色譜技術(shù)在肝素結(jié)構(gòu)分析中的研究進(jìn)展

歐陽藝蘭,易 琳,邱露允,張真慶(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,江蘇 蘇州 215127)

肝素(heparin,Hp)又稱未分級肝素(UFH),作為抗凝劑使用已有近百年的歷史,它是迄今為止最古老但依然在臨床上廣泛應(yīng)用的抗凝藥物[1]。肝素的主要臨床適用癥有動靜脈血栓、肺栓塞、彌散性血管凝血等,可用于外科手術(shù)、血液透析等過程[2]。它作為銷售額居全球首位的生化藥物,2009年被列入世界衛(wèi)生組織基本藥物標(biāo)準(zhǔn)清單中,被認(rèn)定為健康照護(hù)系統(tǒng)中最安全與最有效的藥物之一[3]?？梢?經(jīng)過了近百年的發(fā)展歷程,肝素在抗凝領(lǐng)域的地位依然舉足輕重[4]。與此同時,肝素結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性使一些肝素糖鏈可與血漿中多種蛋白分子結(jié)合。因此,肝素除了具有抗凝活性還展現(xiàn)了其他很多生物活性,如血脂調(diào)節(jié)、預(yù)防動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血管生長、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等活性[5-7]。特別是在治療新冠肺炎(COVID-19)的初步結(jié)果中,肝素除了可以直接阻止病毒的侵襲外,還可以減輕病發(fā)過程中高凝狀態(tài)級聯(lián)反應(yīng)激活的凝血障礙、血栓形成和器官損傷[8-10]。

1916年約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院的一名學(xué)生Jay McLean在促凝實(shí)驗(yàn)中意外從狗的肝臟中發(fā)現(xiàn)了具有抗凝作用的化合物,并認(rèn)為是“肝磷脂”[11]。1918年,其導(dǎo)師Howell確證該化合物為碳水化合物而非磷脂類,隨后改名為“肝素”[12]。從牛肺組織中提取的肝素在20世紀(jì)30年代進(jìn)行了動物的體內(nèi)抗凝血實(shí)驗(yàn),瑞典Vitrum AB藥廠在1936年首次完成了靜脈注射肝素制劑的生產(chǎn)[11],1937年經(jīng)人體試驗(yàn)確定為安全、有效且容易取得的抗凝血劑。1949年,Peter Moloney和Edith Taylor獲得了低成本、高收率生產(chǎn)肝素的專利,使這種藥物被廣泛使用,第一代的未分級肝素產(chǎn)品就此誕生[12]。

肝素屬于糖胺聚糖(GAGs)家族。它是由重復(fù)的氨基葡萄糖(GlcN)和葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)組成二糖單元通過1,4連接而成的直鏈多糖,其中GlcA與IdoA互為差向異構(gòu)體;其重均分子質(zhì)量約16 000 Da,并有一定的相對分子質(zhì)量分布;肝素糖鏈中硫酸酯基的位置和數(shù)量表現(xiàn)為多樣性[1],即肝素的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的微觀不均一性,其基本結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示[13],其中含3位O-硫酸化GlcN的五糖序列是產(chǎn)生抗凝活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),即與抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的結(jié)合位點(diǎn),該五糖序列為GlcNAc/NS6S (1→4) GlcA (1→4) GlcNS3S,6S (1→4) IdoA2S (1→4) GlcNS6S(見圖1)[13-15]。

圖1 肝素生物合成與結(jié)構(gòu)[13]Fig.1 Heparin biosynthesis and structure[13]

肝素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性源于體內(nèi)生物合成過程中參與的酶體系龐大、合成過程復(fù)雜。肝素的生物合成首先發(fā)生在肥大細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,如圖1所示,在木糖基轉(zhuǎn)移酶、β-3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、β-4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和β-3葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶先后作用下生成與核心蛋白端絲氨酸或蘇氨酸連接的四糖連接域。隨后以此四糖為起點(diǎn)在高爾基體中生成肝素,其中多種生物酶參與該過程,包括在α-N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)轉(zhuǎn)移酶和β-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶作用下產(chǎn)生由重復(fù)的GlcA (1→4) GlcNAc二糖單元組成的糖鏈;在去N-乙?；?N-磺基轉(zhuǎn)移酶、糖醛酸C5異構(gòu)酶(由GlcA轉(zhuǎn)化成IdoA)、2位/6位/3位-O-磺基轉(zhuǎn)移酶等作用下產(chǎn)生不同程度硫酸化修飾的肝素糖鏈[16,17]。由于部分酶異構(gòu)體的存在及酶反應(yīng)的不徹底性,生成的肝素具有以下幾個結(jié)構(gòu)特點(diǎn):相對分子質(zhì)量大且呈分散性分布、多種糖基組成以及硫酸酯基數(shù)量和位置多樣[17]。

由此還可以看出,不同動物、相同動物的不同組織來源的肝素結(jié)構(gòu)上可能存在差異,該推論近年來獲得了大量研究結(jié)果的支持和驗(yàn)證[18-22]。肝素最初被發(fā)現(xiàn)時的組織來源是狗的肝臟,但其并不適合大規(guī)模生產(chǎn)[11]。20世紀(jì)30～50年代,牛肺以原料充足、收益高的優(yōu)點(diǎn)成為肝素生產(chǎn)的主要原料。之后肝素的提取源從牛肺轉(zhuǎn)變?yōu)樨i腸黏膜,原因有三:一是在處理、貯藏和提取大量牛肺組織的過程出現(xiàn)了肝素降解問題,產(chǎn)品質(zhì)量受到影響[23,24];二是隨著香腸加工產(chǎn)業(yè)的興起,豬腸黏膜作為香腸腸衣制作中的副產(chǎn)物,成為肝素制備的廉價原料來源[4];三是20世紀(jì)80年代后期爆發(fā)的瘋牛病,以牛肺為主的牛源肝素安全性受到質(zhì)疑,美國市場上的牛源肝素均被生產(chǎn)商召回[23,24]。自此,全球主要藥用肝素幾乎全部以豬腸黏膜為原料。

在后續(xù)對肝素的抗凝機(jī)制研究中,研究者們發(fā)現(xiàn)了肝素發(fā)揮抗凝作用的關(guān)鍵:凝血蛋白酶FXa(Factor Xa,活化的X因子),它可以被肝素的核心五糖(GlcNAc/NS6S-GlcA-GlcNS6S3S-Ido2S-GlcNS6S)與ATⅢ形成的復(fù)合物拮抗[25-29]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),18個糖以上的肝素糖鏈與ATⅢ形成復(fù)合物可以抑制凝血酶FⅡa(Factor Ⅱa,活化的Ⅱ因子),與出血副作用有關(guān)。于是研究者們試圖在保留肝素核心五糖的基礎(chǔ)上減小肝素糖鏈的長度,提高肝素的抗FXa/抗FⅡa活性比率[30,31]。由此,20世紀(jì)80年代,通過酶解或者化學(xué)降解等方法獲得了不同的低分子量肝素(LMWHs)[32]。相比于未分級肝素,LMWHs具有更加優(yōu)越的藥代動力學(xué)特征,血漿半衰期更長,皮下注射后生物利用度更高,抗凝作用更為穩(wěn)定[33-35]。1996年,大型隨機(jī)臨床試驗(yàn)證實(shí)院外、不監(jiān)測情況下,皮下注射LMWH與院內(nèi)靜脈注射普通肝素治療血栓性疾病的療效和安全性相當(dāng)[36]。于是作為第二代的肝素產(chǎn)品,一系列LMWHs產(chǎn)品,包括依諾肝素鈉(enoxaparin sodium)、那屈肝素鈣(nadroparin calcium)、達(dá)肝素鈉(dalteparin sodium)、亭扎肝素鈉(tinzaparin sodium)等應(yīng)運(yùn)而生,正在逐步取代普通肝素用于血栓性疾病的預(yù)防和治療[32,37]。

這些LMWHs在保留了肝素原有結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上,由于制備方法不同,出現(xiàn)了一系列相應(yīng)的特征結(jié)構(gòu)。如芐基化反應(yīng)后,在堿性條件下降解制備的依諾肝素鈉部分糖鏈還原端產(chǎn)生1,6脫水葡萄糖胺或甘露糖胺(1,6-an.A/M),部分非還原端產(chǎn)生4,5脫水糖醛酸(4,5-unsaturated uronic acid,ΔUA)[31];通過亞硝酸降解制備的那屈肝素鈣或達(dá)肝素鈉在還原端產(chǎn)生了2,5脫水甘露醇結(jié)構(gòu)(2,5-anhydromannitol,2,5-AM.ol)[38]。這些特征殘基的產(chǎn)生,無疑進(jìn)一步增大了LMWHs糖鏈結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。

以肝素核心五糖為模板全合成的磺達(dá)肝癸鈉是肝素類藥物第三代產(chǎn)品的代表,也是第一個單一結(jié)構(gòu)的肝素產(chǎn)品[39]。相較于第一代的未分級肝素和第二代的低分子量肝素,磺達(dá)肝癸鈉能通過皮下注射吸收,具有更高的生物利用度,出血副作用更低。然而,磺達(dá)肝癸鈉也有著不可忽視的缺陷,首先是在應(yīng)用上磺達(dá)肝癸鈉無法被魚精蛋白拮抗,即缺少解毒劑,且其腎毒性限制了腎功能障礙人群的使用[40];其次,磺達(dá)肝癸鈉作為化學(xué)合成的五糖,合成路徑很長,產(chǎn)率僅為0.1%,生產(chǎn)成本極高。這些問題導(dǎo)致該產(chǎn)品臨床使用率遠(yuǎn)不及LMWHs。

百年肝素經(jīng)歷了幾次里程碑式的發(fā)展,奠定了今天全球以LMWHs為主,未分級肝素和合成肝素占一定份額的市場格局。受飲食習(xí)慣和宗教因素的影響,中國成為肝素原料藥最大的出口國,全球超過50%的豬腸黏膜肝素原料藥來自中國[4]。近年來,中國肝素科研投入巨大,多家企業(yè)已經(jīng)成為LMWHs原料藥和制劑的全球供應(yīng)商。然而,肝素類產(chǎn)品的發(fā)展并不是一帆風(fēng)順的。2008年肝素污染事件中,被肝素類似物過硫酸軟骨素(OSCS)污染的肝素產(chǎn)品,超出了當(dāng)時的質(zhì)控檢測范疇,最終流入市場,導(dǎo)致超過200名使用相關(guān)產(chǎn)品的患者死亡[41-43]。該事件就像一記警鐘,提醒著我們肝素類產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、相關(guān)分析方法的局限性、質(zhì)量控制深入研究的緊迫性,只有不斷深入發(fā)展和完善相關(guān)研究,才能確保肝素藥物臨床應(yīng)用的安全性以及相關(guān)新產(chǎn)品開發(fā)的可靠性[44]。

2008年肝素污染事件發(fā)生以后,巨大人力物力投入到肝素類藥物的結(jié)構(gòu)、分析方法、質(zhì)量控制等研究中,大量的相關(guān)分析方法,特別是色譜分析方法應(yīng)運(yùn)而生。它們大多圍繞著肝素類藥物的糖基組成、二糖組成、重要結(jié)構(gòu)域組成、寡糖組成、多糖組成等來建立,其中離子色譜檢定肝素中半乳糖胺限量、強(qiáng)陰離子色譜(SAX)測定依諾肝素鈉脫水還原端含量等方法已經(jīng)被收入藥典中;用于低分子量肝素寡糖譜分析的分子排阻色譜結(jié)合高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SEC-MS)、用于那屈肝素鈣和達(dá)肝素鈉中脫水還原端含量分析的離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(IC-MS),以及多中心切割二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(MHC 2D-LC-MS)已成功應(yīng)用到LMWHs藥物的一致性研究中;SAX進(jìn)行聚糖分析檢測肝素中OSCS、硫酸皮膚素(DS)等不純物含量的方法在產(chǎn)品工藝和質(zhì)量提升過程中得以應(yīng)用[45-47]。

本文將從單糖、二糖、寡糖和多糖等多個維度,對當(dāng)前肝素結(jié)構(gòu)分析中應(yīng)用的色譜分離方法的優(yōu)勢和不足進(jìn)行梳理和對比,針對色譜技術(shù)在肝素類藥物質(zhì)量控制中的應(yīng)用做系統(tǒng)的總結(jié),為肝素類藥物的質(zhì)量控制方法提供參考,并為肝素類藥物精細(xì)結(jié)構(gòu)的闡釋提供線索,推動肝素類藥物安全有效可控地應(yīng)用。

1 單糖組成分析

肝素是由GlcN和IdoA或GlcA形成的重復(fù)二糖組成。肝素中常見的天然雜質(zhì)DS和硫酸軟骨素(CS)與肝素同屬GAGs,它們是由氨基半乳糖(GalN)和IdoA或GlcA形成的重復(fù)二糖組成的硫酸化直鏈多糖[1]。2008年肝素污染事件中的OSCS,是人工合成的CS的過硫酸化衍生物,單糖組成同樣為GalN和GlcA。據(jù)此,單糖組成分析可以有效鑒別和定量檢查肝素以及可能存在的DS、CS或OSCS。

進(jìn)行多糖的單糖組成分析時,大多需要將單糖釋放,酸水解是其中主要的手段。理想的水解條件可以在完全釋放糖基的同時,盡量減少單糖結(jié)構(gòu)的破壞。多項(xiàng)針對肝素酸水解條件優(yōu)化的研究包括:2～4 mol/L三氟乙酸(TFA)在100～110 ℃下降解8～24 h[48-50],3～5 mol/L鹽酸在100 ℃下降解6 h[51],微波100 W 10 min[52]以及采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)設(shè)備在30 min內(nèi)對多達(dá)96個樣品進(jìn)行酸解處理[53]。其中鹽酸水解是被《美國藥典》(USP)肝素鈉半乳糖胺限量檢查分析采納的方法[54],該方法穩(wěn)定有效可控。

自然界中單糖的種類有數(shù)十種,它們均為多羥基醛或酮或醛酸,親水性強(qiáng),無特征紫外吸收,大多存在差向異構(gòu)體。這為綜合性單糖分析方法提出了不小的挑戰(zhàn)。最早出現(xiàn)的單糖分析方法為紙色譜法[55],以及薄層色譜法[56],但它們的分辨率和靈敏度均較低,已無法滿足現(xiàn)代化綜合分析的需求。本文重點(diǎn)梳理了肝素類藥物單糖現(xiàn)代化色譜分析方法以及潛在可能用于肝素類藥物單糖分析的方法。

1.1 離子色譜結(jié)合脈沖安培檢測法(IC-PAD)

利用IC-PAD的單糖分析過程中,堿性流動相使單糖的羥基電離,并與陰離子色譜柱有不同程度的結(jié)合和保留,在流動相洗脫下達(dá)到高效分離的目的,同時,PAD檢測器利用單糖半縮醛的氧化還原性成功實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和特異性檢測。2012年,Zhang等[45]建立了一種IC-PAD方法對16種單糖一次性系統(tǒng)分析,包含多種中性糖、氨基糖和酸性糖等(見圖2)。研究者利用該方法有效對比了肝素、CS、DS等GAGs單糖組成的差異,同時,確定了較低的定量限(12.5×10-3nmol,～2.5 ng)和較寬的線性范圍。USP收錄了離子色譜結(jié)合脈沖安培檢測方法用于肝素的GalN限量檢查(含量不超過所有氨基糖總量的1%),確保肝素產(chǎn)品中只含有極低的GalN相關(guān)的CS、DS,也包括OSCS。在此基礎(chǔ)上,Yi等[57]應(yīng)用該方法成功實(shí)現(xiàn)了那屈肝素鈣和達(dá)肝素鈉糖鏈末端結(jié)構(gòu)2,5-AM.ol的定性定量分析,成為該方法在肝素類藥物分析中又一個有意義的應(yīng)用。

圖2 IC-PAD分析16種單糖的色譜圖[45]Fig.2 Chromatogram of 16 sugars by ion chromatography with pulsed amperometric detection (IC-PAD)[45]

表1 單糖組成分析方法Table 1 Monosaccharide composition analysis methods

1.2 衍生化法

柱前衍生可以有效改變單糖的色譜行為,同時衍生化后可以進(jìn)行相應(yīng)的紫外或熒光檢測。常用的單糖衍生化試劑有1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基吡嗪(2-AP)、4-氨基苯甲酸乙酯(ABEE)等[51-53]。2021年,Wang等[58]通過合成新的衍生物O-(4-甲氧基-d3芐基)-羥胺鹽酸鹽(4-MOBHA·HCl),使12種單糖(包含肝素類藥物含有的GlcN、GlcA,以及相關(guān)GalN)在C18色譜柱上基線分離,該衍生物還大大提高了檢測靈敏度,定量限低至0.25～3.00 fmol/L,可以應(yīng)用于各種生物樣本的分析。這些單糖經(jīng)過衍生化后的色譜分析方法,因儀器適配性和色譜穩(wěn)定性高,有著廣泛的應(yīng)用以及潛在的肝素類藥物單糖分析能力。當(dāng)然,衍生化過程相對復(fù)雜、反應(yīng)效率不同等問題可能會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)信息丟失或不準(zhǔn)確,一定程度上限制了其應(yīng)用。

表1匯總了用于或者可能用于肝素類藥物單糖分析的方法,包含樣品前處理、色譜方法等。

2 二糖分析

重復(fù)二糖是GAGs的特征性結(jié)構(gòu)。肝素類藥物重復(fù)二糖單元中存在不同硫酸酯基位置和數(shù)量差異,這些有著不同硫酸酯基位置和數(shù)量的二糖比例可能隨著動物來源、制備工藝、廠家甚至批次的不同而不同[59]。于是,徹底酶解后的二糖分析是GAGs,特別是肝素類藥物結(jié)構(gòu)解析過程中不可或缺的內(nèi)容之一。肝素糖鏈通過肝素裂解酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ徹底酶解可以產(chǎn)生常見二糖、糖鏈末端四糖連接域、肝素酶不識別特殊結(jié)構(gòu)等幾十種產(chǎn)物[60]。裂解酶降解釋放的肝素類藥物二糖或者寡糖的糖鏈非還原端均帶有4,5位雙鍵,與糖醛酸的羧基形成共軛,在約232 nm處呈現(xiàn)特征吸收,結(jié)合不同分離機(jī)制和適宜的檢測手段完成它們的定性定量分析可以實(shí)現(xiàn)肝素類藥物基本單元組成的重要表征。

2.1 強(qiáng)陰離子交換色譜-紫外法

SAX是一種以高濃度非揮發(fā)性鹽為流動相,根據(jù)肝素二糖或寡糖的離子強(qiáng)度進(jìn)行分離的色譜方法。結(jié)合UV檢測器,SAX體現(xiàn)出了分辨率高、穩(wěn)定性好、定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)。USP[61]和《歐洲藥典》(EP)[62]在利用二糖分析檢測依諾肝素鈉糖鏈末端1,6-an.A/M含量過程中均采用了SAX-UV方法。在該方法中,依諾肝素鈉經(jīng)過混合肝素裂解酶徹底酶解產(chǎn)生十幾種酶解產(chǎn)物,這些產(chǎn)物主要為酶解釋放出來的二糖結(jié)構(gòu),同時也包括依諾肝素鈉糖鏈含有1,6-an.A/M的末端結(jié)構(gòu)。酶解釋放出來的二糖含有完整還原端,被硼氫化鈉還原后色譜保留時間系統(tǒng)性前移,而含有1,6-an.A/M末端結(jié)構(gòu)的酶解產(chǎn)物無法被還原,色譜保留時間不變,通過這種差異所有含有1,6-an.A/M末端結(jié)構(gòu)的酶解產(chǎn)物均被識別并進(jìn)行了歸一化法定量測定。該方法得益于SAX-UV較高分辨率和較好穩(wěn)定性。

2015年Mourier等[63]利用SAX方法對不同來源和批次的肝素徹底酶解產(chǎn)物進(jìn)行了定量的指紋圖譜研究,其中包含常規(guī)二糖、3-O硫酸化的二糖和四糖、糖鏈末端絲氨酸殘基等二十幾種酶解產(chǎn)物(見圖3a)。在分析過程中,由于實(shí)際樣品的復(fù)雜性以及含量較小組分標(biāo)準(zhǔn)品的缺失,有些歸屬出現(xiàn)了不明確和不準(zhǔn)確的情況。

在線質(zhì)譜是解析未知峰的有力手段,但SAX以非揮發(fā)性鹽為流動相,無法實(shí)現(xiàn)與質(zhì)譜的在線聯(lián)用。為了突破SAX與質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)壁壘,2016年Miller等[64]開發(fā)了以揮發(fā)性鹽(碳酸氫銨,VS)為流動相,在十六烷基三甲基銨(CTA)鍵合的C18色譜柱上分離肝素二糖和寡糖的方法。VS-CTA-SAX方法實(shí)現(xiàn)了SAX與質(zhì)譜兼容并初步完成了肝素二糖及寡糖的分離,但整體分辨率有所下降,同時碳酸氫銨的可分解性對該方法的穩(wěn)定性提出了挑戰(zhàn)。2021～2022年Chen等[65,66]開發(fā)了多中心切割(multiple heart cut,MHC)二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(2D-LC-MS)的方法,SAX-UV作為第一維色譜對肝素類藥物徹底酶解產(chǎn)物進(jìn)行有效分離,之后指定色譜峰自動進(jìn)入第二維分子排阻色譜(size-exclusion chromatography,SEC)在線脫鹽后進(jìn)入MS進(jìn)行定性分析(見圖3b和3c)。利用該方法研究人員對17種肝素徹底酶解產(chǎn)物、15種依諾肝素鈉徹底酶解產(chǎn)物、20種那屈肝素鈣徹底酶解產(chǎn)物進(jìn)行了定性定量分析。該方法繼承了傳統(tǒng)SAX的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和分辨率,同時實(shí)現(xiàn)了在線質(zhì)譜定性分析,為肝素類產(chǎn)品的質(zhì)量控制和構(gòu)效關(guān)系研究提供了有力的分析工具。

圖3 強(qiáng)陰離子交換色譜法定量分析肝素徹底酶解產(chǎn)物[63,65]Fig.3 Analysis of heparin depolymerized by heparinase mixture by strong anion exchange chromatography (SAX)[63,65] a.chromatogram of SAX-UV,black line:232 nm,red line:202-242 nm[63];b.schematic of multiple heart-cutting two dimensional chromatography with MS (MHC 2D-LC-MS) system[65];c.chromatograms of MHC 2D-LC-MS (1D-SAX,232 nm)[65].

2.2 反相離子對色譜-質(zhì)譜法(IPRP-MS)

圖4 微流反相離子對色譜-質(zhì)譜法(Mf-IPRP-MS)對8個肝素二糖的定量分析結(jié)果[67]Fig.4 Results of quantitative analysis of eight heparin disaccharides by microflow ion pair reversed phase coupled with MS (IPRP-MS) method[67]

肝素類藥物的二糖及寡糖等由于具有極強(qiáng)的親水性,在常規(guī)的反相色譜柱中較難保留。離子對試劑的加入使這些被分析物在流動相中與正電性的有機(jī)離子對試劑生成一定親脂性的中性分子,從而增強(qiáng)肝素二糖在色譜中的保留,改善分離效果[67]。離子對試劑的空間體積和疏水性在肝素二糖或寡糖的解析中發(fā)揮了復(fù)雜的分析物競爭作用,因此對于離子對試劑的選擇和濃度的確定需要優(yōu)化[68]。在肝素二糖或寡糖分析時,常用的離子對試劑有三丁胺(TBA)和乙酸銨、丁胺(BTA)和乙酸銨、戊胺(PTA)和六氟異丙醇(HFIP)等[67-70]。雖然離子對試劑或者有機(jī)相本身的紫外吸收影響了酶解糖鏈紫外檢測,但揮發(fā)性流動相與MS有較好的兼容性,質(zhì)譜的檢測既有較高靈敏度又可以實(shí)現(xiàn)定性分析的目的。2008年Zhang等[67]使用微流液相以TBA和乙酸銨為離子對試劑,離子阱MS為檢測器,并利用13C、15N標(biāo)記后的二糖作為內(nèi)標(biāo)校正MS離子化效率帶來的差異,實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量分析,定量限低至2 ng(見圖4)。2015年Xu等[71]利用IPRP-MS法對依諾肝素鈉和那屈肝素鈣的部分酶解產(chǎn)物從二糖(dp2)至十糖(dp10)約兩百多個寡糖組分進(jìn)行定性定量分析,其中離子對試劑為PTA和HFIP。IPRP對肝素類藥物二糖和寡糖均有較好的分離效果,色譜分辨率較高,同時較好的MS兼容性使該方法能對未知或不常見的組分定性分析,是一種高效、便捷的肝素類藥物結(jié)構(gòu)分析方法。然而,離子對試劑的加入也產(chǎn)生了一些弊端,如離子對試劑與被測化合物發(fā)生不同程度的加合,產(chǎn)生多種加合產(chǎn)物,一定程度上增加了質(zhì)譜解析的難度[68];離子對試劑容易與色譜柱填料發(fā)生不可逆結(jié)合,導(dǎo)致色譜柱效率降低,色譜柱使用壽命縮短;離子對試劑還在MS中存在嚴(yán)重的殘留現(xiàn)象,隨著使用次數(shù)的增加離子對試劑在MS中的響應(yīng)明顯增加,對質(zhì)譜的數(shù)據(jù)采集產(chǎn)生影響。這些弊端限制了該方法更為廣泛的使用。

2.3 親水相互作用色譜-質(zhì)譜法(HILIC-MS)

HILIC也可稱為“含水正相色譜”,是一種集正相、離子交換等多種分離機(jī)制于一體的混合色譜模式,適用于強(qiáng)極性化合物的分離。該法通常以含水流動相作為洗脫劑,被測物的親水性越強(qiáng),在色譜上的保留越強(qiáng),非常適合親水性強(qiáng)的肝素類藥物二糖分析[72]。HILIC的流動相是水相緩沖鹽與有機(jī)相混合,一般選用揮發(fā)性鹽如甲酸銨、乙酸銨等,水相的比例約3%～40%,因此與MS具有較好的兼容性。2016～2017年Sun等[60,73]利用HILIC分離并采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式定性定量分析依諾肝素鈉和那屈肝素鈣徹底酶解產(chǎn)物。該方法的分離度有限,但借助被測物在MS中質(zhì)荷比(m/z)以及碎片離子的不同,實(shí)現(xiàn)了30多種糖結(jié)構(gòu)的分析(見表2)。2012年Gill等[74]利用HILIC-MS對GAG酶解產(chǎn)生的具有Δ4,5不飽和糖醛酸的二糖和亞硝酸降解產(chǎn)生的飽和二糖(含2,5-AM.ol)進(jìn)行定量分析,該方法實(shí)現(xiàn)了簡單的LC-MS平臺確定GAG中的二糖譜。HILIC的分辨率較差,UV背景高且不穩(wěn)定,但與MS兼容性好,其與MS聯(lián)用極大提高了該方法的適用性,在肝素類藥物結(jié)構(gòu)解析過程中有良好的應(yīng)用。

2.4 毛細(xì)管電泳法(CE)

面對肝素類藥物二糖這種高電荷物質(zhì)的分析,CE有著高分辨和高靈敏度的獨(dú)特優(yōu)勢。傳統(tǒng)CE因電解質(zhì)緩沖液多為磷酸緩沖鹽等不揮發(fā)性鹽,無法直接和MS串聯(lián),因此傳統(tǒng)CE常與紫外或熒光檢測器串聯(lián)使用。2017年Zhang等[75]采用CE-UV法對LMWHs中具有不同ATⅢ結(jié)合活性組分進(jìn)行二糖分析(見圖5a)。該研究中,在峰歸屬的過程中利用電泳遷移率和荷質(zhì)比呈正比的原理對含3-O硫酸化的3個四糖進(jìn)行歸屬,完成了高分辨率的定性定量分析。近些年隨著CE與MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,CE分離過程中的未知峰實(shí)現(xiàn)了在線結(jié)構(gòu)解析。2016年Sun等[76]利用CE-MS聯(lián)用技術(shù)對不同硫酸化程度的肝素二糖進(jìn)行定性定量分析,該方法線性良好,定量限低至6 ng/mL。方法中CE可以與MS串聯(lián)是源于可揮發(fā)性背景電解質(zhì)(NH4HCO3)和一款新穎的電動泵驅(qū)動的CE-MS離子源(CMP EMASS-II CE-MS),該離子源提供低流速鞘流液(50%～70%甲醇水溶液含0.1%～1%甲酸)和霧化電壓,但可揮發(fā)性的電解質(zhì)降低了CE對肝素二糖的分辨率,導(dǎo)致該方法僅能對含有不同硫酸基團(tuán)的肝素二糖進(jìn)行分離,一定程度上限制了該方法的應(yīng)用。2019年Ouyang等[77]利用等電點(diǎn)聚焦電泳(cIEF)與MS聯(lián)用對肝素二糖進(jìn)行分離,這是首次以等電點(diǎn)為分離依據(jù)分離酸性二糖,該研究中同樣使用了外加離子源(見圖5b)。該方法對肝素二糖分離的分辨率有所提高,但是目前還未能實(shí)現(xiàn)全部二糖的基線分離,還有待新型填充毛細(xì)管的開發(fā)?？傊瓹E的超低流速、高靈敏度是該方法的優(yōu)勢,相信隨著毛細(xì)管技術(shù)的發(fā)展,更多應(yīng)用將隨之產(chǎn)生。

圖5 CE-UV法定量分析依諾肝素酶解產(chǎn)物[75,77]Fig.5 Analysis of the exhaustively digestion of enoxaparin by CE-UV[75,77]a.chromatogram of 232 nm[75];b.schematic of capillary isoelectric focusing coupled with mass spectrometry (cIEF-MS) system[77].

2.5 衍生化方法

與單糖分析類似,通過柱前衍生可以改變肝素類藥物二糖的色譜行為,同時引入的發(fā)光基團(tuán)使檢測手段多樣化,檢測靈敏度進(jìn)一步提高[69,78-80]。肝素、CS和透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)的17種二糖經(jīng)過2-氨基吖啶酮(AMAC)衍生化后,可在RP[79]、HILIC[80]色譜柱上以及CE[81,82]上實(shí)現(xiàn)完全分離,借助FID或MS實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速定性定量分析。2014年Ucakturk等[83]采用CE-FID實(shí)現(xiàn)了2-氨基吖啶酮衍生化的硫酸乙酰肝素(HS)、CS、硫酸角質(zhì)素(KS)以及HA等19種GAG二糖的基線分離,在一次實(shí)驗(yàn)過程中對所有GAG相關(guān)二糖進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、超高靈敏的定性定量分析。2021年Wang等[84]利用6-氨基-N-(2-二乙氨基)乙基喹啉-2-甲酰胺(AMQC)衍生,在MRM質(zhì)譜模式下定量分析了肝素二糖,相較于AMAC衍生靈敏度增大了20～320倍。這些方法的靈敏度高,特異性強(qiáng),是生物樣本如細(xì)胞、組織、體液中GAG二糖定性定量分析的常用方法。表2系統(tǒng)地總結(jié)了不同二糖分析方法下可以檢測到的肝素類藥物中的結(jié)構(gòu)片段,一定程度上體現(xiàn)了這些方法的靈敏度和分辨率。

表2 不同分析方法獲得的肝素或低分子量肝素的二糖組成Table 2 Composition of disaccharide analysis from heparin or low molecular weight heparins (LMWHs) by various methods

3 寡糖分析

圖6 LMWHs的寡糖分析[68,85,86]Fig.6 Oligosaccharide analysis of LMWHs[68,85,86] a.total ion chromatogram of LMWH (tinzaparin) by IPRP-MS[68];b.total ion chromatogram of LMWH (enoxaparin) by HILIC-MS[85];c.UV chromatogram (232 nm) of LMWH (enoxaparin) by SEC-MS[86].

肝素類物質(zhì)是一系列線性硫酸多糖和寡糖的組合,它們的相對分子質(zhì)量,即糖鏈聚合度,在一定范圍內(nèi)分布,同時每一個聚合度下又存在糖基組成、硫酸酯基數(shù)量或位置不同的糖鏈序列分布。對未分級肝素部分酶解所得寡糖以及對LMWHs寡糖進(jìn)行系統(tǒng)分析是肝素類藥物結(jié)構(gòu)確認(rèn)、構(gòu)效關(guān)系研究以及結(jié)構(gòu)改造過程中重要的支撐性工作。然而,鑒于上述提到的糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及肝素類藥物寡糖相對分子質(zhì)量分布和結(jié)構(gòu)的微不均一性特點(diǎn),針對這類物質(zhì)的分析難度要遠(yuǎn)大于單糖和二糖分析。單獨(dú)的色譜分析往往無法滿足肝素類寡糖分析的要求[85],色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)成為肝素類寡糖分析的主要手段,其中常用的色譜方法有IPRP、HILIC、SEC、CE等[85-88]。近些年隨著多維色譜技術(shù)的不斷發(fā)展,研究者已經(jīng)開始嘗試將多維色譜技術(shù)應(yīng)用于肝素類寡糖的分析當(dāng)中,呈現(xiàn)出了較好的效果。同時針對肝素類寡糖的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫以及自動化質(zhì)譜歸屬軟件也在不斷發(fā)展,一定程度上解決了該類物質(zhì)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用數(shù)據(jù)復(fù)雜、人工解析繁復(fù)的問題。

3.1 IPRP-MS

如二糖分析中所述,IPRP對肝素類二糖有良好分離效果,這些方法可以拓展到肝素類寡糖分析,但分辨率相對降低。2009年Catalin等[68]在利用IPRP-MS法分離肝素寡糖時,考察了離子對試劑丙胺(PPA)、三丙胺(TPA)、BTA、TBA和PTA在不同濃度下的離子對能力和分離性能等參數(shù),其中PTA展現(xiàn)出出色的色譜性能,結(jié)合HFIP增強(qiáng)了質(zhì)譜的響應(yīng)。該工作利用IPRP-MS對亭扎肝素(一種酶解低分子量肝素)進(jìn)行分析,結(jié)果如圖6a所示[68],較小聚合度寡糖有較好的色譜分辨率,隨著寡糖聚合度增加,色譜分辨率顯著下降。同時,較小聚合度但高電荷寡糖與相鄰較大聚合度但低電荷寡糖有共洗脫現(xiàn)象,保留時間重疊,分離度較差。在MS數(shù)據(jù)處理時,除了大量多價態(tài)分子離子峰出現(xiàn)外,離子對試劑的加合物也大量出現(xiàn),進(jìn)一步增大了質(zhì)譜解析的難度。整體數(shù)據(jù)呈現(xiàn)多價態(tài)、多加合的形式,因此在建立質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫時應(yīng)考慮加合物以及加合物存在下的多價態(tài)。

3.2 HILIC-MS

HILIC在分析肝素類藥物寡糖的過程中由于流動相中鹽和有機(jī)相梯度導(dǎo)致紫外檢測有較高的背景,大多以質(zhì)譜為檢測手段。2012年Li等[85]采用HILIC-MS對依諾肝素鈉進(jìn)行了系統(tǒng)分析,結(jié)果如圖6b所示。從結(jié)果可以看出,該方法相對于IPRP分辨率較低,穩(wěn)定性較好,也沒有離子對試劑殘留的問題。該方法利用依諾肝素鈉糖鏈組成的虛擬數(shù)據(jù)庫,完成了依諾肝素鈉糖鏈的質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索和歸屬,同時利用提取離子流對多個廠家的依諾肝素鈉不同聚合度寡糖的組成進(jìn)行了對比研究。HILIC-MS以較好的質(zhì)譜兼容性將成為最有潛力的寡糖序列分析方法之一。

3.3 SEC-MS

相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布是肝素類藥物重要的質(zhì)量指標(biāo),SEC法作為測定肝素類藥物相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布的法定方法收錄在各國藥典中[54,62]。這些方法往往結(jié)合示差檢測或者多角度激光散射檢測,前者需要一系列相對分子質(zhì)量已知的單分散性聚合物作為標(biāo)準(zhǔn)品,并根據(jù)保留時間準(zhǔn)確推斷測試樣品的相對分子質(zhì)量;后者則根據(jù)不同角度激光散射的強(qiáng)度直接計算相對分子質(zhì)量[89]。2017年Ouyang等[90]在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探索了肝素類藥物在SEC中的色譜行為,特別是研究者將SEC與電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)在線連接,確定了肝素類藥物中的陽離子在SEC色譜中被流動相中的陽離子替換,原有陽離子,如鈉或者鈣以鹽的形式在接近總保留體積(Vt)處流出。因此,以SEC方法分析肝素類藥物的相對分子質(zhì)量和含量時,陽離子的因素需要酌情考慮。

SEC有著極高的穩(wěn)定性,同時按相對分子質(zhì)量大小或者聚合度分離,符合肝素類寡糖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。近年來,隨著色譜材料的不斷發(fā)展,超高分辨SEC技術(shù)在肝素類寡糖分析中得到了很好的應(yīng)用。2012年康經(jīng)武教授課題組[86]發(fā)表了超高分辨SEC-MS分析依諾肝素鈉工作,如圖6c所示,該方法使用了較低濃度的揮發(fā)性無機(jī)鹽,質(zhì)譜兼容性較好,色譜結(jié)果直觀地體現(xiàn)了該低分子量肝素寡糖分布和組成比例。2019年Ouyang等[59]利用該方法完成了依諾肝素鈉大樣本量分析,區(qū)分了不同工藝、廠家、生產(chǎn)時間、種屬來源的40余個樣品。隨著超高分辨SEC對低分子量肝素寡糖色譜分辨率的巨大提升,在線質(zhì)譜對這些寡糖定性分析也有了長足的進(jìn)步,然而,流動相中揮發(fā)性銨鹽的多種加合物以及電噴霧電離產(chǎn)生的多價態(tài)導(dǎo)致質(zhì)譜數(shù)據(jù)自動解析出現(xiàn)大量假陽性結(jié)果,無法擺脫大量繁復(fù)的人工解析工作。2016年Zaia教授[91]在此基礎(chǔ)上,引入了在線陽離子抑制器,去除了陽離子加合物對質(zhì)譜數(shù)據(jù)的影響;同時建立了一個針對肝素類物質(zhì)糖鏈同位素質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,并以此數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ),改善了肝素類物質(zhì)糖鏈質(zhì)譜數(shù)據(jù)中多價態(tài)導(dǎo)致去卷積過程中同位素信號識別錯誤引起的假陽性結(jié)果,實(shí)現(xiàn)了肝素類物質(zhì)糖鏈的自動化質(zhì)譜解析和歸屬。2022年Yan等[92]從另一個角度開發(fā)了一款基于色譜擬合和質(zhì)譜歸屬校正的新型糖譜分析軟件Glycomapping,這款軟件首先通過特有的色譜擬合方法極大提高了SEC分離肝素類物質(zhì)糖鏈的分辨率,每個聚合度對應(yīng)的色譜峰,包括肩峰、隱藏峰均擬合成獨(dú)立色譜峰,確定了準(zhǔn)確的起始和結(jié)束時間點(diǎn)。之后,每個聚合度對應(yīng)的色譜峰的起始保留時間進(jìn)一步規(guī)范了質(zhì)譜的自動化歸屬,過程中對于質(zhì)譜去卷積錯誤導(dǎo)致的自動化歸屬錯誤,通過色譜保留時間自行矯正,并重新嘗試多種價態(tài)去卷積并自動化歸屬,直至質(zhì)譜自動解析與擬合色譜保留時間相匹配。該軟件消除了去卷積錯誤產(chǎn)生的假陽性,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜硫酸化多糖液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、自動化分析。

圖7 MHC 2D-LC-MS分析依諾肝素的寡糖圖譜分析[93]Fig.7 Profiling analysis of enoxaparin using MHC 2D-LC-MS[93] a.1D chromatogram of enoxaparin and the cutting position of each dp from 3 to 12;b.2D extracted compound chromatograms for dp3 to dp12.

3.4 MHC 2D-LC-MS

目前傳統(tǒng)的一維液相色譜在分析肝素類寡糖時,依然無法實(shí)現(xiàn)所有寡糖的基線分離,無法更準(zhǔn)確地回答肝素類藥物中糖鏈的數(shù)量、組成和結(jié)構(gòu)序列。2015年Ouyang等[93]首次將MHC 2D-LC-MS應(yīng)用于LMWHs寡糖指紋圖譜分析中。在該方法中,有著出色穩(wěn)定性的SEC作為第一維色譜,實(shí)現(xiàn)不同聚合度寡糖的分離,有著出色分辨率的IPRP作為第二維色譜,實(shí)現(xiàn)相同聚合度下不同組成序列結(jié)構(gòu)寡糖的分離。該方法是目前LMWHs寡糖分析方法中分辨率最高、組分結(jié)構(gòu)解析最全面的方法,其中依諾肝素鈉有超過120種寡糖被物理分離并根據(jù)相應(yīng)MS信息進(jìn)行了歸屬,那屈肝素鈣有超過80種寡糖被物理分離并歸屬(見圖7)。該方法首次將二維液相色譜技術(shù)應(yīng)用于肝素寡糖的分析,得到二維液相色譜領(lǐng)域資深科學(xué)家Stoll的認(rèn)可[94]。MHC 2D-LC-MS為LMWHs的結(jié)構(gòu)組成研究、質(zhì)量控制和肝素相關(guān)糖組學(xué)研究提供有力分析工具。

4 聚糖分析

圖8 SAX-UV法測定肝素類似聚糖的色譜圖(215 nm)[47]Fig.8 Chromatogram of heparin related polysaccharides by SAX-UV (215nm)[47]

肝素是相對分子質(zhì)量較大的線性硫酸多糖,通過色譜方法直接對肝素聚糖進(jìn)行分析,是一種更直觀的分析策略。特別是2008年肝素污染事件之后,SAX作為法定方法對肝素中OSCS定性定量分析已被USP收錄[61]。2009年Trehy等[47]通過建立的SAX-UV的方法將肝素、DS、OSCS基線分離并完成了定量分析,如圖8所示,其中污染物OSCS的LOD和LOQ分別是0.03%和0.1%,DS的LOD和LOQ分別是0.1%和0.8%。

5 結(jié)論

肝素類藥物雖歷經(jīng)百年,但依然在臨床上廣泛應(yīng)用,同時它又有多種潛在應(yīng)用,在抗炎、抗腫瘤乃至抗病毒等領(lǐng)域都有著巨大的發(fā)展?jié)摿?。然?肝素的結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜,結(jié)構(gòu)解析、質(zhì)量控制等相關(guān)的分析策略和方法一直是該領(lǐng)域的難點(diǎn)。多年來,肝素類藥物結(jié)構(gòu)序列分析主要集中在單糖組成分析、二糖組成分析、部分酶解寡糖產(chǎn)物序列結(jié)構(gòu)分析、低分子量肝素寡糖組成序列結(jié)構(gòu)分析以及聚糖分析等幾個層次上。其中,單糖組成分析方法有一定的通用性,而其他方面的分析方法均相對獨(dú)特,對儀器設(shè)備要求較高,技術(shù)難度相對較大。

SAX方法的開發(fā)歷史較長,有著較好的穩(wěn)定性,對UV檢測適應(yīng)性較好,有良好的拓展性,可以應(yīng)用到二糖、寡糖和多糖的定性定量分析中。然而,流動相中高濃度的不揮發(fā)性鹽使其無法與質(zhì)譜聯(lián)用,限制了其在發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)、定性分析低含量或特殊組分方面的應(yīng)用。隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展,多維色譜技術(shù)使在線脫鹽質(zhì)譜聯(lián)用得以實(shí)現(xiàn),很大程度上推動了SAX在肝素分析應(yīng)用上的發(fā)展。

IPRP方法最初用于核酸類物質(zhì)的分析,在肝素類糖鏈分析中體現(xiàn)出了很好的色譜分辨率以及質(zhì)譜兼容性。然而,IPRP試劑殘留問題,以及UV檢測的背景問題一定程度上限制了其應(yīng)用范圍,目前科研領(lǐng)域是其主要的應(yīng)用場景。

HILIC方法色譜分辨率較好,圍繞色譜填料的修飾和改造有較大的拓展空間。然而,該方法同樣有著UV檢測背景高的問題,目前主要是依賴質(zhì)譜檢測定性,應(yīng)用場景主要集中在科研領(lǐng)域。

SEC方法有出色的色譜穩(wěn)定性,更多的用在相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布測定上,但隨著更加穩(wěn)定的超高分辨色譜填料的出現(xiàn),SEC方法在肝素類藥物的寡糖分析方面展現(xiàn)出了極高的應(yīng)用價值,具體體現(xiàn)在方法學(xué)穩(wěn)定性好、色譜分辨率高、UV檢測穩(wěn)定性強(qiáng)、質(zhì)譜兼容性強(qiáng)等方面。鑒于以上優(yōu)點(diǎn),很多肝素類寡糖自動化解析軟件都是在SEC基礎(chǔ)上開發(fā)應(yīng)用的,在一定程度上也反映了該方法的優(yōu)勢和更廣闊的應(yīng)用前景。

CE法對分析較小聚合度寡糖有著高靈敏和高分辨率的特點(diǎn)。雖然其穩(wěn)定性比色譜略差,但已經(jīng)在科研和工業(yè)領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用。近些年來隨著科技的發(fā)展,CE與質(zhì)譜的兼容得以實(shí)現(xiàn),這是CE在肝素類糖鏈分析應(yīng)用中的巨大進(jìn)步。然而,目前CE在與質(zhì)譜兼容的過程中往往在一定程度上犧牲了分辨率,所以CE-MS更廣泛的應(yīng)用還有待技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

以上不同的色譜分析方法都有各自的優(yōu)勢和弊端,二維液相色譜,可以兼具兩種色譜的機(jī)制優(yōu)勢,實(shí)現(xiàn)肝素類藥物結(jié)構(gòu)序列更全面更細(xì)致的分析?；诙S液相色譜的肝素類糖鏈分析將是未來發(fā)展的一個重要方向。

總之,本文圍繞肝素類藥物組成和結(jié)構(gòu)序列分析,從單糖、二糖、寡糖、聚糖4個維度介紹了不同色譜法的應(yīng)用,并分別總結(jié)了它們的最新進(jìn)展,希望對肝素類藥物的質(zhì)量控制以及結(jié)構(gòu)序列分析有一定的參考價值。目前色譜技術(shù)正處于革新時代,相信隨著色譜分離技術(shù)日新月異的發(fā)展,更多的方法和分析策略將應(yīng)用于肝素類藥物的組成和序列結(jié)構(gòu)分析中,助力肝素類藥物安全可控良性發(fā)展。