UPLC-MS/MS法測(cè)定牛奶和豆乳中百草枯和敵草快的殘留量

莫 楠，張立佳，劉麗君，高玉杰，謝瑞龍，呂志勇，李翠枝

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

百草枯和敵草快均為聯(lián)吡啶類季銨鹽[1]，是一種速效接觸型滅生性除草劑，與土壤接觸會(huì)迅速鈍化，對(duì)根莖類作物無(wú)效[2]。百草枯和敵草快極易溶于水，在酸性溶液和中性溶液中穩(wěn)定，在堿性溶液中易分解[3]。百草枯和敵草快具有很強(qiáng)毒性，其中尤以百草枯毒性最強(qiáng)，且尚無(wú)特效治療方法[4-5]。百草枯和敵草快的廣泛使用使其在動(dòng)物性食品中再殘留概率大大增加，我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定，生乳中百草枯限量值為0.005 mg/kg，敵草快限量值為0.01 mg/kg。長(zhǎng)期食用帶有毒性殘留物的食品對(duì)人體健康極易產(chǎn)生不良影響，因此，建立準(zhǔn)確高效的檢測(cè)方法尤為重要。

目前，對(duì)于百草枯和敵草快的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[6-8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9-10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-12]、氣相色譜法[13-14]。其中氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)最為普遍，但兩種檢測(cè)方法都存在百草枯沸點(diǎn)偏高而難以裂解和氣化的缺點(diǎn)，同時(shí)前處理操作過(guò)于繁瑣[15]。液相色譜法目前主要有反向色譜法和依托于親水作用色譜柱法，這一方法優(yōu)點(diǎn)在于可以實(shí)現(xiàn)堿性化合物的保留，同時(shí)又無(wú)需加入離子對(duì)試劑，但此方法也存在定性能力差、靈敏度偏低等缺點(diǎn)[16]。而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有選擇性好、背景干擾少、靈敏度高等特點(diǎn)，作為確證方法最為合適[17-18]。

已報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)方法和文獻(xiàn)中，牛奶中敵草快和百草枯單獨(dú)測(cè)定或同時(shí)測(cè)定的極為少見。目前已報(bào)道的研究中多以糧谷、果蔬、水和生物樣本為主，提取條件復(fù)雜且效率不高[19-21]。已有文獻(xiàn)中，絕大多數(shù)采用純有機(jī)試劑或酸化有機(jī)試劑來(lái)進(jìn)行樣品提取，這樣的提取方法并不適用于牛奶和豆乳這類液體樣品中百草枯和敵草快的提取，同時(shí)，凈化條件也大多選用固相萃取小柱或固相填料進(jìn)行樣品凈化，但這兩種凈化方式會(huì)對(duì)牛奶和豆乳中的目標(biāo)物產(chǎn)生吸附作用，嚴(yán)重影響回收率[22-24]。本研究提出了先對(duì)樣品進(jìn)行酸化，使用甲醇沉淀蛋白，再加入正己烷除去脂類的方法，去除掉繁瑣的凈化方法，方便高效地改善了目標(biāo)物的提取效率。本研究旨在開發(fā)一種簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確測(cè)定牛奶和豆乳中百草枯和敵草快殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，對(duì)保障食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

敵草快二溴鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（C12H12Br2N2）（純度≥99.0%）、百草枯二氯鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（C12H14Cl2N2）（純度≥99.0%）、敵草快-d4（C12H8D4Br2N2）（純度≥99.0%）、百草枯-d8（C12H6CL2N2D8）（純度≥99.0%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；Milli-Q超純水、乙腈（質(zhì)譜純）：德國(guó)Merck公司；甲醇（色譜純）：科隆化學(xué)品有限公司；甲酸（質(zhì)譜純）：天津市沃爾孚科技發(fā)展有限公司；甲酸銨（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；WCX（3 mL，60 mg）固相萃取柱、HLB（3 mL，60 mg）固相萃取柱、C18（3 mL，60 mg）固相萃取柱、EMR-Lipid（3 mL，300 mg）固相萃取柱、PRIME HLB（3 mL，60 mg）固相萃取柱：美國(guó)Waters公司；牛奶、豆乳：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Biofuge Stratos低溫高速離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；Waters TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）（配備電噴霧離子源）：美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取方式

方式①：稱取5 g（精確到0.01 g）均勻試樣（牛奶、豆乳），置于50 mL具塞離心管中，加入混合同位素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1 μg/mL）75 μL，混合均勻，并加入50 μL甲酸混勻后超聲20 min，渦旋震蕩5 min。加入10 mL甲醇渦旋振蕩5 min后，15 000 r/min條件下4 ℃離心10 min待凈化。

方式②、方式③：分別按照參考文獻(xiàn)[25-26]中的提取方法。

1.3.2 樣品凈化

將待凈化液通過(guò)固相萃取小柱及正己烷凈化（取1.2 mL上清液于塑料離心管中，加入0.3 mL正己烷，渦旋30 s，4 ℃、23 000 r/min離心10 min，吸取適量下層清液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾），接取固相萃取小柱流出液，選擇WCX、HLB、C18、EMR-Lipid、PRIME HLB柱以及正己烷進(jìn)行凈化試驗(yàn)，考察在不同的凈化方式對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物平均回收率的影響。

1.3.3 色譜條件

Acquity UPLC BEH HILIC色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A為150 mmol/L甲酸銨溶液，B為乙腈；流速：300 μL/min；洗脫條件：0～3 min，40%A。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子模式；毛細(xì)管電壓：0.9 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/Hr；碰撞室氣流量：0.18 mL/min；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 百草枯和敵草快檢測(cè)的質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrum conditions for paraquat and diquat determination

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按所需上機(jī)濃度準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.6 定性定量方法

定性：根據(jù)保留時(shí)間和離子的相對(duì)豐度定性。

定量：采用內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3.7 基質(zhì)效應(yīng)分析

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：選擇5份空白樣品，采用本實(shí)驗(yàn)的前處理?xiàng)l件對(duì)樣品進(jìn)行提取、凈化后，制備空白基質(zhì)溶液。精密量取百草枯和敵草快混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液至不同的進(jìn)樣小瓶中，分別用空白基質(zhì)溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度依次為0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用UPLC-MS/MS測(cè)定，以響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取百草枯和敵草快混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液至不同的進(jìn)樣小瓶中，分別用甲醇-1%甲酸水溶液（2∶1，V∶V）稀釋，配制成質(zhì)量濃度依次為0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用UPLC-MS/MS測(cè)定，以響應(yīng)值（y）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)[27-28]，其計(jì)算公式如下：

1.3.8 百草枯和敵草快含量的測(cè)定

待測(cè)樣品中百草枯和敵草快的殘留量按式（1）計(jì)算：

式中：X為待測(cè)樣品中目標(biāo)物殘留量，mg/kg；C為待測(cè)樣品中目標(biāo)物上機(jī)質(zhì)量濃度，ng/mL；V為樣液定容體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為待測(cè)樣品質(zhì)量，g。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

使用waters MassLynx v4.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，采用Origin 8.0繪圖，采用Microsoft Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取方式選擇

百草枯和敵草快極易溶于水，在酸性溶液和中性溶液中穩(wěn)定，在堿性的溶液中不穩(wěn)定，易分解。所以在前處理過(guò)程中選擇在酸性條件下進(jìn)行提取。依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[29]，采用95%乙醇溶液進(jìn)行提取，并不適用于牛奶和豆乳基質(zhì)，凈化程度和提取效率無(wú)法滿足檢測(cè)需求，故重新對(duì)提取溶液進(jìn)行了選擇。在相同稱樣量的條件下，分別使用該實(shí)驗(yàn)方式（方式①）；甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液（1∶9，V/V）[26]（方式②）和甲酸-乙腈-水（5∶25∶70，V/V）[25]（方式③）作為提取溶液進(jìn)行相同濃度添加回收實(shí)驗(yàn)對(duì)比，比對(duì)結(jié)果采用外標(biāo)法進(jìn)行回收率計(jì)算，結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取方式對(duì)2種農(nóng)藥回收率的影響Fig.1 Effects of different extraction methods on recovery rates of two kinds of pesticides

由圖1可知，采用甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液和甲酸-乙腈-水溶液提取百草枯回收率均低于30%。百草枯和敵草快以離子的形式存在于水中，在pH＜7的溶液中比較穩(wěn)定，同時(shí)酸性條件可以促進(jìn)百草枯和敵草快的離子化，使其更容易由樣品中遷移至水中，因此選擇在稱取樣品中加入甲酸混勻后振蕩并超聲進(jìn)行提取，促進(jìn)目標(biāo)物離子化并溶于水中[30]。后加入甲醇，進(jìn)一步提取目標(biāo)物和沉淀蛋白，避免因直接加入甲醇，而使樣品蛋白沉淀過(guò)快，影響目標(biāo)物的離子化而導(dǎo)致提取效率降低。本實(shí)驗(yàn)提取方法在保證回收率接近100%的提取效率的同時(shí)，又能夠達(dá)到很好的沉淀蛋白的效果，適用于對(duì)牛奶和豆乳基質(zhì)的提取處理。

2.2 樣品凈化條件選擇

選擇WCX、HLB、C18、EMR-Lipid、PRIME HLB柱以及正己烷進(jìn)行同一濃度添加回收實(shí)驗(yàn)，采用本實(shí)驗(yàn)提取條件，上清液通過(guò)固相萃取小柱凈化，接取固相萃取小柱流出液，過(guò)濾后上機(jī)，沒有發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物，結(jié)果表明目標(biāo)物已被固相萃取小柱吸附。后對(duì)固相萃取小柱進(jìn)行洗脫，氮吹復(fù)溶上機(jī)，測(cè)定回收率，比對(duì)結(jié)果采用外標(biāo)法進(jìn)行回收率計(jì)算，結(jié)果見圖2。

圖2 不同凈化方式對(duì)2種農(nóng)藥回收率的影響Fig.2 Effects of different purification methods on recovery rates of two kinds of pesticides

由圖2可知，各固相萃取小柱填料均會(huì)對(duì)牛奶和豆乳基質(zhì)中百草枯和敵草快產(chǎn)生吸附，且難以洗脫，絕對(duì)回收率均低于30%，正己烷處理?xiàng)l件下回收率高，故選擇不使用固相萃取小柱凈化，而采用正己烷除去脂肪的方式進(jìn)行凈化。此凈化方式可有效的去除提取液中的弱極性物質(zhì)，在保證目標(biāo)物絕對(duì)回收率的同時(shí)，最大可能的去除提取液中的干擾物，方便經(jīng)濟(jì)高效。

2.3 流動(dòng)相濃度的選擇

由于百草枯和敵草快的強(qiáng)極性和正電荷，極易吸附在色譜柱上，并且難以洗脫，所以選用甲酸銨緩沖液作為流動(dòng)相洗脫，甲酸銨可以起到加快出峰的同時(shí)增強(qiáng)目標(biāo)物的儀器響應(yīng)的作用，而這種影響與甲酸胺溶液濃度有著密切關(guān)系，故對(duì)甲酸銨的濃度進(jìn)行優(yōu)化。百草枯和敵草快均屬于堿性化合物，需要酸性條件對(duì)峰型進(jìn)行優(yōu)化。以百草枯為例，選擇在pH=3.7條件下，分別對(duì)10 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、120 mmol/L、150 mmol/L、160 mmol/L不同濃度甲酸銨緩沖液進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在甲酸銨濃度為150 mmol/L和160 mmol/L時(shí)，可以得到較優(yōu)的峰型，而甲酸銨濃度為160 mmol/L和為150 mmol/L時(shí)目標(biāo)物峰型無(wú)明顯變化，故最終選擇150 mmol/L甲酸銨水溶液作為流動(dòng)相。

圖3 不同濃度甲酸銨對(duì)百草枯出峰的影響Fig.3 Effect of different concentration of ammonium formate on the peak of paraquat

2.4 進(jìn)樣小瓶的選擇

因?yàn)椴煌瑥S家的進(jìn)樣小瓶生產(chǎn)工藝存在差異，對(duì)目標(biāo)物的影響也會(huì)不同，所以選擇不同品牌的進(jìn)樣小瓶進(jìn)行比對(duì)。使用空白基質(zhì)溶液配制成相同濃度曲線標(biāo)點(diǎn)，加入到兩個(gè)不同廠家生產(chǎn)的玻璃進(jìn)樣小瓶中及塑料小瓶中，靜置20 min后進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，兩種品牌玻璃進(jìn)樣小瓶中，敵草快和百草枯的濃度均有明顯的下降。因?yàn)椴ＡнM(jìn)樣瓶?jī)?nèi)表面的自由離子溶解在樣品溶液中，會(huì)暴露出玻璃表面活性位點(diǎn)，而百草枯和敵草快在溶液中均以離子化狀態(tài)存在，會(huì)與玻璃表面活性位點(diǎn)吸附，導(dǎo)致目標(biāo)物濃度降低，因此玻璃進(jìn)樣瓶并不適用于百草枯和敵草快的儲(chǔ)存。又因?yàn)樗芰线M(jìn)樣小瓶不存在內(nèi)表面暴露可與目標(biāo)物結(jié)合的的活性位點(diǎn)的問(wèn)題，不會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物在樣液的儲(chǔ)存過(guò)程中產(chǎn)生損失，最終選擇塑料材質(zhì)進(jìn)樣瓶供上機(jī)檢測(cè)使用。

2.5 色譜柱的選擇

選取常用的UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、UPLC BEH HILIC柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，使用HILIC色譜柱的目標(biāo)物峰型最為理想，因百草枯和敵草快極性強(qiáng)，在C18和T3色譜柱上難以保留，而目標(biāo)物在HILIC色譜柱上可以很好的被保留，出峰時(shí)間適中，峰型和分離效果明顯優(yōu)于前兩款色譜柱，因此，最終選定HILIC柱作為分離色譜柱。

圖4 不同色譜柱對(duì)百草枯和敵草快出峰的影響Fig.4 Effect of different chromatographic column on the peak of paraquat and diquat

2.6 基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

樣品中含有多種物質(zhì)，如乳糖、無(wú)機(jī)鹽、磷脂等都可能會(huì)對(duì)目標(biāo)物在離子源中的電離產(chǎn)生影響，無(wú)論是抑制還是增強(qiáng)目標(biāo)物的電離，都會(huì)對(duì)定量目標(biāo)物的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，所以需要對(duì)牛奶和豆乳的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察，以確保檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。針對(duì)不同基質(zhì)樣品，選取具有代表性的空白基質(zhì)樣品對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考查。用每種空白基質(zhì)分別配制標(biāo)準(zhǔn)工作液并繪制工作曲線與前處理的提取溶液體系相近的甲醇-1%甲酸水溶液（2∶1，V/V）溶液配制的相同濃度點(diǎn)采用外標(biāo)法所繪制的工作曲線相比較，基質(zhì)抑制效應(yīng)極其明顯。后使用每種空白基質(zhì)采用內(nèi)標(biāo)法分別配制標(biāo)準(zhǔn)工作液并繪制工作曲線與用甲醇-1%甲酸水溶液（2∶1，V/V）溶液配制的相同濃度點(diǎn)采用內(nèi)標(biāo)法所繪制的工作曲線相比較，二者曲線斜率做比值，比值大于100%的存在基質(zhì)增強(qiáng)作用，小于100%的存在基質(zhì)抑制作用，不利于目標(biāo)物電離。牛奶和豆乳的基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 各種樣品的基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of matrix effects of all samples

由表2可知，兩種基質(zhì)中百草枯有明顯的基質(zhì)抑制作用，而敵草快的影響得到了很好的削弱。推測(cè)這一現(xiàn)象是因?yàn)榕Ｄ毯投谷榭瞻谆|(zhì)對(duì)百草枯的外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)的離子化影響不一致導(dǎo)致。為避免基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)物定量的影響，在繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)，應(yīng)選用內(nèi)標(biāo)定量和基質(zhì)曲線相結(jié)合的方法進(jìn)行配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，以達(dá)到準(zhǔn)確定量的目的。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

依據(jù)優(yōu)化后方法，對(duì)方法線性關(guān)系和檢出限進(jìn)行考察。用空白樣品的提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限見表3。

表3 百草枯及敵草快的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Standard curve regression equation,linear range,correlation coefficient,limits of detection and limits of quantitation of paraquat and diquat

由表3可知，百草枯和敵草快在0.5～10 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R均＞0.99，線性關(guān)系良好。以目標(biāo)峰等于3倍基線噪音為檢出限，目標(biāo)峰等于10倍基線噪音為定量限進(jìn)行計(jì)算，百草枯和敵草快的檢出限均為0.001 5 mg/kg，定量限均為0.002 5 mg/kg。

2.8 方法回收率和精密度

從每類樣品中選取具有代表性的空白基質(zhì)樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)標(biāo)法定量，本研究百草枯和敵草快加標(biāo)量分別為0.002 5 mg/kg、0.005 mg/kg、0.025 0 mg/kg，分別計(jì)算精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表4。

表4 方法回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery rates and precision tests of the method

由表4可知，不同加標(biāo)水平百草枯和敵草快的平均回收率范圍在74.8%～115.6%之間；精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的范圍在2.8%～7.7%之間，兩種基質(zhì)測(cè)定結(jié)果的RSD均＜10%，滿足國(guó)標(biāo)對(duì)檢測(cè)方法回收率和精密度的要求，表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié)論

本研究建立了一種可同時(shí)提取牛奶和豆乳中百草枯和敵草快的方法。本方法快速高效，在樣品中加入甲酸，使樣品酸化，再加入甲醇沉淀蛋白，達(dá)到充分提取目標(biāo)物的目的。當(dāng)百草枯和敵草快的添加量為0.002 5～0.025 mg/kg時(shí)，其準(zhǔn)確度和精密度均符合國(guó)標(biāo)要求。在保證檢測(cè)方法可靠性的同時(shí)，也為牛奶和豆乳中農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供了一種新的思路。