傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中耐乙醇型乳酸菌的研究進展

陳曼曼，吳興壯

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學 食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學院 食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一種能夠利用碳水化合物進行發(fā)酵并產(chǎn)生乳酸的細菌的統(tǒng)稱[1]，在傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜發(fā)酵過程中有著舉足輕重的作用，菌株的發(fā)酵和生物學特性直接影響傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的發(fā)酵效果[2]。乳酸菌在發(fā)酵過程中通過新陳代謝能夠產(chǎn)生乳酸，乳酸能夠降低環(huán)境pH值，低的pH環(huán)境能夠抑制其他混雜菌種的生長，從而能夠穩(wěn)定發(fā)酵環(huán)境，而且乳酸是傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜重要的呈味物質，能夠使食物富含特殊的風味[3-4]。

優(yōu)質乳酸菌應當具備較強的環(huán)境耐受性能和優(yōu)良的發(fā)酵特性，來保證發(fā)酵產(chǎn)品在食用后被胃腸道穩(wěn)定地吸收利用，更好地發(fā)揮乳酸菌的作用[5]。乳酸菌發(fā)酵所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，能夠使生存環(huán)境發(fā)生轉變，菌種自身也會被許多不利條件所影響[6]，如pH條件、溫度、滲透壓、乙醇濃度等，都會影響乳酸菌功能和活性的開發(fā)利用，其中乙醇濃度對菌體生長的影響就是非常重要的一個因素[7-8]。適量的乙醇可以抵制雜菌生長，防止傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜發(fā)霉、變質。但是，乙醇濃度過高會影響菌體的正常生長和生理活性等[9]。酒精度超過10%vol時，就會限制乳酸菌的生長速率[10]。秦偉帥等[11]研究發(fā)現(xiàn)，12.5%vol的酒精度會使大量乳酸菌失去生長活性。

目前國內外解決這類問題常用的一種方法就是利用對優(yōu)勢菌進行物理或者化學處理，誘使菌種發(fā)生改變來進行育種。這種方法不僅增強了菌種對環(huán)境的耐受能力，還提高了菌種的生長活性和生產(chǎn)性能，進而也影響到發(fā)酵產(chǎn)品的品種、口味和質量，是目前應用相對廣泛的一種菌種育種手段[11]。但是，通過文獻查閱了解到目前國內外對乳酸菌耐受乙醇性以及對應機理的研究比較少。本文主要總結傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中耐乙醇型乳酸菌的篩選方法、培養(yǎng)基優(yōu)化、菌種的乙醇耐受性、菌種的誘變、菌種復配及應用等方面的研究進展，為人工接種乳酸菌發(fā)酵傳統(tǒng)蔬菜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)，同時也為后續(xù)深入研究積累理論基礎。

1 乳酸菌的篩選方法

在實際的實驗或工作中，比較常用的篩菌方法有透明圈法、抑制圈法等平皿快速檢測法；還有平板劃線法、溶鈣圈法、十字交叉法、紙片法或生長速率法。如趙鑫等[12]利用傳統(tǒng)的菌種篩選方法從傳統(tǒng)發(fā)酵工藝制得的酸菜中分離純化后得到兩株乳酸菌，又經(jīng)過16S rDNA測序后鑒定兩株菌株為發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌。肖靜等[13]利用含鈣的MRS培養(yǎng)基平板從發(fā)酵的白菜中篩選出了8株屬于乳桿菌屬的菌株，其中包括植物乳桿菌、短乳桿菌、微小乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌。陳曉平等[14]將收集的酸菜汁先進行稀釋，然后涂布于分離固體培養(yǎng)基中，38 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，最后選取溶鈣圈較大的菌落進行劃線，得到3株高產(chǎn)酸菌株，并鑒定其為乳酸菌。經(jīng)過進一步的分類鑒定后，確定3株菌分別為腸膜明串珠菌、短乳桿菌和植物乳酸桿菌。解文利等[15]將梯度稀釋后的四川泡菜的泡菜汁涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，在適宜條件下分離篩選并鑒定得到的6株菌均為植物乳桿菌。夏姣[16]利用平板培養(yǎng)法從老泡菜發(fā)酵的蘿卜中篩選并鑒定出植物乳桿菌、耐乙醇片球菌、布氏乳桿菌乳酸菌優(yōu)勢菌群。浩楠[17]在改良培養(yǎng)基上用傳統(tǒng)的篩選方法從葡萄酒中篩選出3株耐高濃度乙醇的小片球菌。毛丙永等[18]利用平板涂布法從重慶泡菜中也篩選出了耐乙醇片球菌。

除了這些用傳統(tǒng)篩選方法篩出的常見的菌株之外，有研究者使用現(xiàn)代新技術對菌種進行分離優(yōu)化。武俊瑞等[19-21]從東北酸菜中利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）鑒定出棒狀乳桿菌、戊糖乳桿菌、黑氏乳桿菌等菌種，這是用傳統(tǒng)菌種分離方法所沒有分離到的菌種。陳功等[22]通過聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）現(xiàn)代分子生物技術從四川泡菜中篩選出了植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和短乳桿菌及耐乙醇片球菌等優(yōu)勢乳酸菌群。

傳統(tǒng)的菌種篩選方法依然占據(jù)非常重要的地位，現(xiàn)代新技術篩出的菌種會更加精準，傳統(tǒng)方法為現(xiàn)代新技術的展開提供便利和成功率，這兩種相互結合將會極大促進篩菌的過程的順利實施，才能更快、更準確地從大自然中發(fā)現(xiàn)菌種。

2 乳酸菌培養(yǎng)基優(yōu)化

用于乳酸菌的篩選和計數(shù)的培養(yǎng)基一般是MRS培養(yǎng)基[23]。乳酸菌生長代謝會有大量的乳酸生成，生成的乳酸會降低培養(yǎng)基的pH，進而培養(yǎng)基也變成了黃綠色。正是因為pH值的下降以及抗生素的作用，又是在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)，所以一般的微生物在MRS培養(yǎng)基上很難存活，因此乳酸菌很容易被篩選出來。

為了更好地篩選出乳酸菌，有許多研究者對MRS培養(yǎng)基進行了改良優(yōu)化。如姜曄[24]將番茄汁、胡蘿卜汁以及緩沖鹽類和中和鹽類等添加到基礎培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，比普通培養(yǎng)基的效果更加顯著。李鵬沖等[25]也嘗試調整乳酸菌的生長培養(yǎng)基的配制，添加了6.0%的葡萄糖，2.5%的蛋白粉，加了15.5%的水，結果大大增加了乳酸菌在培養(yǎng)基中生長的數(shù)量。柏建玲等[26]以優(yōu)化后的MRS培養(yǎng)基為基礎，選擇了成本比較低的玉米漿作為營養(yǎng)因子，發(fā)現(xiàn)改良后的菌落數(shù)比原培養(yǎng)基的菌落數(shù)要高出許多。郭青照等[27]優(yōu)化了果蔬乳酸菌培養(yǎng)基，優(yōu)化后的葡萄糖含量為6%，1.5%蛋白粉和15%的水，結果培養(yǎng)基乳酸菌的菌種生長率比原培養(yǎng)基增長408.3%以上。胡宇豪等[28]使用篩選得到的耐受12%vol乙醇的菌株作為出發(fā)菌株，對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化后的菌株產(chǎn)酸量提高了11.8 g/L。

3 乳酸菌的乙醇耐受性

蔬菜發(fā)酵能夠產(chǎn)生乙醇、有機酸、氨基酸等物質，同時在酸菜添加菌種時可能伴有野生酵母菌的污染，也會產(chǎn)生一定的乙醇，而乙醇與有機酸能夠形成酯類物質，能夠增加酸菜的香味[29-31]。但是如果乙醇濃度過高，則會抑制發(fā)酵液中乳酸菌的生長活性，從而影響菌種發(fā)揮作用[32]。

研究表明，乳酸菌經(jīng)過長時間的乙醇脅迫，菌體內部在短時間內所受的乙醇應激反應開始慢慢平緩，菌種進入適應機制，在一定程度上，增加了細胞膜的流動性，降低高濃度乙醇對菌體的危害，提高菌的耐受性[33-34]。

周羽等[35]從果蔬發(fā)酵液中篩選出2株副干酪乳桿菌，通過培養(yǎng)基脅迫培養(yǎng)以及一系列的研究分析，得出菌株能夠耐受5%vol的乙醇。朱敏[36]通過實驗得知，乳酸菌在8%vol乙醇脅迫處理后菌體的存活率下降，pH值有所升高。金丹等[37]采集生長在對數(shù)末期的乳酸菌株，通過在原培養(yǎng)基的基礎上加入不同含量的乙醇進行脅迫培養(yǎng)的方法，觀察菌株最后的存活率，結果發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過乙醇脅迫后的菌株能耐受13%vol的乙醇濃度。孟祥利[38]對4株乳酸菌進行耐受性馴化培養(yǎng)，最后得到兩株耐高鹽乳酸菌的耐受乙醇濃度最高的臨界點為26%vol。

由此可見，在一定程度上，由于乳酸菌在生長過程中暴露于外部環(huán)境和內部應激的原因，乳酸菌的存活率和生長速率會發(fā)生改變[39-42]。還有研究者從細胞的結構和細胞的內部力量、新陳代謝等方面對乙醇脅迫與乳酸菌適應機制進行研究[43]。但是對乳酸菌進行乙醇脅迫處理的過程較為復雜，且乙醇濃度對菌種的酶活性等造成較大的影響，因此，對于乙醇脅迫處理對菌種的代謝活力還需要進一步研究[44]。

李愛霞等[45]對培養(yǎng)基進行改良優(yōu)化篩選出6株植物乳桿菌，其中有5株菌均可耐受16%vol乙醇濃度，且在25 ℃條件下培養(yǎng)要優(yōu)于37 ℃培養(yǎng)。羅青春等[46]篩選出了1株具有耐高濃度乙醇、耐受高溫及高產(chǎn)酸能力的耐酸乳桿菌菌株，能夠耐受乙醇最高濃度為15%vol、耐受最高溫度為45 ℃、產(chǎn)乳酸能力達到17.5 g/L，為有效提高耐受乙醇能力提供了寶貴的菌種資源，貢獻了非常高的應用價值。董玲等[47]從果醋醋醅中篩選出的高產(chǎn)酸菌株能夠在14%vol乙醇濃度下存活，耐受乙醇能力較強，有很高的潛在應用價值。許正宏等[48]研究表明，植物乳桿菌能夠在17%vol乙醇濃度條件下正常生長，還能生產(chǎn)大量γ-氨基丁酸。吳群等[49]研究表明，耐酸乳桿菌能夠耐受18%vol的乙醇濃度，產(chǎn)酸能力也強，發(fā)酵產(chǎn)品風味好。

4 乳酸菌的誘變

誘變育種方法簡便、速度快，效果顯著。據(jù)了解目前發(fā)酵工業(yè)都是通過這種方法來提高菌株的生產(chǎn)性能，從而達到生產(chǎn)要求。因此誘變育種是目前廣泛使用的一種育種方法[50-51]。常見的誘變劑有紫外線、γ射線、亞硝基胍、硫酸二乙酯等[52-56]。

李小平等[57]對作為出發(fā)菌株的保加利亞乳桿菌進行紫外誘變處理，誘變后的菌株的產(chǎn)酸率提高了56.6%。雙全等[58]將4株產(chǎn)γ-氨基丁酸較強的菌株作為出發(fā)菌株，利用紫外誘變的方法進行處理后的菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸能力比誘變前提高1.9倍。羅紅霞等[59]通過研究硫酸二乙酯誘（diethyl sulfate，DES）變乳酸菌的各項參數(shù)，得出誘變的最佳條件為0.7%的硫酸二乙酯在37 ℃誘變30 min，誘變后的菌株改進了發(fā)酵成品的質量，同時也延長了成品貨架期。王曉雯等[50]用面包乳桿菌和植物乳桿菌作為原菌株，使用紫外線（ultraviolet，UV）、硫酸二乙酯以及UV＋DES復合對菌株進行誘變處理，得出硫酸二乙酯誘變效果最優(yōu)，誘變后的菌株產(chǎn)酸能力接近，且誘變后的乙醇耐受性有所提高。周逢云等[60]將原菌株休哈塔假絲酵母（Candida shehatae）TZ8支撐原生質體，然后進行紫外誘變，結果顯示誘變后的菌株的耐乙醇能力較初始菌株提高了2%。

誘變育種能夠提高菌種的生產(chǎn)性能，為了使乳酸菌的性能更優(yōu)良，更好地作用于發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，更多學者展開了復合誘變的研究。王秀秀[61]通過對處于對數(shù)期的菌種進行氯化羥胺復合紫外線誘變處理，獲得1株可以耐受13%vol乙醇的菌株，而且產(chǎn)酸能力提高了73.4%。張?zhí)煨Φ萚62]將鼠李糖乳桿菌作為出發(fā)菌株，通過紫外誘變復合亞硝基胍誘變結合基因組改組技術進行處理，結果顯示菌種的耐受乙醇能力較原菌株提高了3%，且產(chǎn)酸能力也有所提升。孫春麗[63]通過紫外誘變結合硫酸二乙酯誘變對出發(fā)菌株進行處理，獲得的新菌株可以耐受12%vol的乙醇、70 mg/L的SO2和pH 3.0。劉月英等[64]利用紫外誘變和亞硝基胍誘變對乳酸菌進行兩輪復合誘變，最終誘變菌株的產(chǎn)酸能力提高了30.64%。

復合誘變處理在一定程度上可以彌補單一誘變的問題，從而得以廣泛應用。通過不斷研究，有學者將誘變處理進行創(chuàng)新，如將等離子體融入到育種技術中，但是離子注入技術要求嚴格，還需要深入研究[65]。

5 乳酸菌的復配及應用

發(fā)酵蔬菜是通過乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的蔬菜加工制品，乳酸菌的種類與特性影響著發(fā)酵蔬菜的風味和品質。以傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜作為研究對象，將兩種或多種菌種混合培養(yǎng)，菌種之間相互作用，為酸菜提供更加獨特風味，提高酸菜品質，為新型乳酸菌發(fā)酵制品積累經(jīng)驗。

劉孝永等[66]從傳統(tǒng)酸菜中篩選出兩株耐酸性乳酸菌，經(jīng)過鑒定兩株均為乳桿菌屬，將二者共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)能夠相互促進生長。任亭等[67]從傳統(tǒng)泡菜中篩選鑒定的優(yōu)質乳酸菌為魏斯氏菌，將它與植物乳桿菌進行復配，并使用它們發(fā)酵麻竹筍泡菜，結果顯示發(fā)酵的周期有所減短，并且安全性和品質有所提高。衛(wèi)玲玲等[68]研究發(fā)現(xiàn)，將短乳桿菌和植物乳桿菌按照1∶1進行復配，得到的酸菜風味豐富，酸脆爽口，香味佳。王海吉等[69]將植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌三種菌混合接種到胡蘿卜中進行發(fā)酵，制成的胡蘿卜泡菜酸度和香味俱佳，口感爽脆，風味獨特。CAGNO R D等[70]研究發(fā)現(xiàn)，將復合菌種添加到蔬菜中進行發(fā)酵，發(fā)酵成品中的乳酸菌活菌數(shù)要比未接種的高。

此外還有常見的乳酸菌與酵母菌共同發(fā)酵食品，乳酸菌與酵母菌之間能夠進行代謝產(chǎn)物互補[71]。王齡焓等[72]將乳酸菌和增香酵母PL09混合接種用于發(fā)酵豆乳，酵母菌對乳酸菌的產(chǎn)酸能力有所促進，而且能增加活菌數(shù)，提高產(chǎn)品的黏度。還有比較常見的開菲爾粒也屬于一個乳酸菌與酵母菌組合的復雜菌系，二者之間具有協(xié)同發(fā)酵作用[73]，酵母菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙醇，而乳酸菌在高濃度的乙醇環(huán)境下生存艱難[74]，針對這些問題都還需要深入研究。

乳酸菌作為一種益生菌越來越被廣泛應用和開發(fā)，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品也逐漸受到人們的廣泛關注。施渺筱等[75]將從自然發(fā)酵的酸菜中篩選出的植物乳桿菌和短乳桿菌混合接種到金刺梨果汁中進行發(fā)酵，縮短了果汁的發(fā)酵周期，降低了果汁的營養(yǎng)成分損耗，改善并豐富了果汁的風味。陳雙等[76]將耐乙醇且高產(chǎn)乳酸的耐酸乳桿菌株用來發(fā)酵高酸度黃酒，能夠耐受較高的乙醇濃度，黃酒總酸在16.4 g/L以上，酒精度在16%vol以上，發(fā)酵成品的香氣接近傳統(tǒng)黃酒。

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們對食品健康和品味的追求更加嚴格，研究具有增香特質的發(fā)酵劑漸漸成為當今發(fā)酵乳研究的熱點[77]。酵母菌發(fā)酵產(chǎn)品具有獨特的香味是由于酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生乙醇與有機酸形成富有香味的酯類物質[78]，將適量的乳酸菌接種到發(fā)酵的產(chǎn)品中也會形成菌種的產(chǎn)香機制，從而賦予發(fā)酵成品獨特的香味。酸菜發(fā)酵過程中的主要揮發(fā)性風味物質主要是來源于酸、酯類、醇類等[79]。李美倫等[80]將分離出的三株菌進行復配接種到低鹽辣椒，結果顯示，發(fā)酵成品中的醇類和酯類物質賦予辣椒獨特的風味。任大勇等[81]在白菜中接種植物乳桿菌進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質變化明顯的是酸類、醇類以及酯類含量。研究發(fā)現(xiàn)，醇類散發(fā)的香味會使人感到興奮，乙醇是酸菜中含量最高的醇類[82]，對酸菜增香起到重要作用。

研制一種可以直接用做酸菜發(fā)酵的直投式酸菜發(fā)酵劑，其乳酸菌生長活力高、適應能力強，優(yōu)于傳統(tǒng)的發(fā)酵劑，而且更加標準化，可以縮短發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)酵周期，使用方便，生產(chǎn)成本低[83-86]。陳聰?shù)萚87]將兩株植物乳桿菌復配直投接種到金針菇泡菜中，結果顯示，直投菌種的發(fā)酵成品比自然發(fā)酵的產(chǎn)品產(chǎn)生的醇類、酯類等呈味物質的含量要高許多，而且產(chǎn)酸能力與發(fā)酵速度也要優(yōu)越一些。譚歡[88]在復合凍干保護劑的保護下使用冷凍干燥法成功制備了高效乳酸菌直投式發(fā)酵劑。另外，直投式發(fā)酵劑既方便貯存，又可以有效地避免菌種被雜菌污染以及菌種老化。應當加強菌體高效培養(yǎng)富養(yǎng)技術以及凍干技術的研究，促進直投式乳酸菌發(fā)酵劑的快速發(fā)展，形成產(chǎn)業(yè)化模式[89]。

6 展望

乳酸菌是傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜發(fā)酵的優(yōu)勢菌，優(yōu)質乳酸菌應當具備較強的環(huán)境耐受性能和優(yōu)良的發(fā)酵特性，來保證發(fā)酵產(chǎn)品在食用后被胃腸道穩(wěn)定地吸收利用，更好地發(fā)揮乳酸菌的作用。對現(xiàn)有耐受乙醇型乳酸菌的分離與篩選研究進展的總結，為后續(xù)深入研究積累理論基礎，更好地給人工接種乳酸菌發(fā)酵傳統(tǒng)蔬菜工廠化生產(chǎn)等提供依據(jù)。