基于系統(tǒng)生物學的針刺治療經(jīng)脈分子機制研究

王晰，雷蕾，熊婕，李海燕，孫華君，劉華云，韓晨靜

1.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617

中醫(yī)認為生命能量或氣通過經(jīng)脈系統(tǒng)流動。經(jīng)脈系統(tǒng)包括十二經(jīng)脈和奇經(jīng)八脈，通常我們分析十四經(jīng)脈，即十二經(jīng)脈、任脈和督脈。隨著生物醫(yī)學的快速發(fā)展，從生物機制方面詮釋經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)可在一定程度上從現(xiàn)代醫(yī)學角度認識傳統(tǒng)經(jīng)脈，有助于理解中醫(yī)理論中針灸的現(xiàn)代醫(yī)學內(nèi)涵，建立中西醫(yī)溝通的橋梁。瞿巧鈺[1]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，針刺肺經(jīng)“太淵”能治療小鼠哮喘，可能與調(diào)節(jié)毒蕈堿受體M1、M2、M3表達有關(guān)。鐘艷等[2]研究不同經(jīng)脈配穴法針刺對急性胃黏膜損傷大鼠相關(guān)細胞因子表達的影響，發(fā)現(xiàn)表里經(jīng)配穴法側(cè)重于調(diào)整腫瘤壞死因子-α，生長抑素的合成、釋放及促進表皮生長因子的表達。

系統(tǒng)生物學可以從改善或恢復生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度認識生物學機制，從而對生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)進行整體分析。Han等[3]采用系統(tǒng)生物學方法，通過文本挖掘、生物信息學、網(wǎng)絡(luò)拓撲學等計算，系統(tǒng)揭示針刺治療COVID-19的多靶點機制。本課題組前期構(gòu)建了針刺效應(yīng)數(shù)據(jù)展示平臺（http://acupuncture.cintcm.ac.cn:8080/pviewer/），采集了大量針刺動物實驗機制研究數(shù)據(jù)。本文以針刺穴位及產(chǎn)生調(diào)控作用的靶點為研究對象，通過計算獲得十四經(jīng)脈常見的穴位、作用靶點，利用系統(tǒng)生物學方法開展經(jīng)脈共性生物學表征分析，為經(jīng)脈的現(xiàn)代生物學機制研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 腧穴和靶點獲取

本研究腧穴和靶點原始數(shù)據(jù)來自針刺效應(yīng)數(shù)據(jù)展示平臺動物實驗數(shù)據(jù)[4]，該平臺有嚴格的文獻納入和排除標準，目前已經(jīng)納入2019年及以前的針刺動物實驗文獻14 284篇，涉及穴位459個，累計頻次19 943次，功能評分、微觀機能、分子水平（靶點數(shù)據(jù)）等針刺效應(yīng)頻次累計7 565次。

考慮到針刺一組穴位對相應(yīng)基因表達的影響并不能清楚反映單獨腧穴與基因的關(guān)系，不利于深入探究腧穴、經(jīng)脈和靶點之間的關(guān)系。因此選擇針刺單獨穴位的相應(yīng)基因表達數(shù)據(jù)進行進一步分析。最終納入文獻1 194篇，涉及腧穴99個，對應(yīng)靶點422個。

1.2 數(shù)據(jù)規(guī)范及標準化

穴位名稱及歸經(jīng)參照《腧穴名稱與定位》[5]進行標準化處理，如將“關(guān)原”規(guī)范為“關(guān)元”。以上過程由2名數(shù)據(jù)人員獨立完成，一名加工，一名審校，確認無誤后納入數(shù)據(jù)庫使用。使用UniProt 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/uniprot/）將靶點蛋白英文名稱統(tǒng)一規(guī)范為人類基因名稱。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Office Access2007對規(guī)范后的數(shù)據(jù)進行頻次統(tǒng)計。使用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建經(jīng)脈-腧穴-靶點網(wǎng)絡(luò)，選取Degree值＞9的節(jié)點作為核心靶點，使用Metascape（https://metascape.org/gp/index.html）對核心靶點進行GO 功能、KEGG 通路富集分析和DisGeNET 富集分析，以Pvalue≤0.05 選取生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞組分（CC）、KEGG通路和DisGeNET結(jié)果。計算結(jié)果導入易漢博在線繪圖平臺（http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/）進行可視化處理。最后，使用DAVID6.8（https://david.ncifcrf.gov/）對十四經(jīng)脈特異性靶點相關(guān)疾病進行分析，勾選GAD_DISEASE、GAD_DISEASE_CLASS和OMIM_DISEASE，其余為系統(tǒng)默認值。

2 結(jié)果

2.1 腧穴歸經(jīng)

參照《腧穴名稱與定位》對納入的99個腧穴所屬經(jīng)脈進行統(tǒng)計，其中73個腧穴可歸入十四經(jīng)脈，見表1。

表1 73個腧穴所屬經(jīng)脈統(tǒng)計

2.2 經(jīng)脈-穴位-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

十四經(jīng)脈涉及腧穴73個，對應(yīng)的不重復靶點399個，其中足陽明胃經(jīng)對應(yīng)靶點最多，有206個，督脈其次，對應(yīng)靶點159個，見圖1。

圖1 十四經(jīng)脈腧穴對應(yīng)靶點

利用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建經(jīng)脈-腧穴-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)包括486個節(jié)點和1 110個相互作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)的平均自由度為4.6。選取Degree值＞9的49個靶點作為針刺十四經(jīng)脈效應(yīng)的核心靶點，構(gòu)建經(jīng)脈-腧穴-靶點核心網(wǎng)絡(luò)（包括4條經(jīng)脈、26個腧穴和19個靶點），見圖3。

圖2 針刺效應(yīng)經(jīng)脈-腧穴-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖3 針刺效應(yīng)經(jīng)脈-腧穴-靶點核心網(wǎng)絡(luò)

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

對核心網(wǎng)絡(luò)包含的19個靶點進行GO功能富集分析，共得到573條結(jié)果；KEGG通路富集分析得到99條通路。根據(jù)Metascape 分類，分別篩選每一類中LogP最小的結(jié)果制作可視化氣泡圖，見圖4。結(jié)果顯示，與十四經(jīng)脈密切相關(guān)的BP有凋亡信號通路、白細胞分化、對藥物的反應(yīng)、系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)、免疫球蛋白產(chǎn)生的調(diào)節(jié)等；CC有軸突、膜筏、神經(jīng)元細胞體、溶解液泡、線粒體膜等；MF有細胞因子受體結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、細胞黏附分子結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性等。與十四經(jīng)脈密切相關(guān)的通路有T細胞受體信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、HIF-1信號通路等。

圖4 核心靶點GO功能富集和KEGG通路富集氣泡圖

2.4 經(jīng)脈比較分析

使用Matescape分析十四經(jīng)脈的靶點，見圖5?？梢钥闯觯汴柮魑附?jīng)（ST）、督脈（GV）、手厥陰心包經(jīng)（PC）內(nèi)環(huán)淺橙色部分較多，說明這3條經(jīng)脈的特異性靶點較多。足陽明胃經(jīng)（ST）特異性靶點有ABCA1、CCL5、TIMP1、CCL2、RHEB等83個；督脈（GV）特異性靶點有GFRA1、FRA1、TNFRSF11 B、AGTR1、APLNR、CNR1等50個；手厥陰心包經(jīng)（PC）特異性靶點有ADORA2A、CYP2B6、ABCB1、GNAS、NLRP3等50個。

圖5 十四經(jīng)脈對應(yīng)靶點的Circos圖

2.5 DisGeNET富集分析

得到與十四經(jīng)脈相關(guān)的20個疾病，見圖6，具體包括炎癥、認知障礙、實驗性糖尿病、腦缺血、記憶障礙、神經(jīng)痛、老年前期癡呆、內(nèi)皮功能障礙、急性胰腺炎、蛛網(wǎng)膜下腔出血、急性心肌梗死、淀粉樣變、免疫抑制、腦梗死、再灌注損傷、大腦中動脈閉塞、脂肪肝、特應(yīng)性皮炎、呼吸道合胞病毒（RSV）在其他分類條件下和未指定部位的感染、痛覺過敏。

圖6 十四經(jīng)脈靶點DisGeNET富集分析熱圖

3 討論

經(jīng)脈學說是我國人民在長期臨床實踐中總結(jié)出來的，對臨床研究具有巨大的指導價值，經(jīng)脈的本質(zhì)研究仍是學術(shù)界的熱門領(lǐng)域。本文基于針刺效應(yīng)的動物實驗文獻，首先觀察到研究數(shù)量最多的十四經(jīng)脈有足陽明胃經(jīng)、督脈、手厥陰心包經(jīng)和足太陽膀胱經(jīng)，而通過核心網(wǎng)絡(luò)分析得到Degree值較高的十四經(jīng)脈也包括足陽明胃經(jīng)、督脈、足少陽膽經(jīng)和足太陽膀胱經(jīng)。結(jié)果顯示，在針刺效應(yīng)經(jīng)脈-腧穴-靶點網(wǎng)絡(luò)中，足少陽膽經(jīng)比手厥陰心包經(jīng)更為重要，可能因膽經(jīng)與胃經(jīng)、膀胱經(jīng)關(guān)系更緊密，治療病證更廣泛。足陽明胃經(jīng)、足少陽膽經(jīng)、足太陽膀胱經(jīng)皆為足陽經(jīng)，循行路線相似，三經(jīng)的腧穴均可治療頭面、五官、頸項、胸腹等病證[6]。

3.1 系統(tǒng)生物學分析結(jié)果體現(xiàn)出經(jīng)脈的廣譜調(diào)節(jié)作用

十四經(jīng)脈對應(yīng)的靶點有399個，核心靶點19個，其中IL6在免疫、組織再生和代謝方面具有多種生物學功能[7]。IL10是主要的免疫調(diào)節(jié)細胞因子[8]。BDNF在發(fā)育過程中可促進外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)選定神經(jīng)元群的存活和分化[9]。NGF對于交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持非常重要[10]。GO富集分析結(jié)果顯示，與十四經(jīng)脈密切相關(guān)的BP有系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)、細胞對生長因子刺激的反應(yīng)、免疫球蛋白產(chǎn)生的調(diào)節(jié)等。此外KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，與十四經(jīng)脈密切相關(guān)的通路有T細胞受體信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等。這些都體現(xiàn)出針刺效應(yīng)的廣譜調(diào)節(jié)作用，針刺對神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，可觸發(fā)人體廣譜反應(yīng)系統(tǒng)。而針刺的廣譜性在臨床上也得到了證實，據(jù)不完全統(tǒng)計，足三里已在183種現(xiàn)代疾病的針刺治療中得到應(yīng)用，幾乎涵蓋了針灸有效疾病的所有病種[6]。

3.2 系統(tǒng)生物學分析結(jié)果體現(xiàn)出經(jīng)脈的特異調(diào)節(jié)作用

與此同時，針刺效應(yīng)還具有特異性。本文從十四經(jīng)脈對應(yīng)的靶點比較發(fā)現(xiàn)，除了對應(yīng)靶點較少的手太陽小腸經(jīng)和手太陰肺經(jīng)外，其余經(jīng)脈都有特異的靶點，其中足陽明胃經(jīng)、督脈和手厥陰心包經(jīng)對應(yīng)的特異性靶點最多。足陽明胃經(jīng)對應(yīng)206個靶點，其中83個靶點為特異性靶點。足陽明胃經(jīng)在胸部穴位以治療呼吸循環(huán)疾病為主，腹部及下肢穴位以治療消化系統(tǒng)疾病、泌尿系統(tǒng)疾病和局部神經(jīng)肌肉病變?yōu)橹?。足陽明胃?jīng)對應(yīng)的特異性靶點中，ABCA1與脂肪消化吸收通路相關(guān)[11]，TIMP1 與胃炎、幽門螺桿菌感染、胃腫瘤相關(guān)[12]，CCL2與哮喘相關(guān)[13]，CCL5與膀胱癌相關(guān)[14]。督脈對應(yīng)159個靶點，其中50個靶點為特異性靶點。督脈的下腹部穴位主治泌尿和腸道疾病，上腹部穴位主治胃、腸、肝、脾疾病，胸段主治胸部內(nèi)臟疾病。根據(jù)“1.3”項下DAVID6.8的分析方法，可以得到督脈對應(yīng)的特異性靶點GFRA1 相關(guān)膀胱輸尿管反流，F(xiàn)RA1相關(guān)先天性巨結(jié)腸，TNFRSF11B相關(guān)大腸桿菌感染，AGTR1相關(guān)胃腸道出血大腸癌，APLNR相關(guān)原腸胚形成，CNR1相關(guān)腸易激綜合征和慢性潰瘍性結(jié)腸炎。手厥陰心包經(jīng)對應(yīng)134個靶點，其中50個靶點為特異性靶點。手厥陰心包經(jīng)穴位主治循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、發(fā)熱性疾病和局部神經(jīng)肌肉疾病，得到手厥陰心包經(jīng)對應(yīng)的特異性靶點ADORA2A相關(guān)血液循環(huán)疾病、CYP2B6 相關(guān)依法韋侖中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、ABCB1相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)復發(fā)、GNAS相關(guān)自主神經(jīng)系統(tǒng)疾病、NLRP3相關(guān)神經(jīng)垂體尿崩癥。

3.3 系統(tǒng)生物學架起針灸治療中醫(yī)疾病與現(xiàn)代醫(yī)學疾病關(guān)聯(lián)的橋梁

中醫(yī)疾病與現(xiàn)代醫(yī)學疾病很少有一一對應(yīng)關(guān)系，因此從基因角度找到中醫(yī)學與現(xiàn)代醫(yī)學的相關(guān)關(guān)系很有意義。十四經(jīng)脈對應(yīng)靶點的DisGeNET富集分析顯示，有一些結(jié)論與現(xiàn)代研究相符，例如認知障礙和足陽明胃經(jīng)、任脈、手厥陰心包經(jīng)、足太陽膀胱經(jīng)、足少陽膽經(jīng)、手陽明大腸經(jīng)等顯著相關(guān)。劉濤等[15]發(fā)現(xiàn)，臨床上認知障礙的治療重在督脈、足太陽膀胱經(jīng)的應(yīng)用。王亞飛等[16]發(fā)表了以督脈穴位為主治療缺血性腦血管疾病的綜述。陳俊伍等[17]認為針刺輔助治療急性胰腺炎選穴優(yōu)選足陽明胃經(jīng)、任脈、足太陽膀胱經(jīng)、手厥陰心包經(jīng)。胡鑫才等[18]發(fā)現(xiàn)針灸治療非酒精性脂肪肝常選用足陽明胃經(jīng)、足太陰脾經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)、任脈、手陽明大腸經(jīng)。而有一些現(xiàn)代疾病，如蛛網(wǎng)膜下腔出血、老年前期癡呆、內(nèi)皮功能障礙、免疫抑制等目前并沒有研究報道臨床治療與經(jīng)脈的關(guān)系，本文從DisGeNET富集結(jié)果可以推測這些疾病的臨床治療可以考慮從足陽明胃經(jīng)、督脈、手厥陰心包經(jīng)、足太陽膀胱經(jīng)、足少陽膽經(jīng)、手陽明大腸經(jīng)等入手。

綜上所述，本文通過系統(tǒng)生物學方法研究十四經(jīng)脈的分子機制，一方面證實了針刺經(jīng)脈具有廣譜效應(yīng)，這與調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)免疫系統(tǒng)有密切關(guān)系；另一方面通過對每個經(jīng)脈特異性靶點的分析，發(fā)現(xiàn)十四經(jīng)脈的靶點具有特異性，這也是循經(jīng)針刺可能的分子機制。最后，從十四經(jīng)脈對應(yīng)靶點的DisGeNET富集分析可以得到針刺治療疾病的思路和依據(jù)。