高通量連接探針擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合STR分型在孕早期稽留流產(chǎn)中的應(yīng)用*

顧麗澤，王金俏，王 鵬，張 姝，劉 穎，王 億，方 媛

(徐州市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心，徐州 221009)

臨床上約有10%～15%的妊娠發(fā)生流產(chǎn)，多為早期流產(chǎn)。胚胎發(fā)育異常為早期自然流產(chǎn)最常見的原因，其中50%～60%為染色體異常[1]。近年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，染色體微陣列芯片(chromosomal microarray analysis，CMA)技術(shù)因其具有高通量、高分辨率、無需絨毛培養(yǎng)等優(yōu)勢逐漸用于流產(chǎn)組織遺傳學(xué)檢測[2]。但因其價格昂貴、實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜、周期長等原因在臨床應(yīng)用中受到限制。高通量連接探針擴(kuò)增(high throughput ligation dependent probe amplification，HLPA)技術(shù)是在傳統(tǒng)多重連接探針擴(kuò)增(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)技術(shù)基礎(chǔ)上改良后用于多重基因拷貝數(shù)檢測的分子遺傳學(xué)技術(shù)[3]，具有通量高、檢測速度快、價格低等優(yōu)勢。本研究選取稽留流產(chǎn)患者的絨毛組織樣本進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat，STR)分型檢測，排除母體細(xì)胞污染樣本[4]，成功入組的樣本進(jìn)行CMA或HLPA檢測，探討兩種檢測技術(shù)在流產(chǎn)病因?qū)W研究中的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2019年12月至2022年3月在徐州市婦幼保健院就診的稽留流產(chǎn)患者283例，年齡22～42歲，孕7～13+6周，彩超提示胚胎停止發(fā)育。經(jīng)遺傳咨詢后自愿選擇流產(chǎn)組織物CMA或HLPA檢測。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，患者充分知情并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本制備 收集患者外周血樣本及稽留流產(chǎn)絨毛組織。選取10～20mg流產(chǎn)絨毛組織，生理鹽水反復(fù)清洗，挑選適量絨毛充分研磨，徹底消化后采用DNA抽提試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit,DP304)提取DNA。抽取患者外周血2mL，提取DNA。

1.2.2 STR分型檢測 先將絨毛組織及母體血液DNA樣本進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在Applied Biosystems 3500型遺傳分析儀上進(jìn)行電泳分析。STR分型檢測共計17個檢測位點(diǎn)，包括10個常用個體鑒別基因座、性別基因座及6個具有高雜合度的基因座。通過GeneMapper軟件分析原始數(shù)據(jù)文件，根據(jù)產(chǎn)物峰分析是否存在母體污染、絨毛樣本是否為多倍體或單親二倍體。若母體血液樣本中各位點(diǎn)的目標(biāo)峰均能在流產(chǎn)樣本檢測圖上找到，則判定為母體污染，母體細(xì)胞污染的樣本不再進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.3 HLPA檢測 采用CNVplex?高通量DNA拷貝數(shù)檢測技術(shù)(蘇州天昊公司)，檢測范圍覆蓋24條染色體的341個基因位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對所有染色體非整倍體以及大于5M染色體末端缺失重復(fù)突變的檢測。按操作說明書，實(shí)驗(yàn)過程包括連接反應(yīng)、連接產(chǎn)物多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物熒光毛細(xì)管電泳分離以及數(shù)據(jù)讀取。對讀取的電泳圖譜進(jìn)行分析，獲取各個基因位點(diǎn)連接探針擴(kuò)增產(chǎn)物的峰高，分析確定樣本目標(biāo)基因片段的拷貝數(shù)。

1.2.4 CMA檢測 采用美國Affymetrix公司的CytoScan 750芯片平臺檢測樣本，通過基因組DNA消化、擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、片段化、標(biāo)記、雜交等實(shí)驗(yàn)過程，應(yīng)用ChAS系統(tǒng)分析單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和拷貝數(shù)變異，嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件。計數(shù)資料采用n和%表示，數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種檢測方法異常檢出率 283例樣本，STR分型排除母體污染3例，考慮原因可能是絨毛已退化混有母體組織，實(shí)際成功入組280例。檢出染色體異常56.79%(159/280)，其中染色體數(shù)目異常94.34%(150/159)，染色體結(jié)構(gòu)畸變5.03%(8/159)，單親二倍體0.63%(1/159)。HLPA檢出染色體異常56.43%(79/140)，CMA檢出染色體異常57.14%(80/140)，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.015，P=0.904)。

2.2 染色體數(shù)目異常 150例染色體數(shù)目異常中，HLPA+STR檢出76例，CMA檢出74例。染色體三體檢出率最高，占66.00%(99/150)，其中16-三體占32.32%(32/99)；其次為染色體單體(特納綜合征)占19.33%(29/150)；三倍體10.00%，復(fù)合非整倍體3.33%，嵌合體1.33%，2例嵌合體均為CMA檢出。見表1、2。

表1 HLPA+STR與CMA檢出染色體數(shù)目異常類型[n(%)]

2.3 染色體結(jié)構(gòu)畸變 本組樣本中檢出染色體結(jié)構(gòu)畸變8例。染色體結(jié)構(gòu)畸變的胚胎樣本，提示其父母雙方染色體可能存在染色體結(jié)構(gòu)重排，需進(jìn)一步遺傳學(xué)檢測。(1)HLPA+STR檢測出3例染色體結(jié)構(gòu)畸變，患者夫妻雙方均行外周血染色體核型分析，其中1例為染色體平衡易位攜帶者，2例為新發(fā)突變。(2)CMA檢測出5例，缺失或重復(fù)片段長度3例大于10Mb，2例小于2Mb，見表3。

表2 HLPA+STR與CMA檢出染色體非整倍體結(jié)果[n(%)]

表3 HLPA+STR與CMA檢出染色體結(jié)構(gòu)畸變結(jié)果比較

2.4 HLPA聯(lián)合STR技術(shù) HLPA檢測存在局限性，無法測出多倍體和單親二倍體，因此需聯(lián)合STR技術(shù)。STR判定三倍體標(biāo)準(zhǔn)：≥14個個體鑒別位點(diǎn)都是3種情況(1個峰、2個峰高比例接近2∶1的峰、3個峰高比例接近1∶1∶1的峰)之一，可判定為三倍體。病例1，HLPA檢測結(jié)果為正常女性(圖1A)，STR峰值圖符合三倍體判定標(biāo)準(zhǔn)(圖1B)，且性別鑒定位點(diǎn)只含有X峰，無Y峰，因此該病例判定為三倍體(69,XXX)(圖1C)，同時該樣本為絨毛水腫，病理診斷為完全性葡萄胎。病例2，HLPA檢測結(jié)果顯示X染色體相對拷貝數(shù)為1～1.5，Y染色體相對拷貝數(shù)為0.5～1.0，存在異常(圖2A)，因此需結(jié)合STR結(jié)果分析，STR峰值圖符合三倍體判定標(biāo)準(zhǔn)，性別鑒定位點(diǎn)同時含有X/Y峰，且X/Y峰高比接近2/1，則判定該病例為三倍體(69,XXY)(圖2B、2C)。

圖1 HLPA聯(lián)合STR檢測病例1

圖2 HLPA聯(lián)合STR檢測病例2

3 討 論

近年來自然流產(chǎn)在育齡婦女中的發(fā)生率呈增高趨勢，發(fā)病原因較復(fù)雜，包括遺傳因素、免疫因素、內(nèi)分泌異常、感染、解剖學(xué)異常、環(huán)境及其他未知因素，其中胚胎發(fā)育異常為早期自然流產(chǎn)最常見的原因，流產(chǎn)組織物遺傳學(xué)檢測可為臨床優(yōu)生遺傳咨詢提供基礎(chǔ)[5]。本研究納入稽留流產(chǎn)組織樣本283例，其中檢測成功280例，檢測成功率98.94%，染色體異常樣本檢出率為56.79%，與文獻(xiàn)報道(56.40%)基本一致[6]。其中染色體數(shù)目異常占總異常的94.34%，染色體結(jié)構(gòu)畸變占5.03%，染色體異常的樣本中染色體三體的發(fā)生率最高，其中16-三體的發(fā)病率居于首位。因此，早期流產(chǎn)組織物染色體檢測在分析流產(chǎn)原因中占據(jù)十分重要的地位，為自然流產(chǎn)診治提供了新的思路。

流產(chǎn)絨毛染色體檢查的傳統(tǒng)技術(shù)是絨毛細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型G顯帶，其準(zhǔn)確率高達(dá)99.5%，可同時檢測出染色體數(shù)目和10Mbp以上片段的結(jié)構(gòu)異常，但其主要弊端是需經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，檢測周期較長，細(xì)胞培養(yǎng)有一定難度，存在較高的失敗風(fēng)險，標(biāo)本制備易受樣本質(zhì)量、取材時間、母源性細(xì)胞污染等影響，且對染色體分析技術(shù)要求較高[7-8]。探尋便捷準(zhǔn)確的染色體數(shù)目異常檢測方法尤為重要。HLPA技術(shù)是在傳統(tǒng)MLPA技術(shù)基礎(chǔ)上改良后用于多重基因拷貝數(shù)檢測的分子遺傳學(xué)技術(shù)，其技術(shù)優(yōu)勢在于探針分布更廣，通量更高，檢測結(jié)果更趨精準(zhǔn)。與傳統(tǒng)染色體核型分析相比HLPA技術(shù)具備以下優(yōu)勢：(1)操作成功率較高，該技術(shù)不需通過細(xì)胞培養(yǎng)及收獲，直接提取胎兒絨毛組織DNA進(jìn)行檢測；(2)檢測時間較短，一般成功提取DNA后24～48h可得到檢測結(jié)果；(3)顯著降低人員成本，實(shí)驗(yàn)操作較簡單，自動化程度較高。本研究所采用的HLPA技術(shù)主要對所有染色體非整倍體以及大于5Mb以上的染色體末端的缺失重復(fù)突變進(jìn)行檢測，而這類大片段的末端缺失和末端重復(fù)類的染色體結(jié)構(gòu)異常，提示父母雙方可能為一方或雙方為染色體平衡易位攜帶者，為指導(dǎo)患者再次生育具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，近年來CMA技術(shù)在產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測中應(yīng)用較廣泛，可檢測染色體非整倍體拷貝數(shù)變異(copy number variant,CNV)，尤其對于檢測染色體微缺失/重復(fù)等拷貝數(shù)變異具有突出優(yōu)勢。目前對于產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)的胎兒結(jié)構(gòu)異常，CMA是較有效的遺傳學(xué)診斷方法[9-10]，但其價格高昂，在流產(chǎn)組織物遺傳學(xué)病因檢測的臨床應(yīng)用上受到很大限制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CMA和HLPA檢測方法對于胚胎染色體非整倍體的檢出均具有準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、通量高的優(yōu)勢，但CMA在小片段缺失重復(fù)檢出中的優(yōu)勢更突出[11]。HLPA技術(shù)因檢測價格低廉、檢測周期較短更易被患者接受。HLPA技術(shù)仍存在一定局限性，HLPA是根據(jù)分析染色體特異性探針結(jié)合區(qū)域核酸拷貝數(shù)的變化，從而進(jìn)一步評估染色體有無劑量變化，因在正常女性、單親二倍體、三倍體或多倍體女性樣本中X染色體與常染色體的相對拷貝數(shù)是相同的，故HLPA無法區(qū)分。所以，需聯(lián)合其他技術(shù)彌補(bǔ)在多倍體及單親二倍體方面的檢出，STR技術(shù)在該方面可以起到補(bǔ)充作用。

通過對多態(tài)性位點(diǎn)的STR進(jìn)行擴(kuò)增，并應(yīng)用毛細(xì)管電泳對染色體數(shù)目異常進(jìn)行分析，不僅可以準(zhǔn)確判讀多倍體及單親二倍體，同時能夠?qū)α鳟a(chǎn)組織樣本的質(zhì)量進(jìn)行初步分析，排除母體污染，提高準(zhǔn)確度。通過本研究可以發(fā)現(xiàn)，HLPA聯(lián)合STR技術(shù)在胚胎染色體非整倍體的檢測中與CMA技術(shù)相比同樣具有準(zhǔn)確度高、靈敏性強(qiáng)等優(yōu)勢。但是HLPA技術(shù)受到探針覆蓋不足的限制，可能無法檢出一些小片段的染色體拷貝數(shù)異常，如一些非末端的拷貝數(shù)變異，存在漏檢風(fēng)險。但這些小片段的微缺失/微重復(fù)與早孕期胚胎停止發(fā)育的相關(guān)性尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，HLPA聯(lián)合STR技術(shù)具有便捷、高效、靈敏、準(zhǔn)確、價廉等優(yōu)勢，能較好地用于檢測早孕期稽留流產(chǎn)組織染色體異常，易于在臨床推廣應(yīng)用，為優(yōu)生遺傳咨詢提供有力證據(jù)，可有效指導(dǎo)孕婦再次妊娠。