水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種技術(shù)研究綜述

◎ 文/于涵 郭貴良 牛小天 鄭偉 王桂芹

水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種技術(shù)能夠培育出高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)、抗病力強(qiáng)的苗種，是水產(chǎn)動(dòng)物育種領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。文章系統(tǒng)地梳理了國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種技術(shù)的研究，在回顧相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)該技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程、研究品種、研究?jī)?nèi)容等進(jìn)行了特征總結(jié)，以期為后續(xù)更深入的研究提供參考。

20世紀(jì)中期以來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展為全人類食品供給作出了巨大貢獻(xiàn)。隨著全球經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們的生活水平日益提升，對(duì)高品質(zhì)食物攝入的需求也在逐步提高，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)顯得尤為重要。在此背景下，培育高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)、抗病力強(qiáng)的水產(chǎn)動(dòng)物品種乃大勢(shì)所趨。為培育出更能滿足人類需求的水產(chǎn)動(dòng)物，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)專家致力于水產(chǎn)動(dòng)物三倍體研究，已取得了豐碩的成果。

三倍體是指生物體細(xì)胞中含有三個(gè)染色體組的個(gè)體。水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種技術(shù)是“染色體組工程”的一部分，是指通過(guò)一定的誘導(dǎo)方式增加水產(chǎn)動(dòng)物的染色體組來(lái)改造水產(chǎn)動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)，從而培育出性狀優(yōu)良的水產(chǎn)動(dòng)物品種，以滿足人們的需求。通過(guò)三倍體育種技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的三倍體水產(chǎn)動(dòng)物在理論上是不可育的。由于三倍體自身的不育性，所以沒(méi)有性成熟時(shí)用于性腺發(fā)育的能量消耗，同時(shí)也能夠避免水產(chǎn)動(dòng)物因產(chǎn)卵而導(dǎo)致的生長(zhǎng)停滯及身體損傷，因此大多數(shù)三倍體水產(chǎn)動(dòng)物會(huì)比與其同種類同時(shí)期的二倍體有更快的生長(zhǎng)速度、更好的品質(zhì)、更長(zhǎng)的生命周期、更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前，水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種方式概括起來(lái)可以分為物理、化學(xué)和生物三種。物理誘導(dǎo)方式主要有冷休克誘導(dǎo)、熱休克誘導(dǎo)、靜水壓休克誘導(dǎo)等方式；化學(xué)誘導(dǎo)方式主要有細(xì)胞松弛素B誘導(dǎo)、秋水仙素誘導(dǎo)、咖啡因誘導(dǎo)等方式；生物方式主要是遠(yuǎn)緣雜交、核移植和細(xì)胞融合等方式。在進(jìn)行水產(chǎn)動(dòng)物三倍體誘導(dǎo)時(shí)可根據(jù)研究對(duì)象的不同特點(diǎn)來(lái)選擇合適的方式進(jìn)行誘導(dǎo)以達(dá)到最佳效果。

本文在回顧國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種技術(shù)研究文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，總結(jié)了國(guó)內(nèi)外研究的各自特點(diǎn)，并提出了可以重點(diǎn)發(fā)展的方向，以期為后續(xù)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種技術(shù)的深入研究提供參考。

一、國(guó)外水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種技術(shù)的研究進(jìn)展

關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物三倍體誘導(dǎo)的報(bào)道，最早可追溯到20世紀(jì)40年代，Mrkino和Ojima以鯉魚(yú)為研究對(duì)象，將鯉魚(yú)受精卵進(jìn)行冷休克誘導(dǎo)處理（處理?xiàng)l件：受精后5min～10min，溫度0.5℃～3℃處理10min～30min），處理后經(jīng)細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，通過(guò)冷休克處理能有效地抑制卵子的第二次減數(shù)分裂，保留了原本將成為第二極體的單倍體染色體組，從而引起卵子的染色體組加倍，形成了二倍體卵核。與此同時(shí)，二人提出當(dāng)二倍體卵核與單倍體精核結(jié)合后，可能形成三倍體的合子進(jìn)而發(fā)育產(chǎn)生三倍體個(gè)體。雖然并沒(méi)有后續(xù)報(bào)道說(shuō)明兩位研究者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果最后是否培育出了三倍體成魚(yú)，但這一實(shí)驗(yàn)過(guò)程為后來(lái)進(jìn)行人工誘導(dǎo)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

最早成功誘導(dǎo)出水產(chǎn)動(dòng)物三倍體的研究者是Swarup，他采用冷休克方式成功地誘導(dǎo)出了三棘刺魚(yú)的三倍體（處理?xiàng)l件：受精后3min，溫度0℃處理1.5h～3h），并且經(jīng)過(guò)飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)將三倍體三棘刺魚(yú)培育至性成熟。1972年，Purdom通過(guò)冷休克對(duì)海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類鰈和川鰈雜種進(jìn)行人工誘導(dǎo)三倍體獲得了成功（處理?xiàng)l件：受精后15min，溫度0℃處理3.5h），并養(yǎng)至成魚(yú)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者開(kāi)始嘗試通過(guò)化學(xué)方式進(jìn)行水產(chǎn)動(dòng)物三倍體的誘導(dǎo)。1979年，Aellen等通過(guò)注射細(xì)胞松弛素B的方式對(duì)大西洋鮭進(jìn)行了三倍體的制備（處理?xiàng)l件：受精后32h，濃度10μg/mL處理12h），最終得到了嵌合體仔魚(yú)。

到20世紀(jì)80、90年代后，越來(lái)越多的研究者投入到了水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種研究工作中，這一時(shí)期，水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種研究工作不僅在研究品種上豐富起來(lái)，在研究結(jié)果上也較為成功，此時(shí)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)可以獲得較高的三倍體誘導(dǎo)率。Colombo等采用冷休克方式對(duì)狼鱸進(jìn)行了三倍體的誘導(dǎo)（處理?xiàng)l件：受精后5min，溫度0℃～2℃處理20min），得到了90%左右的三倍體率；Gorshkov等通過(guò)熱休克方法對(duì)金鯛進(jìn)行三倍體的誘導(dǎo)（處理?xiàng)l件：受精后3min，溫度37℃處理5min），結(jié)果顯示三倍體誘導(dǎo)率100%；Holmefjord等采用熱休克方式對(duì)庸鰈進(jìn)行三倍體的誘導(dǎo)（處理?xiàng)l件：受精后15min，溫度24℃處理15min～30min），得到的三倍體誘導(dǎo)率為84%。

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種的研究進(jìn)入了快速發(fā)展階段，取得了一系列重大研究成果，這期間，除了研究品種的增多外，在研究?jī)?nèi)容上也變得更加豐富，研究者在人工誘導(dǎo)三倍體的基礎(chǔ)上，開(kāi)展了三倍體與普通二倍體的差異化分析研究工作。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體與普通二倍體在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中存在差異，且三倍體在性狀表現(xiàn)上普遍比二倍體更顯優(yōu)勢(shì)。Leal等通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三倍體高首鱘相比二倍體對(duì)環(huán)境脅迫有更高的敏感性；Matti等對(duì)二倍體和三倍體虹鱒進(jìn)行了生長(zhǎng)比較，發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)期三倍體組的日生長(zhǎng)系數(shù)均值和飼料轉(zhuǎn)化率均高于二倍體；挪威研究者通過(guò)將三倍體和二倍體大西洋鮭魚(yú)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)三倍體具有比二倍體更好的淡水和早期海水生長(zhǎng)性能。當(dāng)然也有一些研究表明在某些種類上，三倍體與二倍體差異不明顯或三倍體與二倍體相比處于劣勢(shì)。研究者在進(jìn)行細(xì)鱗大馬哈魚(yú)三倍體誘導(dǎo)后，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)鱗大馬哈魚(yú)三倍體成魚(yú)的生長(zhǎng)性能明顯比二倍體差；在對(duì)北極紅點(diǎn)鮭研究中，發(fā)現(xiàn)從幼魚(yú)到成魚(yú)的過(guò)程中，三倍體與二倍體在生長(zhǎng)上沒(méi)有顯著差異。

目前為止，國(guó)外研究者已在近50余種水產(chǎn)動(dòng)物中成功誘導(dǎo)出了三倍體，研究的對(duì)象包括虹鱒、美洲牡蠣、哲羅鮭、馬蘇大麻哈、大菱鲆等。所誘導(dǎo)種類中，虹鱒、大西洋鮭等三倍體育種體系最為成熟，并已開(kāi)始在世界范圍內(nèi)廣泛地開(kāi)展商業(yè)化養(yǎng)殖。

二、國(guó)內(nèi)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種技術(shù)的研究進(jìn)展

我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種工作開(kāi)始于20世紀(jì)70年代。1976年，我國(guó)研究人員通過(guò)溫度休克法對(duì)草魚(yú)進(jìn)行了三倍體誘導(dǎo)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得了約57%的草魚(yú)三倍體，由此開(kāi)啟了我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種的研究工作。

20世紀(jì)80、90年代，我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種研究工作開(kāi)始快速發(fā)展，這一時(shí)期，在三倍體誘導(dǎo)方法上仍多采用物理方式，并且隨著配套技術(shù)的完善，更多使用一些專業(yè)儀器來(lái)進(jìn)行三倍體的制備。桂建芳等通過(guò)使用靜水壓力機(jī)對(duì)水晶彩鯽進(jìn)行靜水壓處理（處理?xiàng)l件：受精后4min～5min，壓力65MPa處理3min）成功獲得了三倍體成魚(yú)；尹洪濱等通過(guò)靜水壓方式對(duì)鯰魚(yú)進(jìn)行三倍體的誘導(dǎo)（處理?xiàng)l件：受精后4min～5min，壓力60MPa～64MPa處理3min）得到了鯰魚(yú)三倍體幼魚(yú)；付佩勝等對(duì)淡水鯧進(jìn)行了靜水壓處理（處理?xiàng)l件：受精后4min，壓力60MPa處理1.5min）獲得了三倍體胚胎。

21世紀(jì)以來(lái)，我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體研究工作在研究?jī)?nèi)容上也逐漸豐富起來(lái)，除了研究種類增多外，也開(kāi)始更多地關(guān)注三倍體與二倍體的差異性研究以及對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體制備條件的探討。在差異性研究方面，魏凱等對(duì)二、三倍體細(xì)鱗鮭幼魚(yú)進(jìn)行了為期90d的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定了實(shí)驗(yàn)魚(yú)的體長(zhǎng)、體重、肥滿度、存活率等生長(zhǎng)指標(biāo)，綜合結(jié)果顯示，三倍體細(xì)鱗鮭幼魚(yú)的生長(zhǎng)特性要明顯地優(yōu)于二倍體幼魚(yú)；李寶玉等同時(shí)對(duì)二、三倍體團(tuán)頭魴進(jìn)行生長(zhǎng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)團(tuán)頭魴二、三倍體的生長(zhǎng)性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，在一齡之前，三倍體生長(zhǎng)速度與二倍體相近，一齡后三倍體生長(zhǎng)速度較二倍體快，生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)明顯；江濤為了解二、三倍體黃顙魚(yú)的形態(tài)特征區(qū)別，選取了性成熟的黃顙魚(yú)二、三倍體雌雄個(gè)體，分別測(cè)量了全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體高等魚(yú)體各形態(tài)指標(biāo)，根據(jù)測(cè)量結(jié)果比較研究，得出結(jié)論：同時(shí)期的三倍體黃顙魚(yú)在體積上比二倍體黃顙魚(yú)大，并且頭部、腹鰭、背鰭和尾部等大部分結(jié)構(gòu)都比二倍體大。

在三倍體制備條件方面，付佩勝等對(duì)靜水壓休克法誘導(dǎo)淡水鯧魚(yú)三倍體的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了探究，結(jié)果表明，在精卵結(jié)合4min時(shí)，采用60MPa靜水壓處理1.5min，可獲得最高三倍體誘導(dǎo)率；尤穎哲在進(jìn)行雙斑東方鲀?nèi)扼w誘導(dǎo)條件研究時(shí)，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在水溫18℃～20℃，受精后5min，采用10MPa～15MPa的靜水壓強(qiáng)，對(duì)雙斑東方鲀處理5min～7min誘導(dǎo)效果最好，可獲得96.67%以上的三倍體誘導(dǎo)率，并且孵化率能達(dá)到77%以上；張薇薇等在石斑魚(yú)受精6min后，采用溫度為4℃～6℃的冷休克對(duì)石斑魚(yú)誘導(dǎo)17.5min，獲得了最高三倍體率約80%左右。

從20世紀(jì)70年代中期開(kāi)始，至今，我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種工作已有近50年的歷程，收獲頗多。通過(guò)研究，目前已獲得草魚(yú)、鯉魚(yú)、鰱魚(yú)、鯽魚(yú)、虹鱒、大鱗副泥鰍、牙鲆、馬蘇大麻哈、半滑舌鰨、合浦珠母貝等多種水產(chǎn)動(dòng)物的三倍體，其中三倍體的異育銀鯽、湘云鯽、湘云鯉已進(jìn)入到了實(shí)用化的生產(chǎn)階段。

三、小結(jié)與展望

三倍體育種技術(shù)在20世紀(jì)末非常盛行，研究的人也很多，但在當(dāng)時(shí)只是作為一種新的生物工程技術(shù)在研究，雖然當(dāng)時(shí)國(guó)內(nèi)外研究者已獲得了多種水產(chǎn)動(dòng)物的三倍體，但在所研究的品種中，多數(shù)品種的三倍體育種研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，由于相關(guān)配套技術(shù)的制約無(wú)法廣泛運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中，在生產(chǎn)上的針對(duì)性不強(qiáng)，因而沒(méi)能顯現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，所以自21世紀(jì)開(kāi)始，研究此技術(shù)的人逐漸減少。近幾年，隨著生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展和提高，以及水產(chǎn)育種技術(shù)的更加精細(xì)化，人們開(kāi)始更有針對(duì)性地將三倍體技術(shù)應(yīng)用到水產(chǎn)育種當(dāng)中，使得三倍體育種技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展。例如陸封型馬蘇大馬哈魚(yú)品質(zhì)優(yōu)良，發(fā)展前景極為廣闊，但制約其進(jìn)一步發(fā)展的因素就是性成熟時(shí)個(gè)體很小，而且性成熟后便立即死亡，為能夠獲得較大個(gè)體的陸封型馬蘇大馬哈魚(yú)，人們開(kāi)始期待并嘗試通過(guò)三倍體育種技術(shù)來(lái)制備三倍體苗種。再比如灘頭魚(yú)，是非常優(yōu)良的養(yǎng)殖品種，但生長(zhǎng)速度較慢，所以或許人們也可以通過(guò)三倍體育種技術(shù)來(lái)解決灘頭魚(yú)生長(zhǎng)較慢的問(wèn)題。由于三倍體育種技術(shù)在使用上變得更具有針對(duì)性，再加上其技術(shù)更加成熟，因而使得三倍體育種技術(shù)迎來(lái)了新一輪的研究高峰。

雖然目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在水產(chǎn)動(dòng)物三倍體育種方面進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的成果，但從總體來(lái)看，仍存在值得進(jìn)一步研究和改進(jìn)之處。

在當(dāng)前的研究中，雖然可以通過(guò)對(duì)受精卵的處理得到較高的三倍體誘導(dǎo)率，但在后續(xù)的孵化過(guò)程中一些品種三倍體的成活率較低，這在很大程度上是由于處理過(guò)程中誘導(dǎo)方法不完善所導(dǎo)致的。在水產(chǎn)動(dòng)物三倍體誘導(dǎo)的三種方式中，生物方式在誘導(dǎo)過(guò)程中操作較為復(fù)雜，并且易出現(xiàn)嵌合體，會(huì)改變優(yōu)勢(shì)性狀，所以應(yīng)用相對(duì)較少；化學(xué)方式雖可以成功誘導(dǎo)出三倍體，但其成本較高，部分化學(xué)誘導(dǎo)劑具有毒性，對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象和養(yǎng)殖環(huán)境都有一定的影響，所以在使用上存在一定的限制性；應(yīng)用較為普遍的是物理方式，其中對(duì)溫度變化較為敏感的水產(chǎn)動(dòng)物可以采用溫度休克法對(duì)其進(jìn)行三倍體的誘導(dǎo)，一般冷水性動(dòng)物使用熱休克誘導(dǎo)，熱水性動(dòng)物使用冷休克誘導(dǎo)；而對(duì)溫度敏感性較低的水產(chǎn)動(dòng)物，如勃氏雅羅魚(yú)、水晶彩鯽等溫水性動(dòng)物宜采用靜水壓休克法來(lái)進(jìn)行三倍體的誘導(dǎo)。

雖然物理方式不會(huì)影響環(huán)境，處理程序也相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化，但采用物理方法進(jìn)行三倍體誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)效果也會(huì)受到處理開(kāi)始的時(shí)間、處理強(qiáng)度的大小以及處理的持續(xù)時(shí)間所限制。

比如處理開(kāi)始的時(shí)間選擇，處理過(guò)早或過(guò)晚都會(huì)直接影響三倍體誘導(dǎo)率，只有準(zhǔn)確找出三倍體開(kāi)始誘導(dǎo)的最佳時(shí)間，才能獲得更好的誘導(dǎo)效果。為此建議，可以通過(guò)采取對(duì)受精卵進(jìn)行切片觀察的方式來(lái)開(kāi)展受精細(xì)胞學(xué)研究，充分了解受精卵發(fā)育的具體過(guò)程，從而準(zhǔn)確找出進(jìn)行三倍體誘導(dǎo)的最佳開(kāi)始時(shí)間，以優(yōu)化三倍體誘導(dǎo)方法，最終提高三倍體誘導(dǎo)率及成活率。

再比如處理強(qiáng)度和處理持續(xù)時(shí)間的問(wèn)題，對(duì)受精卵來(lái)說(shuō)處理強(qiáng)度過(guò)大或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)影響受精卵的成活率；而處理強(qiáng)度過(guò)小或處理時(shí)間過(guò)短又達(dá)不到誘導(dǎo)的效果；而且在進(jìn)行三倍體誘導(dǎo)時(shí)不同種類的水產(chǎn)動(dòng)物所需的處理強(qiáng)度和處理持續(xù)時(shí)間也不同。所以在使用物理方法誘導(dǎo)三倍體生產(chǎn)時(shí)，在找準(zhǔn)處理開(kāi)始時(shí)間的基礎(chǔ)上，可以通過(guò)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)的方式來(lái)確定處理強(qiáng)度的大小和處理持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短，從而得出最佳的三倍體誘導(dǎo)條件。

水產(chǎn)動(dòng)物三倍體具有生長(zhǎng)速度快，品質(zhì)高，生命周期長(zhǎng)等養(yǎng)殖優(yōu)勢(shì)。若將三倍體育種技術(shù)廣泛應(yīng)用于名特優(yōu)水產(chǎn)動(dòng)物育種研究中，可大幅度提升養(yǎng)殖動(dòng)物品質(zhì)、提高養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)速度、增加養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)效益，從而促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。