基于定量指紋圖譜技術的經(jīng)典名方清骨散基準樣品量值傳遞分析

徐 鑫,魏 彤,薛倩倩,艾嘉浩,李桂馨,劉忠國,李 丹,侯金才,金紅利,*,劉艷芳,,梁鑫淼,(1.贛江中藥創(chuàng)新中心,江西 南昌 0000;2.江西省中藥藥效物質(zhì)基礎重點實驗室,江西 南昌 0000;.中國科學院大連化學物理研究所,遼寧 大連 11602;.神威藥業(yè)集團有限公司,河北 石家莊 0510)

清骨散(QGS)出自明代王肯堂所著的《證治準繩》,由銀柴胡(YCH)、胡黃連(HHL)、秦艽(QJ)、醋鱉甲(CBJ)、地骨皮(DGP)、青蒿(QH)、知母(ZM)、甘草(GC)8味藥組成,具有清虛熱、退骨蒸之功效,用于治療肝腎陰虛、虛火內(nèi)擾證,證見骨蒸潮熱或低熱日久不退等[1]。現(xiàn)代臨床常用于外科術后持續(xù)性發(fā)熱、肺結(jié)核發(fā)熱、晚期癌性發(fā)熱等非感染性發(fā)熱的治療[2-4]。

2018年4月,國家中醫(yī)藥管理局會同國家藥品監(jiān)督管理局公布了第一批《古代經(jīng)典名方目錄》[5],清骨散為第69號方。近期國家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則(試行)》(以下簡稱“指導原則”)[6]中明確提出,基準樣品作為復方制劑藥學研究的參照,是經(jīng)典名方開發(fā)的重要一環(huán),其中量值傳遞研究是基準樣品研究的關鍵;應建立經(jīng)典名方基準樣品整體質(zhì)量評價方法,加強化學成分表征,開展量值傳遞研究以明確關鍵質(zhì)量屬性。然而,目前關于清骨散基準樣品及其量值傳遞研究鮮有報道,制約了經(jīng)典名方清骨散復方制劑的研發(fā)。

2008年,本課題組首次提出基于定量指紋圖譜技術的中藥質(zhì)量控制策略[7,8]。定量指紋圖譜技術是中藥指紋圖譜技術與多指標成分定量分析相結(jié)合的中藥質(zhì)量控制模式,突出指標性成分的同時,兼顧了微量成分及中藥整體質(zhì)量,使得中藥質(zhì)量控制更加快速、全面、準確可靠,目前已經(jīng)在20多個中藥材和30多個中成藥質(zhì)量控制方面得到了廣泛的應用[9-11]。本實驗根據(jù)清骨散關鍵信息考證結(jié)果,采用隨機數(shù)表法組合制備出15批清骨散基準樣品凍干粉,建立了清骨散基準樣品高效液相色譜-二極管陣列檢測(HPLC-DAD)定量指紋圖譜,并利用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF-MS)技術對指紋譜圖中特征峰進行指認,進一步采用定量指紋圖譜方法測定了其中5個主要活性成分的含量,分析飲片-基準樣品的量值傳遞規(guī)律,明確關鍵質(zhì)量屬性,為經(jīng)典名方清骨散的復方制劑研究及質(zhì)量標準制定奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Alliance e2695高效液相色譜系統(tǒng),包括四元泵、DAD檢測器、自動進樣器、柱溫箱、Empower色譜工作站(Waters,美國);Agilent Infinity Ⅱ 1290-6545高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(Agilent,美國);XS105型十萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

對照品龍膽苦苷(批號:110770-201918,規(guī)格:20 mg,純度:97.10%)、芒果苷(批號:111607-201704,規(guī)格:20 mg,純度:98.10%)、胡黃連苷Ⅱ(批號:111596-201805,規(guī)格:20 mg,純度:93.20%)、胡黃連苷Ⅰ(批號:111727-201702,規(guī)格:20 mg,純度:95.60%)、甘草酸銨(批號:110731-202021,規(guī)格:20 mg,純度:96.20%)購自中國食品藥品檢定研究院。色譜級乙腈、甲醇、乙醇均購自美國Sigma-Aldrich公司,色譜級甲酸和磷酸購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實驗室用水來自Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)(Millipore,美國)。

清骨散處方藥材由神威藥業(yè)有限公司提供,經(jīng)中國科學院大連化學物理研究所楊小平高級工程師鑒定,8味藥材均符合2020年版《中國藥典》的相關規(guī)定。根據(jù)各藥味炮制歷史沿革考證信息,制成飲片,將各批飲片隨機組合,按照《古代經(jīng)典名方中藥復方制劑及其物質(zhì)基準的申報資料要求(征求意見稿)》[12]要求,制備15批清骨散基準樣品。具體組方藥材信息見表1。

1.2 基準樣品的制備

根據(jù)國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》[5]中清骨散處方和制法,經(jīng)關鍵信息考證,明代一錢折合成現(xiàn)代3.73 g,一盅折合成現(xiàn)代200 mL,確定處方為銀柴胡5.60 g,知母、胡黃連、地骨皮、秦艽、青蒿、醋鱉甲各3.73 g,甘草1.87 g;制備方法為取8味處方量飲片共29.85 g,置陶瓷鍋中,加水400 mL,浸泡30 min,煎煮至160 mL,濾過,減壓濃縮至投料量和濃縮液質(zhì)量比為1∶1.6,冷凍干燥,即得清骨散基準樣品凍干粉。

1.3 干膏率的測定

取1.2節(jié)中制備的清骨散水煎液,精密量取水煎液25 mL,置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干后,于105 ℃干燥3 h,置于干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定重量,計算干膏率。干膏率=WV/vY×100%,其中W表示所得干膏質(zhì)量(g),V表示水煎液總體積(mL),v表示取樣體積(mL),Y表示處方飲片質(zhì)量(g)。

1.4 對照品溶液的制備

取龍膽苦苷、芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ和甘草酸銨對照品適量,精密稱定,加50%乙醇水溶液制成每1 mL含龍膽苦苷200 μg、芒果苷20 μg、胡黃連苷Ⅱ 200 μg、胡黃連苷Ⅰ 50 μg、甘草酸銨20 μg的混合溶液。

表1 清骨散組方藥材信息Table 1 Information of the medicinal materials of Qinggusan

1.5 供試品溶液的制備

取清骨散基準樣品凍干粉約0.15 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇水溶液25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率400 W,頻率40 kHz)15 min,放冷,再稱定重量,用50%乙醇水溶液補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液。

1.6 分析條件

1.6.1HPLC-DAD

色譜柱:Waters Symmetry Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:A相為乙腈,B相為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫條件:0～8 min,0A;8～10 min,0A～10%A;10～32 min,10%A～12%A;32～43 min,12%A～15%A;43～50 min,15%A～16%A;50～78 min,16%A～20%A;78～109 min,20%A～52%A。流速:1 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:30 ℃;檢測波長:254 nm。

1.6.2HPLC-Q-TOF-MS

HPLC-Q-TOF-MS的色譜條件同1.6.1節(jié)。

離子源:電噴霧雙噴離子源(Dual AJS ESI),正、負離子采集模式;掃描模式:一級質(zhì)譜采集(MS),自動二級質(zhì)譜采集(auto MS/MS);掃描范圍:MSm/z50～2 000,MS/MSm/z50～2 000;氣簾氣溫度:320 ℃;鞘氣溫度:320 ℃;干燥氣流速:8 L/min,離子化壓力:+3 500 V/-3 500 V;毛細管出口電壓:75 V;碰撞能:40 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 干膏率

按照1.3節(jié)中的方法測定干膏率,結(jié)果顯示15批清骨散基準樣品的干膏率在24.10%～26.88%之間,均值為25.10%,干膏率在均值的95.78%～107.10%,符合“指導原則”關于干膏率應控制在均值90%～110%的要求。

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1指紋圖譜的建立

取15批(S1～S15)清骨散基準樣品凍干粉,按1.5節(jié)中的方法制備基準樣品供試品溶液,按1.6.1節(jié)中的HPLC-DAD色譜條件依次進樣檢測,獲得15批清骨散基準樣品的HPLC指紋圖譜,將S1～S15批清骨散基準樣品的色譜圖全部導入《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2012版),以S1為參照譜圖,采用中位數(shù)法進行自動匹配,加以多點校正,得到15批清骨散基準樣品的指紋圖譜疊加圖(圖1),確定12個共有色譜峰,生成對照指紋圖譜(圖2)。

圖1 15批清骨散基準樣品的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 15 batches of Qinggusan reference samples

圖2 清骨散基準樣品的HPLC對照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint of Qinggusan reference samples 1.loganin acid,L-picein;2.swertiamarin/androsin;3.neomangiferin;4.gentiopicrin;5.dichotomine B;6./;7.mangiferin;8.picroside Ⅳ;9.picroside Ⅱ;10.picroside Ⅰ;11./;12.glycyrrhizic acid.

采用1.6.2節(jié)中的HPLC-Q-TOF-MS的條件對清骨散基準樣品供試品溶液及各味飲片水煎液的化學組成進行定性分析。通過與對照品對比、一級精確質(zhì)量數(shù)及二級碎片離子信息分析,對清骨散基準樣品對照指紋圖譜中12個共有峰進行指認[13-18],包括6個環(huán)烯醚萜類、2個黃酮類、1個生物堿類、1個三萜皂苷類以及2個其他類(表2)。

環(huán)烯醚萜類化合物 環(huán)烯醚萜類化合物主要包括環(huán)戊烷型、環(huán)戊烯型、環(huán)氧烷型、裂環(huán)型等4類成分。環(huán)烯醚萜類化合物在負離子模式下主要以[M-H]-、[M+HCOO]-的準分子離子峰形式存在,其中環(huán)氧烷型環(huán)烯醚萜類主要發(fā)生糖苷鍵以及酯鍵的斷裂[13,14],以胡黃連苷Ⅱ為例,保留時間為54.774 min,根據(jù)負離子模式下,一級質(zhì)譜信息顯示,其準分子離子峰為m/z511.145 3 [M-H]-,進一步進行二級質(zhì)譜掃描,由準分子離子峰中酯鍵斷裂得到碎片離子m/z167.034 8 [M-H-Glc-C9H10O4]-,再進一步丟失1分子CO2得到碎片離子m/z123.045 0 [M-H-Glc-C9H10O4-CO2]-,并與對照品比對,質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致,故確定其為胡黃連苷Ⅱ,根據(jù)裂解規(guī)律,以此類推,清骨散基準樣品中共鑒定出6個環(huán)烯醚萜類化合物,包括表2中化合物馬錢苷酸(loganin acid)、獐牙菜苦苷(swertiamarin)、龍膽苦苷(gentiopicrin)、胡黃連苷IV(picroside Ⅳ)、胡黃連苷Ⅱ(picroside Ⅱ)、胡黃連苷Ⅰ(picroside Ⅰ)。

黃酮類化合物 黃酮類化合物在正離子模式下主要以[M+H]+的準分子離子峰形式存在,主要發(fā)生糖鏈、側(cè)鏈的裂解和脫水[15],以芒果苷為例,保留時間為37.815 min,根據(jù)正離子模式下,一級質(zhì)譜信息顯示,其準分子離子峰為m/z423.092 2 [M+H]+,進一步進行二級質(zhì)譜掃描,由準分子離子峰中葡萄糖裂解得到碎片離子m/z303.049 9 [M+H-C4H8O4]+,再進一步丟失一分子CH2O生成m/z273.039 2 [M+H-C4H8O4-CH2O]+。另一個裂解特征是準分子離子峰m/z423.092 2 [M+H]+直接脫去2分子H2O和2分子CH2O得到碎片離子m/z327.050 1 [M+H-C2H6O4]+。與對照品比對,質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致,故確定其為芒果苷。根據(jù)裂解規(guī)律,以此類推,清骨散基準樣品中共鑒定出2個黃酮類化合物,包括表2中化合物新芒果苷(neomangiferin)和芒果苷(mangiferin)。

表2 清骨散基準樣品特征峰的鑒定Table 2 Identification of characteristic peaks of Qinggusan reference samples

生物堿類化合物 吲哚類生物堿在正離子模式下主要以[M+H]+的準分子離子峰形式存在,主要發(fā)生環(huán)內(nèi)叔胺碳氮鍵斷裂[16,17],以銀柴胡胺B為例,保留時間為25.267 min,根據(jù)正離子模式下,一級質(zhì)譜信息顯示,其準分子離子峰為m/z273.087 0 [M+H]+,進一步進行二級質(zhì)譜掃描,由準分子離子峰中季胺發(fā)生α鍵斷裂及丟失1分子CO2得到碎片離子m/z169.075 7 [M+H-C3H4O4]+,再進一步發(fā)生環(huán)內(nèi)叔胺碳氮鍵斷裂丟失NH生成m/z154.064 9 [M+H-C3H4O4-NH]+。另一個裂解特征是準分子離子峰m/z273.087 0 [M+H]+丟失一分子CH2O2得到碎片離子m/z227.081 3 [M+H-CH2O2]+,再丟失一分子H2O得到碎片m/z209.070 7 [M+H-CH2O2-H2O]+,烯醇結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,進一步丟失一分子CO得到碎片離子m/z181.075 8 [M+H-CH2O2-H2O-CO]+,鑒定該化合物為銀柴胡胺B(dichotomine B)。

2.2.2指紋圖譜方法學考察

精密度試驗 取同一批次清骨散基準樣品,制備供試品溶液,連續(xù)進樣6次,記錄指紋圖譜。各特征峰的相對保留時間RSD均小于1%,主要特征峰的相對峰面積RSD小于5%,表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗 取同一批次清骨散基準樣品,制備供試品溶液,分別于0、6、12、18、24 h注入液相色譜儀,記錄指紋圖譜。各特征峰的相對保留時間RSD均小于1%,主要特征峰的相對峰面積RSD小于5%,表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗 取同一批次清骨散基準樣品,制備6份供試品溶液,進樣,記錄指紋圖譜。各特征峰的相對保留時間RSD均小于1%,主要特征峰的相對峰面積RSD小于5%,表明該方法重復性良好。

2.2.3指紋圖譜相似度評價

將得到的15批清骨散基準樣品指紋圖譜導入《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2012版),選擇響應較高且出峰時間相對居中的胡黃連苷Ⅱ作為參照峰,進行色譜峰匹配,計算不同批次清骨散基準樣品與對照指紋圖譜的相似度。結(jié)果顯示,15批清骨散基準樣品的相似度均>0.95,表明清骨散基準樣品的制備工藝穩(wěn)定,批間質(zhì)量一致性較好。

2.2.4指紋圖譜共有峰歸屬

通過清骨散基準樣品S1與銀柴胡、地骨皮、胡黃連、青蒿、知母、醋鱉甲、秦艽、甘草8味飲片的指紋圖譜比對(圖3)，將清骨散基準樣品中12個共有峰歸屬到各味飲片。其中1、2號峰來源于秦艽和胡黃連,3、7號峰來源于知母,4號峰來源于秦艽,5號峰來源于銀柴胡,6、8～11號峰來源于胡黃連,12號峰來源于甘草。進一步計算各味飲片與清骨散基準樣品的指紋圖譜相似度,依次為0.79(胡黃連)、0.61(秦艽)、0.11(知母)、0.07(甘草)、0.02(銀柴胡)、0(地骨皮)、0(青蒿)、0(鱉甲),3味飲片對基準樣品指紋圖譜均無貢獻度。研究表明,地骨皮和青蒿水提液中含有微量的地骨皮乙素等生物堿類、異綠原酸A/B/C等苯丙素類成分,針對該類化合物帶電荷的特點,建議可以探索基于離子交換模式選擇性富集目標化合物,開發(fā)鑒別方法。鱉甲的主成分為脯氨酸等氨基酸類、糖類,該類化合物極性強,在反相色譜上保留較弱,建議可以探索大類成分質(zhì)控方法。因此,后續(xù)工作將通過清骨散基準樣品指紋圖譜特征峰歸屬,結(jié)合鑒別、大類成分測定等方法,實現(xiàn)全方藥味的整體質(zhì)量控制,闡明各藥味特征成分的量值傳遞規(guī)律。

圖3 清骨散基準樣品S1與單味飲片的HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of Qinggusan reference sample S1 and its pieces QGS:Qinggusan reference sample S1.Peaks 1-12 were the same as that in Fig.2.

2.3 指標成分含量測定及量值傳遞研究

根據(jù)文獻研究,清骨散的現(xiàn)代藥理作用主要為解熱、抗炎和調(diào)節(jié)免疫功能[19,20],其主要活性成分為君藥銀柴胡中銀柴胡胺B[16],臣藥知母中芒果苷[21],臣藥胡黃連和佐藥秦艽中環(huán)烯醚萜類[22,23]、包括胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ、龍膽苦苷等,使藥甘草中甘草酸[24,25]。采用指紋圖譜結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術,以上類別中6個活性成分得到指認,并且可以從飲片傳遞到基準樣品。其中,銀柴胡胺B的含量低于萬分之一,不宜作為定量指標。因此,最終選擇芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ、龍膽苦苷和甘草酸為定量指標成分,建立清骨散基準樣品的含量測定方法。

圖4 混合對照品的HPLC-DAD色譜圖Fig.4 HPLC-DAD chromatogram of mixed reference substances

2.3.1系統(tǒng)適用性試驗

取龍膽苦苷、芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ和甘草酸的混合對照品溶液，按照1.6.1節(jié)中的HPLC-DAD色譜條件進行測定，記錄色譜圖(見圖4)。龍膽苦苷、芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ和甘草酸5種化學成分的保留時間分別為24.39、39.11、55.82、68.35、103.47 min，本實驗條件下所測的5種成分均實現(xiàn)基線分離，拖尾因子均在0.95～1.05，理論塔板數(shù)大于10 000,系統(tǒng)適用性試驗良好。

2.3.2方法學考察

線性關系 精密吸取龍膽苦苷、芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ和甘草酸對照品儲備液適量,配制系列混合對照品溶液,按照1.6.1節(jié)中的HPLC-DAD色譜條件進行測定,以各對照品質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標,峰面積Y為縱坐標,繪制標準曲線,得線性回歸方程、相關系數(shù)(R2)和線性范圍,結(jié)果見表3。

檢出限和定量限 精密吸取龍膽苦苷、芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ和甘草酸對照品儲備液適量,逐級稀釋后進行測定,按照1.6.1節(jié)中的HPLC-DAD色譜條件進行測定,以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD),10倍信噪比計算定量限(LOQ),結(jié)果表明該方法具有良好的靈敏度,結(jié)果見表3。

表3 5個成分的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限Table 3 Linear equations,correlation coefficients (R2),linear ranges,LODs and LOQs of the five components

精密度試驗 取同一批次清骨散基準樣品,制備供試品溶液,連續(xù)進樣6次,計算龍膽苦苷、芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ和甘草酸含量的RSD，均在0.20%～0.31%之間,表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗 取同一批次清骨散基準樣品,制備供試品溶液,分別于0、6、12、18、24 h注入液相色譜儀,計算龍膽苦苷、芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ和甘草酸含量的RSD，均在0.27%～0.40%之間,表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗 取同一批次清骨散基準樣品,制備6份供試品溶液,進樣,計算龍膽苦苷、芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ和甘草酸含量的RSD，均在0.37%～1.3%之間,表明該方法重復性良好。

表4 清骨散基準樣品中指標成分含量及轉(zhuǎn)移率Table 4 Contents and transfer rates of the index components in Qinggusan reference samples

加標回收試驗 精密稱取9份已知含量的同一批次清骨散基準樣品,每份0.075 g,均分為3組,每組分別按5個成分含量的50%、100%、150%的比例精密加入相應的龍膽苦苷、芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ和甘草酸對照品,按1.5節(jié)中的方法制備供試品溶液,按1.6.1節(jié)中的HPLC-DAD色譜條件進行測定,結(jié)果顯示,龍膽苦苷、芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ和甘草酸的平均回收率均在95%～105%之間,RSD均在1.5%～3.9%之間,表明方法準確度良好。

2.3.3樣品含量測定及量值傳遞研究

依據(jù)2020年版《中國藥典》對飲片中5個指標成分進行含量測定,采用已開發(fā)的定量指紋圖譜方法對15批清骨散基準樣品進行分析,測定龍膽苦苷、芒果苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ和甘草酸含量(見表4),并計算飲片→基準樣品中指標成分轉(zhuǎn)移率。轉(zhuǎn)移率=wm/WM×100%,其中w表示基準樣品中指標成分的含量,m表示基準樣品的樣品量,W表示飲片中指標成分的含量,M表示處方中飲片質(zhì)量。結(jié)果顯示,15批清骨散基準樣品中龍膽苦苷、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅰ的含量及轉(zhuǎn)移率均在其均值的70%～130%范圍內(nèi),表明清骨散基準樣品制備工藝穩(wěn)定。然而,部分基準樣品中甘草酸和芒果苷的含量和轉(zhuǎn)移率未在其均值的70%～130%之間。研究表明,甘草和知母不同組織部位中指標成分含量存在顯著性差異[26,27],是造成不同批次基準樣品中甘草酸和芒果苷含量差異較大的主要原因。因此,建議制定甘草和知母飲片內(nèi)控質(zhì)量標準,從源頭保證飲片質(zhì)量均一,以確保清骨散基準樣品的質(zhì)量穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本研究建立了一種經(jīng)典名方清骨散基準樣品的HPLC-DAD定量指紋圖譜方法,結(jié)合HPLC-Q-TOF-MS技術,指認了12個共有峰,歸屬到5味飲片,并通過5個主要活性成分的含量測定闡釋了飲片→基準樣品的量值傳遞規(guī)律。該方法具有簡便、準確可靠等特點,可對經(jīng)典名方清骨散基準樣品進行定性和定量分析,明確清骨散基準樣品關鍵質(zhì)量屬性,為后續(xù)清骨散復方制劑的開發(fā)及質(zhì)量控制提供依據(jù)。