氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定液體調(diào)味料中4種氯丙醇的含量

劉沁穎，侯 靖，毛燕妮，盧躍鵬，周曉婷

（1.武漢食品化妝品檢驗所，湖北 武漢 430040；2.國家市場監(jiān)管重點實驗室（食用油質(zhì)量與安全），湖北 武漢 430040）

氯丙醇類化合物是一種人們公認的在食品加工過程中產(chǎn)生的污染物，包括3-氯-1,2-丙二醇（3-chloro-1,2-propanediol，3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-chloro-1,3-propanediol，2-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-dichloro-2-propanol，1,3-DCP）和2,3-二氯-1-丙醇（2,3-dichloro-1-propanol，2,3-DCP），具有腎臟毒性、生殖毒性、免疫抑制和潛在致癌性[1-2]。1993年，世界衛(wèi)生組織對氯丙醇類物質(zhì)的毒性發(fā)出警告；2011年，國際癌癥研究機構(gòu)評估3-MCPD的毒性后將其歸為2B類，認為它是一種對人類致癌性證據(jù)有限的可能致癌物。齊麗娟等[3]基于系統(tǒng)文獻檢索對3-MCPD及其酯類經(jīng)口暴露的危害進行評估，動物研究顯示3-MCPD毒性效應(yīng)主要靶器官為腎和睪丸。動物長期低劑量暴露可引起雄性大鼠進行性腎毒性、睪丸毒性以及雌性大鼠腎毒性和乳腺增生，從而導(dǎo)致動物生育能力下降，表現(xiàn)出精子活性降低、產(chǎn)仔數(shù)量減少和完全不育等生殖毒性。小鼠短期高劑量暴露還可引起神經(jīng)毒性作用。在最近的文獻報道中，SEVIM ? 等[4]通過大鼠腦組織中miR-21和PTEN-Akt等的表達情況，發(fā)現(xiàn)3-MCPD和縮水甘油亞可誘導(dǎo)大鼠腦組織凋亡。JIN C N等[5]采用3-MCPD灌胃大鼠28 d后，腎臟組織中發(fā)現(xiàn)有975個蛋白出現(xiàn)失調(diào)。生物信息學(xué)分析顯示，3-MCPD可導(dǎo)致內(nèi)源性代謝中與氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝相關(guān)的幾種酶發(fā)生改變，參與這些通路的一些蛋白也發(fā)生了變化，這為腎毒性的分子機制提供了更全面的認識。LEE H S等[6]使用C2C12成肌細胞評估了3-MCPD的體外肌肉毒性，發(fā)現(xiàn)3-MCPD通過抑制mTOR和p70S6激酶表達從而對肌肉分化產(chǎn)生抑制作用。SCHULTRICH K等[7]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可能在3-MCPD毒性中起作用，在腎臟、睪丸和大腦三個器官中，氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物不可逆氧化DJ-1蛋白的數(shù)量在喂食低劑量的3-MCPD時即顯著增加。FAN Y等[8]研究發(fā)現(xiàn)，1,3-DCP作用于AKT/mTOR/FOXO1信號通路抑制自噬導(dǎo)致脂質(zhì)積累，使實驗小鼠表現(xiàn)出肝臟中甘油三酯、總膽固醇和脂滴數(shù)量增加。

液體調(diào)味料中氯丙醇的主要來源為水解植物蛋白，其為植物性蛋白質(zhì)在酸催化作用下，水解后的產(chǎn)物，主要成分是氨基酸。由于植物性原料中有脂肪的存在，在使用過量鹽酸水解時，甘油三酯也會水解為丙三醇，并與鹽酸進一步反應(yīng)產(chǎn)生各種氯丙醇。另外有報道[9]稱紙制品生產(chǎn)過程中可能會添加增強抗?jié)裥缘沫h(huán)氧氯丙烷，當(dāng)紙制品接觸到液態(tài)食品時，其中的環(huán)氧氯丙烷可分解成氯丙醇，進而遷移到食品中造成污染。曾瑩等[10]報道紙制品中1,3-DCP與3-MCPD遷移被普遍檢出。因此，建立液體調(diào)味料中氯丙醇含量檢測方法很有必要。

現(xiàn)有氯丙醇檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）、毛細管電泳-電化學(xué)檢測法[11]、高效液相色譜-熒光檢測法[12]、近紅外光譜法[13]、電化學(xué)傳感器法[14]以及比色法[15]等，其中，使用最廣泛的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。氯丙醇的提取分離多采用固相支持液液萃取技術(shù)，常用的載體有硅膠[16]、氧化鋁[17-18]和硅藻土[19-21]。氯丙醇為極性化合物，為了提高檢測靈敏度，需要進行衍生處理，常見的衍生劑有七氟丁酸酐[16-17，21]、七氟丁酰基咪唑[19]、六甲基二硅氮烷與三甲基硅基三氟甲烷磺酸鹽[18]、環(huán)己酮[20]和苯硼酸[22-23]。近幾年也有非衍生化檢測氯丙醇的報道，但需要結(jié)合凝膠色譜[24]或高分辨質(zhì)譜[25]，難以推廣。本研究擬參考美國分析化學(xué)家協(xié)會（association of official analytical chemists，AOAC）方法，選取醬油、魚露及水解植物蛋白液為液體調(diào)味料的代表，采用商品化硅藻土柱進行固相支持液液萃取，七氟丁?；溥蜓苌?，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測，通過對前處理條件進行一系列優(yōu)化，建立了一種前處理簡單快捷的液體調(diào)味料中氯丙醇含量測定方法，為分析液體調(diào)味料及其他食品中的氯丙醇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀造醬油、魚露、水解植物蛋白液：購于武漢市場。

正己烷、乙酸乙酯（均為色譜純）：德國Merck公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）：國藥試劑化學(xué)有限公司；七氟丁?；溥颍ㄉV純）：美國REGIS公司。

3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-DCP）、2,3-二氯-1-丙醇（2,3-DCP）、D5-3-氯-1,2-丙二醇（D5-3-MCPD）、D5-2-氯-1,3-丙二醇（D5-2-MCPD）、D5-1,3-二氯-2-丙醇（D5-1,3-DCP）和D5-2,3-二氯-1-丙醇（D5-2,3-DCP）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均＞99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Agilent公司；Vortex-Genie 2渦旋混勻器：美國Scientific Industries公司；N-EVAP111氮氣濃縮儀：美國Organomation Associates Jnc.公司；大孔硅藻土柱（12 mL）：北京迪馬科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

配制20%氯化鈉溶液、1 000 mg/L氯丙醇及氘代氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液、氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 mg/L）及氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 mg/L）。

1.3.2 樣品前處理

稱取4 g液體樣品于15 mL離心管中，對于不含食鹽的試樣，稱樣后加入1 g氯化鈉，準(zhǔn)確加入氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL，超聲混勻5 min，待凈化。將液體全部轉(zhuǎn)移至硅藻土小柱中，平衡10 min。以10 mL正己烷淋洗，棄去流出液，以15 mL乙酸乙酯洗脫氯丙醇，收集洗脫液于玻璃離心管中。在洗脫液中加入4 g無水硫酸鈉，振搖，放置10 min后過濾，轉(zhuǎn)移濾液至密閉性很好的透明具蓋玻璃瓶中，氮吹濃縮至約0.5 mL（切忌濃縮至干），用2 mL正己烷溶解，渦旋混合。用氣密針加入0.04 mL七氟丁?；溥颍⒓磾Q緊瓶蓋，渦旋混合30 s，于70 ℃反應(yīng)20 min。取出冷卻至室溫，加入2 mL 20%氯化鈉溶液，渦旋混合1 min，靜置使水相和正己烷相分層，轉(zhuǎn)移正己烷相，加入約0.3 g無水硫酸鈉進行干燥后供氣相色譜-質(zhì)譜測定。系列標(biāo)準(zhǔn)工作液同步衍生化。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

GC條件：DB-5MS毛細管柱（0.25 μm×0.25 μm，30 m）；載氣為高純氦氣（He）（純度≥99.999%）；流速為1 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；不分流進樣，進樣量1 μL；升溫程序為50 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至90 ℃，再以40 ℃/min升至270 ℃，并保持5 min。

MS條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；溶劑延遲時間8 min；監(jiān)測方式為選擇離子監(jiān)測（selected ion monitoring，SIM），各化合物定量及定性、定量離子信息見表1。

表1 各化合物定量及定性離子Table 1 Quantitative and qualitative ion of each compounds

續(xù)表

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Agilent MassHunter 11.0軟件采集數(shù)據(jù)并分析，采用Microsoft Office Excel 2016對實驗數(shù)據(jù)進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

氯丙醇的衍生物極性較小，一般使用弱極性色譜柱進行分離。因此，比較了5%苯基亞芳基聚合物毛細管色譜柱（DB-5MS）和5%苯基-甲基聚硅氧烷毛細管色譜柱（HP-5MS）對分離效果的影響。結(jié)果表明，同樣升溫條件下，使用HP-5MS色譜柱分離時，3-MCPD與2-MCPD無法完全分開，分離度為1.2；而使用DB-5MS色譜柱分離時，3-MCPD與2-MCPD可以基線分離，所以選擇DB-5MS色譜柱進行實驗。使用DB-5MS色譜柱對4種氯丙醇及其氘代內(nèi)標(biāo)物進行分離，總離子流色譜圖見圖1。

圖1 4種氯丙醇及其氘代內(nèi)標(biāo)物GC-MS分析的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of 4 kinds of chloropropanols and their deuterated internal standards analyzed by GC-MS

2.2 淋洗溶液對結(jié)果的影響

正己烷淋洗可以除去提取液中的脂類等非極性干擾物，但是正己烷淋洗也可能會造成目標(biāo)物的損失。分別稱取4份液體樣品4 g進行加標(biāo)實驗，分別用0、10 mL、20 mL和30 mL正己烷淋洗，檢測淋洗液及后續(xù)15 mL乙酸乙酯洗脫液中氯丙醇含量。結(jié)果表明，不加正己烷淋洗不能有效除脂，后續(xù)實驗過程中易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象；1,3-DCP與2,3-DCP易被正己烷洗脫，10 mL正己烷淋洗即可使1,3-DCP與2,3-DCP發(fā)生明顯的損失，3-MCPD與2-MCPD不易被正己烷洗脫；而20 mL和30 mL淋洗后，4種物質(zhì)均有非常明顯的損失。綜合考慮，選擇10 mL正己烷進行淋洗除脂。

2.3 洗脫體積對結(jié)果的影響

稱取5份試樣4 g液體樣品進行加標(biāo)實驗，先使用10 mL正己烷淋洗，再分別用10 mL、15 mL、20 mL、25 mL和30 mL乙酸乙酯洗脫，檢測洗脫液中氯丙醇含量。結(jié)果表明，4種氯丙醇的最佳洗脫體積均為25 mL，但1,3-DCP與2,3-DCP相比，3-MCPD與2-MCPD受洗脫體積的影響較小。在洗脫體積為15 mL時1,3-DCP與2,3-DCP洗脫含量約為最佳洗脫體積時的90%，3-MCPD與2-MCPD洗脫含量約為最佳洗脫體積時的80%。考慮到洗脫體積過大會顯著增加后續(xù)氮吹的時間，增加檢測成本，故洗脫體積確定為15 mL。

2.4 洗脫液吹干對結(jié)果的影響

氯丙醇為小分子化合物，沸點較低。為了考察溶液吹干對實驗的影響，配備了含4種氯丙醇0.1 mg/L的溶液，一份在氮氣下水浴吹干約5 min后拿出，2 mL正己烷復(fù)溶后衍生；另一份直接衍生。結(jié)果表明，1,3-DCP與2,3-DCP吹干后幾乎全部損失，3-MCPD與2-MCPD吹干后也有較大損失，故洗脫溶劑切忌完全吹干。

2.5 衍生后溶液的穩(wěn)定性

將衍生好的標(biāo)準(zhǔn)溶液分裝在4個樣品瓶中，分別在常溫、避光常溫、避光4 ℃和避光-18 ℃條件下保存，于0 d、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d時上機檢測（每次進樣后立即更換新瓶蓋，并移至規(guī)定條件下保存），記錄各化合物在不同保存時間的峰面積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種氯丙醇及4種內(nèi)標(biāo)化合物在各條件下均非常穩(wěn)定，7 d內(nèi)沒有明顯的峰面積改變，說明衍生后的溶液穩(wěn)定性良好。

2.6 方法驗證

2.6.1 檢出限、定量限與線性范圍

分別稱取4 g空白樣品，加入一定量的氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)中間液，制備含4種氯丙醇的加標(biāo)樣品，經(jīng)處理后按1.3.3條件進行檢測，以3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限。以化合物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，得到回歸方程，4種氯丙醇的檢出限、線性范圍與回歸方程見表2。

表2 4種氯丙醇的檢出限、定量限、線性范圍與回歸方程Table 2 Limits of detection,limit of quantitation,linear ranges and regression equation of 4 kinds of chloropropanols

由表2可知，3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP的檢出限分別為2.0 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg、5.0 μg/kg，定量限分別為5.0 μg/kg、5.0 μg/kg、10 μg/kg、10 μg/kg，在0.005～1.6 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系。R2均為0.999。

2.6.2 回收率與精密度實驗結(jié)果

分別稱取4 g空白樣品，分別加入氯丙醇，制備成加標(biāo)樣品。每個質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品各6份，經(jīng)處理后采用1.3.3條件進行檢測，扣除未加標(biāo)樣品本底值后計算4種氯丙醇的回收率和精密度實驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3～表5。

表3 醬油中4種氯丙醇回收率與精密度（n=6）Table 3 Recovery rates and precisions of 4 kinds of chloropropanols in soy sauce (n=6)

表4 魚露中4種氯丙醇回收率與精密度（n=6）Table 4 Recovery rates and precisions of 4 kinds of chloropropanols in fish sauce (n=6)

表5 水解植物蛋白液中4種氯丙醇回收率與精密度（n=6）Table 5 Recovery rates and precisions of 4 kinds of chloropropanols in hydrolyzed vegetable protein liquid (n=6)

由表3可知，醬油中4種氯丙醇的平均回收率在85.9%～107.0%范圍內(nèi)，RSD在1.08%～8.58%范圍內(nèi)；由表4可知，魚露中4種氯丙醇的平均回收率在85.6%～106.0%范圍內(nèi)，RSD在0.85%～4.69%范圍內(nèi)；由表5可知，水解植物蛋白液中4種氯丙醇的平均回收率在82.4%～103.0%范圍內(nèi)，RSD在1.25%～5.65%。說明該方法應(yīng)用于液體調(diào)味料中4種氯丙醇的檢測時，回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在合理范圍，方法的穩(wěn)定性良好，是一種科學(xué)、有效、準(zhǔn)確的檢驗方法，可以作為同類食品檢測氯丙醇含量的參考。

2.7 實際樣品測定

隨機在市場購買醬油、魚露、水解植物蛋白液各10份樣品，經(jīng)處理后采用1.3.3條件進行檢測，結(jié)果表明所有樣品均未檢出氯丙醇。

3 結(jié)論

采用商品化大孔硅藻土柱凈化，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測，建立了一種前處理簡單快捷的液體調(diào)味料中氯丙醇含量測定方法。該方法測定液體調(diào)味料中3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP的檢出限分別為2.0 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg、5.0 μg/kg，定量限分別為5.0 μg/kg、5.0μg/kg、10 μg/kg、10 μg/kg。加標(biāo)回收率為82.4%～107.0%，精密度實驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%～8.58%。方法驗證實驗結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可以為市場監(jiān)管和檢驗檢測提供技術(shù)保障。