18045例無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查游離胎兒DNA比例分析*

代 鵬，趙干業(yè)，胡 爽，劉 寧，孔祥東

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科遺傳與產(chǎn)前診斷中心，鄭州 450052)

1997年Lo等發(fā)現(xiàn)孕婦外周血漿中存在游離胎兒DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)，為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(non-invasive prenatal screening,NIPS)提供了新思路，包括胎兒染色體非整倍體、染色體微缺失/重復(fù)綜合征以及單基因遺傳病[1-3]。研究顯示，血漿游離胎兒DNA比例(fetal DNA fraction,FF)是NIPS應(yīng)用胎兒遺傳疾病檢測(cè)的重要參數(shù)[4]，因此FF的準(zhǔn)確估算尤為重要。孕婦的孕周、體重等因素可影響FF含量，如FF過(guò)少，則無(wú)法正確反映cffDNA在各染色體上的分布情況，進(jìn)而影響NIPS檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致假陰性發(fā)生[5-6]。當(dāng)然，F(xiàn)F較高并不意味胎兒發(fā)育良好，F(xiàn)F異常增高可能預(yù)示不良妊娠結(jié)局，如自發(fā)性早產(chǎn)[7-8]。本研究對(duì)18045例NIPS的游離FF進(jìn)行分析，并結(jié)合孕婦的年齡、孕周、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)以及高風(fēng)險(xiǎn)樣本的FF，探討FF的影響因素及其與染色體異常疾病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 回顧分析2020年1月至2020年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心自愿選擇行NIPS的18045例孕婦的臨床資料、FF以及高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的妊娠結(jié)局。孕婦因唐篩異常(39.1%，7052/18045)、超聲異常(11.1%，2008/18045)和高齡妊娠(16.7%，3022/18045)選擇NIPS排除染色體異常，其他孕婦(33.1%，5963/18045)自愿選擇NIPS。排除接受細(xì)胞治療者、腫瘤患者、移植手術(shù)者和1年內(nèi)異體輸血者。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018-016)，孕婦均簽署知情同意書。

1.2 NIPS檢測(cè) 采集孕婦外周血10mL保存在無(wú)創(chuàng)專用采血管；提取母體血漿游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)，使用10ng cfDNA構(gòu)建文庫(kù)，建庫(kù)過(guò)程無(wú)需PCR擴(kuò)增。文庫(kù)定量后，利用基因測(cè)序儀(Nextseq CN500，美國(guó))進(jìn)行高通量測(cè)序，利用相關(guān)算法實(shí)現(xiàn)胎兒染色體疾病分析，并設(shè)置空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果采用Z值評(píng)分，正常范圍為-3～3，Z>3或<-3為高風(fēng)險(xiǎn)。NIPS篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦要求行穿刺術(shù)-染色體核型分析或全基因組拷貝數(shù)變異分析(CNV-seq)排除胎兒染色體異常。NIPS提示低風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果，孕婦需定期進(jìn)行超聲診斷等相關(guān)檢查。隨訪高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的產(chǎn)前診斷和妊娠結(jié)局。

1.3 cffDNA比例計(jì)算方法 根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)中DNA片段的分布情況和Y染色體片段所占比例，計(jì)算血漿中FF[9]。

1.4 侵入性產(chǎn)前診斷 常規(guī)消毒，超聲輔助引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)。CNV-seq分析：提取樣本DNA 1～1.5μg；將DNA打斷、擴(kuò)增，構(gòu)建基因組文庫(kù)；利用Nextseq CN500測(cè)序平臺(tái)測(cè)序和分析數(shù)據(jù)。染色體核型分析：羊水細(xì)胞1600r/min離心10min，在沉淀物加入羊水培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)至10～12d觀察羊水細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。生長(zhǎng)良好的細(xì)胞加入秋水仙素，經(jīng)37℃低滲、固定、制片、烤片、胰酶消化、G顯帶，利用染色體核型分析系統(tǒng)(MetaSystems Ikaros，德國(guó)蔡司)采集與分析染色體中期分裂相。核型按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制ISCN2020進(jìn)行描述與診斷。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究人群資料 收集了18045例孕婦的年齡、孕周、BMI、單胎/雙(多)胎和妊娠方式等臨床資料，見表1。從表1可以看出，孕婦孕周跨度較大，最大孕周36+4周，不符合國(guó)衛(wèi)辦婦幼發(fā)[2016]45號(hào)要求。臨床上，若檢測(cè)中心NIPS報(bào)告周期短，且孕婦強(qiáng)烈要求行NIPS，可考慮為因超聲軟指標(biāo)異常的孕晚期孕婦行NIPS，排除胎兒染色體異常，減輕孕婦的焦慮心理。

表1 18045例妊娠孕婦特征和胎兒比例

2.2 游離胎兒DNA比例分布 18045例妊娠游離FF的最小值和最大值分別為3.00%和52.95%，中位數(shù)11.65%(表1)。按分布例數(shù)>100例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，F(xiàn)F主要分布在4%～25%。18045例妊娠孕婦中，單胎妊娠17363例，雙/多胎妊娠682例；自然妊娠17104例，輔助生殖妊娠941例。單胎妊娠胎兒FF的最小值和最大值分別為3.00%和52.95%，中位數(shù)11.66%，平均值為12.32%；雙/多胎妊娠胎兒FF的最小值和最大值分別為3.01%和34.52%，中位數(shù)11.29%(表1)，平均值為11.82%。單胎和雙/多胎妊娠胎兒FF之間存在差異(P<0.05)。自然妊娠胎兒FF的最小值和最大值分別為3.00%和52.95%，中位數(shù)11.69%(表1)，平均值為12.35%；輔助生殖妊娠胎兒FF的最小值和最大值分別為3.04%和32.47%，中位數(shù)10.43%，平均值為11.26%。自然和輔助生殖妊娠胎兒FF之間存在差異(P<0.05)。

2.3 游離FF與孕婦年齡、孕周和BMI的關(guān)系 游離FF與孕婦年齡呈明顯負(fù)相關(guān)(R2=0.8783，P<0.05)，與孕周呈明顯正相關(guān)(R2=0.9291，P<0.05)，見圖1A、B。隨著孕婦年齡的增大，孕婦的BMI也明顯增大(圖1C)。孕婦BMI與游離FF均呈負(fù)相關(guān)(R2=0.8936，P<0.05)(圖1D)。將大于1000例孕周的BMI進(jìn)行分組(BMI≤21kg/m2，21～31kg/m2和BMI>31kg/m2)，結(jié)果顯示，除孕19周外，游離FF隨著孕婦BMI的增大而逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。孕19周游離FF隨著孕婦BMI增大而逐漸減少，BMI<21kg/m2組與其他兩組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，21～31kg/m2組與BMI>31kg/m2組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

圖1 FF與孕婦年齡、孕周和BMI的關(guān)系

表2 不同孕周BMI分組與FF的關(guān)系

2.4 游離胎兒DNA比例與NIPS高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的關(guān)系 行NIPS檢測(cè)的18045例孕婦中，400例胎兒為高風(fēng)險(xiǎn)(表3)，其中310例行產(chǎn)前診斷，確診129例，總體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(positive predictive values,PPVs)為41.61%，未做產(chǎn)前診斷或失訪90例。低風(fēng)險(xiǎn)胎兒的游離FF(平均值為12.28%)與高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的游離FF(平均值為13.17%)、真陽(yáng)性胎兒的游離FF(平均值為13.90%)均存在差異(P<0.05)；真陽(yáng)性胎兒的游離FF(平均值為13.90%)與假陽(yáng)性胎兒的游離FF(平均值為12.64%)之間存在差異(P<0.05)，見圖2。

表3 NIPS提示高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的產(chǎn)前診斷

圖2 NIPS提示不同風(fēng)險(xiǎn)胎兒的游離FF比較

18045例孕婦中，NIPS提示T21、T18和T13高風(fēng)險(xiǎn)分別為84、9例和7例，行產(chǎn)前診斷分別有77、6和6例，確診分別有56、5和2例。隨著T21、T18和T13的胎兒游離FF增加，Z值也增加，呈現(xiàn)正相關(guān)，但系數(shù)率分別為0.2313、0.3621和0.4173(圖3)。由于樣本例數(shù)的限值，進(jìn)一步比較了T21真陽(yáng)性胎兒的游離FF與Z值相關(guān)性(圖3B)，二者的相關(guān)性較T21高風(fēng)險(xiǎn)樣本(圖3A)提高，系數(shù)率為0.6555，提示胎兒染色體異常與游離FF呈一定的相關(guān)性。

圖3 NIPS提示T21、T18和T13高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的Z值與FF的關(guān)系

微缺失綜合征組的高風(fēng)險(xiǎn)樣本(FF平均值12.73%)與真陽(yáng)性樣本(FF平均值15.84%)以及真陽(yáng)性樣本(FF平均值15.84%)與假陽(yáng)性樣本(FF平均值10.86%)之間差異顯著(P<0.05)(圖4A)。微重復(fù)綜合征組的高風(fēng)險(xiǎn)樣本、真陽(yáng)性樣本和假陽(yáng)性樣本之間沒(méi)有差異(圖4B)。SCAs組的真陽(yáng)性樣本(FF平均值13.90%)與假陽(yáng)性樣本(FF平均值11.39%)之間差異顯著(P<0.05)(圖4C)。

圖4 NIPS提示微缺失綜合征、微重復(fù)綜合征和SCAs高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的FF差異比較

3 討 論

孕婦血漿游離DNA包括孕婦自身游離DNA和cffDNA，而cffDNA僅是其中一小部分，其影響因素很多，如孕婦年齡、孕周、孕婦體質(zhì)量指數(shù)以及異常染色體等[4]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)F主要分布范圍是4%～25%；FF與孕周呈正相關(guān)，與孕婦年齡和BMI呈負(fù)相關(guān)；異常胎兒的FF高于低風(fēng)險(xiǎn)胎兒的FF，且差異顯著，與相關(guān)報(bào)道相符[10-11]。

自然妊娠情況下，雙/多胎妊娠的概率約為1.1%。近年來(lái)，隨著醫(yī)源性促排卵藥物、避孕藥的使用和輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用，雙/多胎妊娠比例增高。研究顯示，無(wú)論是雙絨毛膜妊娠還是單絨毛膜妊娠，胎兒的FF都低于單胎妊娠，但總FF高于單胎妊娠胎兒FF[12]?；赟NP技術(shù)的NIPS分析顯示，雙絨毛膜和單絨毛膜妊娠胎兒的組合FF分別比單卵妊娠胎兒高35%和26%[13]。也有研究顯示，雙胎妊娠的FF低于單胎妊娠[14-15]。本研究中，雙/多胎妊娠682例，輔助生殖妊娠941例，單胎FF高于雙/多胎，與Sarno等研究結(jié)果一致[14]；自然妊娠胎兒FF高于輔助生殖妊娠胎兒，與Talbot等研究結(jié)果一致[16]，但也與相關(guān)報(bào)道存在差異，可能原因包括：(1)本研究納入妊娠孕婦人群復(fù)雜，不是單一類型孕婦[17]；(2)結(jié)合單胎和雙胎妊娠，多元邏輯回歸分析表明，F(xiàn)F隨著胎臀長(zhǎng)度、PAPP-A、MOM和游離β-hCG MoM增加而增加，隨孕婦年齡和BMI增加而降低[14]；(3)輔助植入胚胎導(dǎo)致孕周計(jì)算發(fā)生不同或胚胎在孕婦體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育速度與同期大小的自然妊娠胚胎不一致[18-19]。因此，雙胎和輔助生殖妊娠胎兒的孕婦選擇NIPS時(shí)，應(yīng)推遲于單胎和自然妊娠胎兒的孕周。

本研究結(jié)果顯示，T21、T18和T13的PPVs較低，尤其T21的PPVs為72.73%。許多因素如胎兒分?jǐn)?shù)、限制性胎盤鑲嵌(confined placental mosaicism,CPM)、母體拷貝數(shù)變異、母體惡性腫瘤、雙胞胎消失、檢測(cè)程序、分類算法(Z值評(píng)分)和測(cè)序平臺(tái)都可能影響NIPS檢測(cè)染色體異常的PPVs[17,20]。CPM可能是導(dǎo)致NIPS假陽(yáng)性的主要原因之一[21]。一部分假陽(yáng)性是由于標(biāo)本Z值波動(dòng)達(dá)到閾值，如T21的33即為高風(fēng)險(xiǎn)。21例假陽(yáng)性樣本中，18例樣本的Z<5。因此，PPVs偏低的原因可能是標(biāo)本Z值波動(dòng)達(dá)到閾值被報(bào)告陽(yáng)性，臨床檢測(cè)過(guò)程中需要設(shè)置一個(gè)灰區(qū)，如39%，但Z<5，證實(shí)為假陽(yáng)性，所以綜合評(píng)估FF和Z評(píng)分可能有助于預(yù)測(cè)假陽(yáng)性病例。

本研究顯示，F(xiàn)F與孕婦孕周呈正相關(guān)，與孕婦BMI、年齡呈負(fù)相關(guān)，與先前研究相同[6,22-24]。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)，妊娠21周以后，F(xiàn)F快速增加。最近研究報(bào)道，F(xiàn)F在妊娠20周后增加了10倍，且隨著孕周增加而增加。原因是隨著孕婦孕周增加，胎盤體積增大，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增多，釋放到孕婦外周血液中的DNA片段增加，導(dǎo)致FF增加[26]。FF與孕婦BMI呈負(fù)相關(guān)的可能原因是孕婦體重增大導(dǎo)致其血液循環(huán)體系稀釋了血漿中cffDNA，同時(shí)血液中相對(duì)增多的凋亡脂肪細(xì)胞增加了血漿中母親游離DNA含量，導(dǎo)致cffDNA比例下降。FF與孕婦年齡的關(guān)系各研究結(jié)果不同，Hou等研究顯示FF與孕婦年齡呈負(fù)相關(guān)[10]，也有研究表明FF與孕婦年齡沒(méi)有相關(guān)性[27]。本研究結(jié)果與Hou等[10]類似，孕婦BMI與年齡呈正相關(guān)，可能原因是隨著年齡增加，孕婦的生理機(jī)制發(fā)生了變化，如體重增加，各種新陳代謝譜的改變，細(xì)胞凋亡增加等，導(dǎo)致FF下降[28-29]。綜上，對(duì)于高齡和高BMI的孕婦選擇合適孕周進(jìn)行NIPS檢測(cè)，且要關(guān)注FF，同時(shí)建議孕婦進(jìn)行產(chǎn)前遺傳咨詢，控制體重，幫助提高NIPS的準(zhǔn)確性。

本研究顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組胎兒FF與低風(fēng)險(xiǎn)組FF存在差異，真陽(yáng)性組FF與低風(fēng)險(xiǎn)組和假陽(yáng)性組FF存在差異，且T21、T18和T13的FF與Z值呈正相關(guān)，研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[30]。關(guān)于NIPS提示異常與正常胎兒FF的差異存在不同研究結(jié)果。Kinnings等研究顯示，與整倍體樣本相比，T21陽(yáng)性樣本的FF整體上升，而T18和T13陽(yáng)性樣本的FF下降[6]。Rava等研究顯示，與整倍體胎兒相比，21-三體胎兒的母體血漿中FF較高，18-三體、13-三體或X-單體母體血漿中FF較低[27]。研究顯示，與整倍體樣本相比，T21樣本在妊娠16周后FF相對(duì)增加，而T18和T13樣本的FF在妊娠21周和18周后相對(duì)下降[6]，這可能是臨床上T21篩查的敏感性和特異性接近100%的原因。本研究中，NIPS提示微重復(fù)綜合征高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的例數(shù)(119/18045)大于微缺失綜合征高風(fēng)險(xiǎn)胎兒(74/18045)，但微缺失綜合征的PPVs(40.63%)高于微重復(fù)綜合征的PPVs(23.46%)。根據(jù)兩組FF差異的比較，猜測(cè)微缺失綜合征PPVs高于微重復(fù)綜合征PPVs的可能原因是微缺失導(dǎo)致單倍劑量不足，微重復(fù)導(dǎo)致三倍劑量敏感，但單倍劑量不足比三倍劑量敏感在劑量敏感性上對(duì)機(jī)體的影響更大[31-32]。此外，在臨床中，微缺失更有可能是致病性，而微重復(fù)一般難以解釋，比微缺失使用更大的閾值[31-32]。

本研究從不同角度比較了游離FF的差異，高風(fēng)險(xiǎn)胎兒FF高于低風(fēng)險(xiǎn)胎兒。孕婦血漿cffDNA水平受母體和胎兒特征的共同影響。臨床實(shí)踐中，應(yīng)根據(jù)孕婦特征以及FF進(jìn)行NIPS的遺傳咨詢，如孕婦為雙/多胎或輔助生殖妊娠，建議適當(dāng)推遲孕周行NIPS，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。