基于GC-MS技術(shù)對不同香型白酒的判別分析

朱開憲，胡 雪，鄧 靜，吳華昌，錢 宇，趙金松

（1.四川旅游學(xué)院烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點實驗室，四川 成都 610100；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；3.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000）

中國白酒的香型在1979年第三屆全國評酒會上，就初步劃分為濃香、清香、醬香、米香和其他5種香型[1]。不同的香型白酒是由于釀造工藝和生產(chǎn)原料等因素不同，這些因素共同決定了白酒中風(fēng)味物質(zhì)組成、含量，從而形成了不同香型的白酒[2-5]。在此后經(jīng)過30多年的發(fā)展，白酒的香型在原有的5種香型之上，又陸續(xù)出現(xiàn)了特香型、芝麻香型、鳳香型等其他香型，到目前為止，包括老白干香型、馥郁香型已增加至12種[6-7]。

不同香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)在種類和數(shù)量上具有較大的區(qū)別，例如：濃香型的主體香味成分是己酸乙酯[8-9]。己酸乙酯的高含量、低閾值，決定了這類香型白酒的主要風(fēng)味特征；清香型白酒主體香氣表現(xiàn)為乙酸乙酯為主、乳酸乙酯為輔的清雅、純正、協(xié)調(diào)的復(fù)合香氣，幽雅舒適[10-12]；醬香型白酒的主體香味成分至今尚無定論[13-15]，現(xiàn)有4-乙基愈創(chuàng)木酚說、吡嗪類化合物及加熱香氣說、呋喃類和吡喃類化合物及其衍生物說、10種特征香味成分說等多種說法。鳳香型白酒的特征香氣是以乙酸乙酯為主、一定量的己酸乙酯為輔的復(fù)合香氣[16-17]。不同的香型的白酒之間的主體香具有一定的差異。目前，多種檢測技術(shù)已經(jīng)在酒類飲料中廣泛應(yīng)用，主要涉及質(zhì)譜技術(shù)、光譜技術(shù)和其他技術(shù)。王麗花等[18]對白酒風(fēng)味成分與感官評價的研究進展進行了報道。李賀賀等[19]利用氣相色譜-燃燒爐-同位素比值質(zhì)譜法對不同的釀造方法的白酒進行區(qū)分。YU H等[20]利用原子吸收光譜法結(jié)合偏最小二乘法的化學(xué)計量的方法對不同產(chǎn)地的米酒進行判定。孫文佳等[21]采用電子舌技術(shù)與多元統(tǒng)計學(xué)的方法相結(jié)合，對豉香型白酒的滋味品質(zhì)評價分析，并且利用電子舌對同一產(chǎn)地不同品牌的豉香型白酒做出了較好的分類判別。楊雯懿等[22]通過電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜法對白酒進行聚類分析。李艷敏等[23]利用5個不同產(chǎn)地清香型白酒中的12種重要的風(fēng)味物質(zhì)進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。孫宗保等[24]利用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)對白酒基酒等級進行了判別研究。

為了鑒定不同香型白酒中的特征香氣物質(zhì)，準確、有效地對不同香型白酒進行香氣評價，本研究通過氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對5種典型香型白酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分進行分析，并結(jié)合主成分分析、聚類分析（cluster analysis，CA）及偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等化學(xué)計量學(xué)手段對檢測結(jié)果進行分析，旨在對不同白酒香型的識別和分類提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

5個香型的酒樣：兼香型酒樣（口子窖）（編號為KZJ-1～KZJ-4，酒精度分別為46%vol、46%vol、50%vol、52%vol）4瓶、醬香型酒樣（郎酒）（編號為LJ-1～LJ-3，酒精度均為53%vol）3瓶、鳳香型酒樣（西鳳）（編號為XF-1～XF-3，酒精度均為52%vol）3瓶、濃香型酒樣（瀘州老窖）（編號為LZLG-1～LZLG-4，酒精度均為52%vol）4瓶，米香型酒樣（三花酒）（編號為SHJ-1，酒精度為52%vol）1瓶。

1.1.2 試劑

正丙醇、仲丁醇、正丁醇、2-甲基丙醇、乙酸乙酯、乙酸、異戊醛、2-戊酮、丙酸乙酯、異戊醇、正戊醇、丁酸乙酯、正己醇、戊酸乙酯、己酸、己酸乙酯、己醛二乙縮醛、庚酸乙酯、己酸丁酯、丙酸、丁酸、庚酸、辛酸、3-糠醛、叔戊醇、2-乙基丁酸、乙縮醛、乳酸乙酯、乙酸正戊酯、無水乙醇、異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁醛二乙縮醛、乙酸己酯、己酸己酯、十六酸乙酯、己酸異丁酯、己酸丙酯、亞油酸乙酯（純度均＞99%）：上海麥克林生化科技有限公司；C7～C40正構(gòu)烷烴：北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ8000三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜儀、AI1310多功能自動進樣器：美國Thermo Fisher Scientific公司；HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 白酒揮發(fā)性風(fēng)味成分的檢測

采用GC-MS法檢測白酒中的揮發(fā)性風(fēng)味成分。

GC條件：初始溫度為40 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升高至120 ℃，保持1 min，以40 ℃/min速率升高至290 ℃；進樣口溫度250 ℃；進樣方式為直接進樣；進樣量1 μL。

MS條件：傳輸線溫度為280 ℃；電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；掃描質(zhì)量范圍為39～550 m/z。

定性定量方法：對酒樣中的化合物的定性主要采用保留指數(shù)對比和質(zhì)譜庫檢索對比兩種方式。將自動識別的色譜峰與美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）12質(zhì)譜庫進行對比，再手動的篩選出正、反匹配度＞800，可能性＞90%的色譜峰，并且保證未知化合物的保留時間與標準樣品的保留時間之間在5 s以內(nèi)，則認為是同一種物質(zhì)。白酒中風(fēng)味成分的定量分析方法參考國家標準GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行化學(xué)計量學(xué)分析，SIMCA 13.0、MetaboAnalyst 5.0、Origin 2018軟件對測定數(shù)據(jù)進行整理統(tǒng)計和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同香型白酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)GC-MS分析

白酒酒樣揮發(fā)性風(fēng)味成分的檢測均采用GC-MS方法，以ALS自動進樣器直接進樣的方式，對5種香型15個樣品香氣組分進行定性和定量研究，GC-MS分析總離子流色譜圖見圖1，揮發(fā)性風(fēng)味成分含量的檢測結(jié)果見表1。由圖1和表1可知，5種香型15個白酒樣品共檢測出38種揮發(fā)性風(fēng)味成分，包括醇類8種，酯類17種，酸類7種，醛酮類6種。

圖1 不同香型白酒樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of volatile flavor compounds in different flavor-type Baijiu samples analysis by GC-MS

由表1可知，不同香型的白酒在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的醇類、醛類、酸類、酯類各不相同，形成了獨具特色的風(fēng)味，如己酸乙酯在濃香型白酒中含量最高，大于1 000 mg/L，其余酒樣中的含量相對較低；醬香型（LJ）白酒中的乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量在1 500 mg/L和1400 mg/L左右；兼香型（KZJ）白酒中的乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量均在700 mg/L左右；鳳香型（XF）白酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量分別為800 mg/L和700 mg/L、濃香型白酒（LZLJ）中這兩種酯類含量分別為800 mg/L和500 mg/L；米香型（SHJ）白酒中的乳酸乙酯含量分別為200 mg/L和800 mg/L。濃香型和鳳香型白酒酒樣中的己酸乙酯相對于其他香型更加高，其中米香型的三花酒中的己酸乙酯的含量僅為2.49 mg/L；以米香型為代表的三花酒中含量較高的酯類為乙酸乙酯和乳酸乙酯，這與沈怡方[25]關(guān)于白酒風(fēng)味質(zhì)量形成的主要因素分析一致。

表1 不同香型白酒酒樣中揮發(fā)性風(fēng)味成分含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of volatile flavor compounds contents in different flavor-type Baijiu samples mg/L

通過對不同香型白酒中的風(fēng)味物質(zhì)進行分析，結(jié)果表明不同香型白酒中的揮發(fā)性風(fēng)味成分含量和數(shù)量差異較大，因此利用揮發(fā)性風(fēng)味成分間的差異對不同香型白酒的分類具有一定的參考價值。

2.2 不同香型白酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分聚類分析

白酒發(fā)酵過程中在微生物的作用下除了會產(chǎn)生大量的醇類和酸類物質(zhì)外，還會產(chǎn)生大量的酯類物質(zhì)，一部分由有機酸和醇類物質(zhì)在一定條件下生成，另一部分也可由梭菌屬微生物合成[19-21]。眾所周知，酯類物質(zhì)是白酒中的重要物質(zhì)，是白酒香氣的主體，其中乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯更是被譽為濃香型白酒中的“四大酯”[26-30]。對不同香型的酒樣進行聚類分析，結(jié)果見圖2。

圖2 不同香型白酒樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of volatile flavor compounds in different flavor-type Baijiu samples

由圖2可知，通過聚類分析5種不同香型的白酒被分為五類，其中，在5個不同香型得酒樣里醬香型酒樣中的風(fēng)味物質(zhì)差異相較于其他四種香型（兼香型、米香型、鳳香型、濃香型）的差異更大。5個香型白酒首先被分為兩個大類，其中兼香型、米香型、鳳香型、濃香型這四種香型白酒被分為第一個大類，醬香型白酒為第二個大類。其中第一個大類由口子窖為代表的兼香型的4個酒樣KZJ-1、KZJ-2、KZJ-3、KZJ-4和以三花酒為代表的米香型的酒樣SHJ-1以及以鳳香型為代表的3個酒樣XF-1、XF-2、XF-3和以瀘州老窖為濃香型代表的4個酒樣LZLJ-1、LZLJ-2、LZLJ-3、LZLJ-4，以上四種香型為第一大類。以醬香型為代表的3個酒樣LJ-1、LJ-2、LJ-3單獨聚集為一類，組成了第二大類。其中第一大類的酒樣又單獨的以各自的香型聚集為一類，分為四個小類。結(jié)果表明，經(jīng)過聚類分析后的5種不同香型的酒樣都能單獨的聚集為5類，各自的香型聚集在一起，在一定程度上說明聚類分析結(jié)合酒樣中的風(fēng)味物質(zhì)對不同香型酒樣的區(qū)分具有一定的指導(dǎo)意義。

2.3 不同香型白酒揮發(fā)性風(fēng)味成分主成分分析

利用聚類分析中的各酒樣中的乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯的含量進行主成分分析。在進行主成分分析之前，首先對5種香型的酒樣利用相關(guān)系數(shù)矩陣做適應(yīng)性檢驗，結(jié)果表明，所選的風(fēng)味物質(zhì)間呈現(xiàn)顯著相關(guān)（P＜0.05），說明酒樣中的物質(zhì)相關(guān)性較強，能夠用PCA對其進行主成分分析。取各個酒樣中在前3個主成分得分做三維和二維的得分散點圖，結(jié)果見圖3。由圖3可知，5個不同香型的酒樣在二維和三維的得分散點圖中都能有效的分開，沒有發(fā)生重疊的現(xiàn)象。從圖3b～c的二維散點圖中可以看出，兼香型的口子窖（KZJ）和米香型的三花酒（SHJ）相距最近；鳳香型的西鳳（XF）和濃香型的瀘州老窖（LZLJ）距離較近；醬香型的郎酒（LJ）與其他四個香型的酒樣差異最大相距較遠，這與聚類結(jié)果一致，在聚類結(jié)果中醬香型的郎酒（LJ）單獨聚集為一類，說明聚類分析和主成分分析都能對不同香型的酒樣進行區(qū)分和鑒別，兩種化學(xué)計量學(xué)統(tǒng)計方法對今后的香型的判別具有一定的指導(dǎo)意義。

圖3 不同香型白酒樣品前3個主成分的三維（a）及二維（b、c）散點圖Fig.3 Three-dimensional (a) and two-dimensional (b,c) scatter plots of distribution of the first 3 principal components in different flavor-type Baijiu samples

2.4 不同香型白酒的偏最小二乘法判別分析

在主成分分析的基礎(chǔ)上，對5個不同香型的白酒進行偏最小二乘法判別分析，在判別分析中提取的2個成分即可反映總體變量的99.9%的信息，說明能有效的代表酒樣中大部分信息，利用5個不同產(chǎn)地的酒樣在這2個成分中的得分做散點圖，結(jié)果見圖4。由圖4可知，每一個香型的酒樣的組心質(zhì)都相互分開，說明每一個香型存在著明顯的差異；所有酒樣的散點圖都沒有發(fā)生重疊，并且同一種香型的酒樣聚集在一起，說明同一種香型的酒樣在化合物的含量與數(shù)量上存在一定的相似。

圖4 不同香型白酒酒樣偏最小二乘法判別分析散點圖Fig.4 Scatter plots of partial least squares discriminant analysis of different flavor-type Baijiu samples

在5個不同香型的酒樣中隨機的挑選1個酒樣用做“測試集”，剩余的酒樣當(dāng)作“訓(xùn)練集”。將“測試集”和“訓(xùn)練集”的酒樣的判定出的香型結(jié)果與實際香型作對比，判定結(jié)果見表2。由表2可知，每一個香型酒樣中的“測試集”和“訓(xùn)練集”的正確率均為100%，說明所建立的判別模型適用于不同香型的白酒之間的區(qū)分，同時也表明，實驗中所選取的化合物和化學(xué)計量學(xué)的方法相結(jié)合能有效對不同香型白酒酒樣進行判定，對不同香型白酒判定具有一定的指導(dǎo)意義。

表2 不同香型白酒酒樣分類結(jié)果Table 2 Classification results of different flavor-type Baijiu samples

3 結(jié)論

利用聚類分析、主成分分析、判別分析等多種化學(xué)計量學(xué)的手段，結(jié)合四種酯類的含量初步的將5種不同香型的酒樣進行了分類，聚類分析能有效的將5種不同香型的酒樣分成5類；主成分分析中的前3個主成分能基本上表現(xiàn)出酒樣中所帶的所有信息，利用15個酒樣在三維和二維的得分上做散點圖，散點圖中也能發(fā)現(xiàn)不同的香型各自聚集；主成分分析和聚類分析在不同香型的酒樣間的聚類和間距基本一致；判別分析中的2個成分能很好的代表酒樣中的基本信息，5種香型的組心質(zhì)都相互分離，沒有重合，將“測試集”和“訓(xùn)練集”的判定結(jié)果與實際結(jié)果相比較，正確率均為100%。