制脂肪生成的信號(hào)(如Wnt10b信號(hào)[32-33])促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。雖然BMSCs的互相調(diào)節(jié)可以解釋隨著年齡增加，脂肪的擴(kuò)張和骨量的減少[17]，但所涉及的特定的作用和信號(hào)通路尚未被明確詮釋。

3 脂肪源性外泌體調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)在SOP中的作用

基于Wnt/β-catenin和PPARγ信號(hào)通路，BMSCs在向成脂或成骨分化的過(guò)程中二者互相拮抗。雖然骨量減少與骨髓腔內(nèi)脂肪增多總是相伴出現(xiàn)，但是由于脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ASCs)易于大量獲取和分離，并且它們具有很高的增殖分化能力，使得脂肪組織成為一種骨組織工程修復(fù)材料[34]。而且ASCs通過(guò)旁分泌作用釋放生物活性因子，可以促進(jìn)骨組織血管生成和成骨細(xì)胞分化[35-36]。

外泌體作為胞外囊泡的一類，具有傳遞細(xì)胞信息、介導(dǎo)機(jī)制調(diào)控的功能。其中包含著豐富的蛋白質(zhì)、DNA、RNA等基因遺傳物質(zhì)，外泌體內(nèi)含物的種類和數(shù)目由遺傳基因和所處的內(nèi)環(huán)境雙方面決定，不同細(xì)胞分泌的外泌體之間的功能也隨之不同[37]。外泌體基于Wnt/β-catenin、RANKL等機(jī)制調(diào)控著骨穩(wěn)態(tài)，對(duì)于BMSCs、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的增殖分化起著至關(guān)重要的作用。Wei等[38]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-424-5p的外泌體能夠通過(guò)WIF1/Wnt/β-catenin通路抑制BMSCs的成骨分化，提示miR-424-5P可能是治療OP的一個(gè)生物標(biāo)志物。目前，運(yùn)用外泌體治療OP逐漸引起人們的關(guān)注，并且已有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行探討和綜述[39-41]。進(jìn)一步研究表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體(ASCs-exo)能促進(jìn)人成骨細(xì)胞的增殖和成骨分化[42]。當(dāng)用TNF-α預(yù)處理ASCs時(shí)，ASCs-exo中Wnt-3a的含量增加，并且抑制Wnt信號(hào)降低了在TNF-α預(yù)處理的ASCs條件培養(yǎng)液中成骨基因的表達(dá)水平。說(shuō)明ASCs-exo特別是以TNF-α預(yù)處理的ASCs-exo為替代干細(xì)胞直接移植進(jìn)行骨修復(fù)和再生提供了一條具有較大前景的途徑。而且ASCs-exo可拮抗缺氧加血清剝奪(H/SD)方法誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡和破骨細(xì)胞生成，提示了ASCs-exo具有治療SOP的潛力[43]。因此，ASCs-exo具有促進(jìn)增殖和抑制凋亡等多種功能，在無(wú)細(xì)胞治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

ASCs-exo通過(guò)上調(diào)早期炎癥和增強(qiáng)血管生成，起著促進(jìn)脂肪生成的作用，并增加膠原合成水平，在組織修復(fù)和再生中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[44]。Lv等[45]利用胞外miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)顆粒的天然可用性和生物相容性，通過(guò)電穿孔將miR-21-5p負(fù)載到ASCs-exo中。進(jìn)而ASCs-exo在體外通過(guò)Wnt/β-catenin通路促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移，在體內(nèi)通過(guò)促進(jìn)再上皮化、膠原重塑、血管生成和血管成熟而促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。這項(xiàng)研究的結(jié)果將為應(yīng)用ASCs-exo傳遞藥物物質(zhì)和開(kāi)發(fā)用于傷口愈合治療的無(wú)細(xì)胞療法奠定基礎(chǔ)。另一研究表明，ASCs-exo在轉(zhuǎn)基因小鼠源性阿爾茨海默病體外模型中具有調(diào)節(jié)作用，可以作為一種治療方式以防止淀粉樣β蛋白肽誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡和阿爾茨海默病的進(jìn)一步惡化[46]。同時(shí)，Rosanna等[47]發(fā)現(xiàn)ASCs來(lái)源的外泌體mRNAs和miRNAs可顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的神經(jīng)突起生長(zhǎng)，這可能是以后干預(yù)神經(jīng)修復(fù)中的一個(gè)有用輔助手段。然而脂肪源性外泌體調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的具體機(jī)制尚未被闡明，值得進(jìn)一步探討。

4 脂肪源性外泌體調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)探討脾腎相關(guān)的機(jī)制

SOP屬中醫(yī)學(xué)“腰痛、痹病、骨痿”范疇，其病位在骨骼，同時(shí)與腎脾相關(guān)，病因病機(jī)多為腎虛、脾虛、血瘀。腎主骨生髓，為先天之本，脾主肌肉、充四肢，為后天之源，二者相互資生，穩(wěn)定正常生理功能。隨著年齡的增長(zhǎng)，人體五臟六腑功能開(kāi)始逐漸衰退，外形可見(jiàn)骨枯肉削，其中脾腎虛損為SOP病機(jī)所在。在人體自然衰老過(guò)程，《素問(wèn)·上古天真論篇》云：“五七，陽(yáng)明脈衰……五八，腎氣衰”，可見(jiàn)五臟皆衰的產(chǎn)生首見(jiàn)于脾腎。說(shuō)明SOP主要病機(jī)為脾腎不足，骨削肉減，髓空骨枯，骨肉不親。

脾主運(yùn)化水谷精微，生化氣血以濡養(yǎng)機(jī)體，因此全身臟腑組織的濡養(yǎng)和能量來(lái)源，都依賴于脾胃中焦的水谷運(yùn)化。隨著年齡的增長(zhǎng)，人的脾胃功能開(kāi)始衰退。脾主肌肉，若脾胃虛衰，則肌肉筋骨失去濡養(yǎng)?！镀⑽刚摗て⑽竸偎フ摗分赋觯骸捌⒉t下流乘腎……是為骨蝕”，說(shuō)明脾氣虧虛，亦當(dāng)損及腎。腎虛精虧，骨髓空虧，進(jìn)一步加重SOP的發(fā)生發(fā)展。《醫(yī)經(jīng)精義》中提及骨為腎之合，髓為腎精所生。腎-髓-骨關(guān)系密切，腎精充盈則髓充盈，髓充盈則骨強(qiáng)健。腎主骨生髓，為先天之本，與骨的生長(zhǎng)發(fā)育密切不可分。若骨得髓養(yǎng)，則強(qiáng)健有力；若氣血無(wú)源，肌肉失養(yǎng)，亦見(jiàn)骨痿。人體老齡化導(dǎo)致的脾虛腎虧，使得先后天之精不足以濡養(yǎng)固護(hù)骨骼。

當(dāng)前對(duì)于SOP脾腎虧虛證患者中外泌體的相關(guān)研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。不過(guò)在其他疾病中，已有學(xué)者將脾腎虧虛證與外泌體間的關(guān)系進(jìn)行探討及研究。比如，伍琴[48]在早發(fā)性卵巢功能不全腎虛血瘀證的患者中發(fā)現(xiàn)外泌體數(shù)量較正常組少，這證實(shí)外泌體可能與腎虛血瘀證的卵巢功能損傷相關(guān)。同時(shí)，在脾虛證的整體內(nèi)環(huán)境下，外泌體中的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA-4)可通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN/CD44信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌的增殖、自我更新和轉(zhuǎn)移[49]。因此，脾腎虧虛所導(dǎo)致的SOP與外泌體，二者同樣可能存在一定的關(guān)聯(lián)，值得進(jìn)一步闡述。

骨髓脂肪與骨量的關(guān)系和ASCs-exo的促進(jìn)骨形成作用，這兩個(gè)看似矛盾的聯(lián)系，恰好符合中醫(yī)脾腎相關(guān)理論。從骨的角度來(lái)看，先后天之精所帶來(lái)的功能與分子生物學(xué)的BMSCs和ASCs的功能相似。有學(xué)者認(rèn)為，骨髓為中醫(yī)所指的先天之精，而脂肪為后天之精，在二者中起關(guān)鍵作用的當(dāng)屬BMSCs和ASCs，且都具備發(fā)展成骨細(xì)胞的性質(zhì)。隨著老年的到來(lái)，腎中精血漸虧，精虧髓減，先天不足，則后天失養(yǎng)。進(jìn)一步導(dǎo)致脾虛難以運(yùn)化，后天之精逐漸匱乏，使得先后天之精不足以濡養(yǎng)固護(hù)骨骼。隨之帶來(lái)的是ASCs的減少，ASCs-exo對(duì)于骨穩(wěn)態(tài)中促進(jìn)骨形成的成骨作用間接性降低，而機(jī)體骨骼內(nèi)的成脂作用將相對(duì)增加。脾腎虧虛導(dǎo)致的一系列變化，會(huì)引起SOP的發(fā)病率增加。因此，基于ASCs-exo調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，將為脾腎相關(guān)理論的補(bǔ)腎健脾方防治SOP提供一個(gè)新的治療思路以及分子靶點(diǎn)。

綜上所述，面對(duì)人口老齡化所帶來(lái)的SOP患病率逐年增加的情況[50]，尋找安全、高效的療法值得進(jìn)一步探索。雖然中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“骨-脂”關(guān)系存在差異，但卻有一定聯(lián)系性，中西醫(yī)理論的融合有助于深入了解SOP的發(fā)病機(jī)制。通過(guò)對(duì)SOP的發(fā)病機(jī)制結(jié)合中醫(yī)脾腎相關(guān)理念進(jìn)行探討，為中醫(yī)藥補(bǔ)腎健脾方治療SOP的治療靶點(diǎn)提出新的理論。目前ASCs-exo調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的機(jī)制還處于研究階段，仍然需要對(duì)其具體的機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。