凝膠滲透色譜-氣相色譜-離子阱質(zhì)譜法測(cè)定桔梗原藥和當(dāng)歸提取物中101種農(nóng)藥殘留

張 蓉,陳 躍,鄭 培,代 瑩,李莎莎,賈穎異,謝 然,王金花*(.中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心,北京 0006;.山東警察學(xué)院,山東 濟(jì)南 5000)

中藥材是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的重要組成部分,也是中華民族傳統(tǒng)文化的瑰寶,隨著世界天然藥物的研發(fā)熱潮和中藥在此次新冠疫情中的廣泛應(yīng)用,東南亞及歐美市場(chǎng)對(duì)中藥的關(guān)注日益增強(qiáng)。目前,常用中藥材多采用農(nóng)業(yè)種植的方式獲得,為防治作物病除害,不可避免在中藥材的生產(chǎn)過程中使用農(nóng)藥,因此容易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留問題[1]?！吨袊?guó)藥典》對(duì)農(nóng)殘檢測(cè)方法的多次更新和修訂正是為了不斷增強(qiáng)中藥材中農(nóng)藥殘留的監(jiān)管水平,促進(jìn)中藥材的質(zhì)量提升和保障消費(fèi)者的使用安全。2020年版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定了人參、甘草、西洋參等常用中藥材中有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法及限量標(biāo)準(zhǔn),其中五氯硝基苯(PCNB)、六氯苯、氯丹(順式氯丹、反式氯丹和氧化氯丹之和)、六六六(BHC)不得超過0.1 mg/kg,七氯(七氯、環(huán)氧七氯之和)不得超過0.05 mg/kg,滴滴涕(DDT)不得超過1 mg/kg[2];四部“2341農(nóng)藥殘留量測(cè)定法”中給出了農(nóng)藥殘留的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和檢出限,“0212藥材和飲片檢定通則”中規(guī)定了33種禁用農(nóng)藥,并且要求該類農(nóng)藥在中藥材及飲片(植物類)中不得檢出[3]。2017版《日本藥局方》中規(guī)定了六六六和滴滴涕在20種藥材中農(nóng)藥殘留限量為0.2 mg/kg;《美國(guó)藥典》規(guī)定了76種農(nóng)藥殘留限量,《歐洲藥典》在農(nóng)藥殘留限量上與美國(guó)藥典保持一致[4];而韓國(guó)在第10版《韓國(guó)藥典》(KP 10)中規(guī)定了生藥及其萃取物中農(nóng)藥殘留的限量,要求所有標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的生藥及其萃取物都需滿足農(nóng)藥殘留的限量要求,其中六六六限量為0.2 mg/kg,滴滴涕限量為0.1 mg/kg,狄氏劑、異狄氏劑、艾氏劑限量均為0.01 mg/kg[5]。

目前,中藥材中農(nóng)藥殘留檢測(cè)多關(guān)注六六六、滴滴涕以及五氯硝基苯等有機(jī)氯農(nóng)藥和對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、甲胺磷、久效磷等有機(jī)磷農(nóng)藥[6],崔麗麗等[7]利用QuEChERS-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)人參中的六六六、滴滴涕和六氯苯等有機(jī)氯農(nóng)藥進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)人參樣品中α-BHC、δ-BHC、六氯苯和p,p′-滴滴伊均有檢出,分別為0.011、0.014、0.007和0.018 mg/kg,張雪輝等[8]對(duì)23種中藥材中六六六、滴滴涕和五氯硝基苯殘留量進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分樣品都有不同程度的檢出,但農(nóng)藥殘留量多在中國(guó)藥典的限量范圍之內(nèi)。王芳煥等[9]用QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)枸杞中20種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了分析,在選取的20個(gè)樣品中氯氟氰菊酯、噠螨靈、苯醚甲環(huán)唑和氯氰菊酯的檢出率分別為30%、25%、35%、30%,其中氯氟氰菊酯的檢測(cè)值最高為1.759 mg/kg,呂盼等[10]以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)了陳皮原料藥材中179種農(nóng)藥,在選取的11批次樣品中檢出毒死蜱、戊唑醇、炔螨特、三氯殺螨醇、丙溴磷等農(nóng)藥,甚至個(gè)別樣品檢出的戊唑醇?xì)埩舾哌_(dá)47.025 mg/kg。從檢測(cè)方法上看,文獻(xiàn)中對(duì)中藥中農(nóng)殘的檢測(cè)多采用色譜法并配以不同檢測(cè)器[11-13],這些選擇性檢測(cè)器雖然靈敏度較高,但不能提供農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)信息,定性能力較弱,而采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以同時(shí)對(duì)各種類型的農(nóng)藥進(jìn)行定性定量分析,以提高分析的準(zhǔn)確性,常用的有氣/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣/液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法等[14-22],2020版《中國(guó)藥典》(四部)[3]“2341農(nóng)藥殘留量測(cè)定法”中也新增了“第四法 農(nóng)藥多殘留測(cè)定法(質(zhì)譜法)”,提供了QuEChERS結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)中藥中88種農(nóng)藥殘留定量檢測(cè)的方法,其凈化過程采用分散固相萃取劑(無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺(PSA)300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、硅膠300 mg、石墨化炭黑90 mg)凈化樣品提取液。鮮見使用離子阱質(zhì)譜法的相關(guān)報(bào)道。因此,本文建立了一種利用氣相色譜-離子阱質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)中藥材中101種常見農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法,在采用凝膠滲透色譜(GPC)凈化的條件下,通過優(yōu)化離子阱質(zhì)譜參數(shù),達(dá)到進(jìn)一步排除復(fù)雜基質(zhì)干擾、提高目標(biāo)化合物信號(hào)的效果,其對(duì)復(fù)雜中藥基質(zhì)的凈化效果和凈化容量?jī)?yōu)于QuEChERS法,同時(shí)可采用凝膠滲透色譜設(shè)備實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化前處理,為中藥材的農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供有益的方法補(bǔ)充。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(AS 3000,TraceGC Ultra,PolarisQ MS,美國(guó)Thermo公司);凝膠滲透色譜儀(美國(guó)J2 Scientific公司);KQ-250型超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司);EYELA-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會(huì)社);DSY-II自動(dòng)快速濃縮儀(北京金科精華苑科技研究所);丙酮、甲苯、乙酸乙酯、環(huán)己烷、二氯甲烷均為色譜級(jí)(美國(guó)J.T.Baker公司);101種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司);FW400A型高速萬能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:將各標(biāo)準(zhǔn)品分別以甲苯配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)氣相色譜保留時(shí)間將101種農(nóng)藥分為兩組(見表1),并分別按靈敏度高低用甲苯將單標(biāo)儲(chǔ)備液配制成兩組混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,實(shí)驗(yàn)時(shí)用甲苯將上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋,配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于-20 ℃冰箱避光保存。

柴胡、桔梗(北京同仁堂中藥進(jìn)出口有限公司)經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成60～200目粉末,低溫、干燥保存。當(dāng)歸提取物(河南中冠健業(yè)生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1色譜條件

DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:高純氦氣(純度≥99.999%);流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;柱起始溫度40 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升到160 ℃,以2 ℃/min升到230 ℃,以20 ℃/min升到300 ℃,保持5 min。

1.2.2質(zhì)譜條件

電離方式:電子轟擊源(EI);電離能量:70 eV,離子源溫度250 ℃,傳輸線溫度:280 ℃,最大激發(fā)能量(maximum excitation energy,q):0.3。采用二級(jí)離子監(jiān)測(cè)模式:每種化合物選擇一個(gè)母離子,然后選擇1～3個(gè)子離子,每種化合物的母離子、子離子、掃描時(shí)間、碰撞能量等見表1。

表1 101種農(nóng)藥殘留的保留時(shí)間、質(zhì)譜參數(shù)和在混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中的濃度Table 1 Retention times,MS parameters and concentrations in mixed standard stock solution for the 101 pesticides

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

1.3 提取與凈化

稱取5.0 g粉碎好的試樣,加入20 mL乙腈超聲30 min,6 000 r/min離心5 min后轉(zhuǎn)移提取液到雞心瓶中,試樣殘?jiān)?0 mL乙腈按上述步驟再提取一次,合并兩次提取液并在40 ℃以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干,用2 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,v/v)洗滌旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾轉(zhuǎn)移至GPC進(jìn)樣瓶。

GPC條件為:柱長(zhǎng)40 cm,內(nèi)徑20 mm,填料粒度200～400目,流動(dòng)相乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,v/v),進(jìn)樣量2 mL,流速4 mL/min,收集時(shí)間17～30 min。收集后,在40 ℃以下濃縮至近干。用1 mL甲苯定容,待檢測(cè)。

圖1 升溫速率為(a)5 ℃/min和(b)2 ℃/min時(shí)色譜分離效果對(duì)比Fig.1 Comparison of chromatographic separation effects at heating rates of (a) 5 ℃/min and (b) 2 ℃/min

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

為提高檢測(cè)靈敏度,讓化合物盡量實(shí)現(xiàn)最大分離,嘗試了不同的程序升溫條件。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的101種農(nóng)藥的出峰溫度主要集中在160～230 ℃,比較了該溫度范圍內(nèi)升溫速率為5 ℃/min(見圖1a)和2 ℃/min(見圖1b)時(shí)化合物的分離效果,可以看出后者能實(shí)現(xiàn)更好的分離效果以減少化合物的共流出對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度的負(fù)面影響,因此采用160～230 ℃間升溫速率為2 ℃/min作為程序升溫的中段條件。

離子阱質(zhì)譜是時(shí)間串聯(lián)型質(zhì)譜,離子被抓取和裂解時(shí)都在同一個(gè)阱中完成,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)同一保留時(shí)間有多個(gè)化合物時(shí)儀器檢測(cè)靈敏度會(huì)略低,因此,根據(jù)101種農(nóng)藥的出峰時(shí)間和分離度,將其分為Ⅰ組和Ⅱ組進(jìn)行分析,能獲得更好的靈敏度,空白桔梗基質(zhì)添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的二級(jí)總離子流圖見圖2。

圖2 空白加標(biāo)桔梗溶液的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of blank spiked Platycodonis radix solution

2.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

二級(jí)質(zhì)譜的定性定量通常是每種化合物選擇一個(gè)母離子,采用合適的碰撞電壓對(duì)其進(jìn)行二級(jí)電離,然后在碎片離子中選擇1～3個(gè)碎片離子對(duì)目標(biāo)化合物定性定量,這符合歐盟指令2002/657/EC規(guī)定的在應(yīng)用質(zhì)譜儀對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行確證時(shí)的評(píng)價(jià)準(zhǔn)則。在本方法中,中藥樣品基質(zhì)非常復(fù)雜,具有很強(qiáng)的基質(zhì)干擾,因此選擇滿足條件且基質(zhì)干擾較小的母離子、選擇合適的碰撞電壓及最大激發(fā)能量就成為優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)的關(guān)鍵問題。

圖3 (a)乙拌磷的全掃質(zhì)譜圖及選用(b)m/z 186和(c)m/z 245為母離子時(shí)空白桔?；|(zhì)的總離子流圖Fig.3 (a) Full scan MS spectra of disulfoton and total ion chromatograms of blank Platycodonis radix matrix with precursor ions (b) m/z 186 and (c) m/z 245

首先,選擇合適的母離子和子離子是保證目標(biāo)化合物獲得最佳靈敏度的重要前提。母離子應(yīng)優(yōu)先選擇m/z較大且相對(duì)豐度較大的碎片離子,但由于某些m/z或豐度較大的離子有基質(zhì)干擾,因此需要選擇其他更合適的離子作為母離子以避免干擾,例如,乙拌磷的初級(jí)碎裂質(zhì)譜圖中(見圖3a),m/z186的碎片離子豐度明顯高于m/z245,本應(yīng)選擇m/z為186的碎片離子作為母離子,但因?yàn)榻酃悠分幸伯a(chǎn)生m/z186碎片離子,采用此離子作為母離子時(shí)樣品基質(zhì)產(chǎn)生的背景干擾(見圖3b)比m/z為245的碎片離子作為母離子時(shí)(見圖3c)高10倍,所以為降低化合物電離時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，最終選擇m/z為245的碎片離子作為母離子。

其次,一般來說提高激發(fā)電壓可使離子阱中的母離子加速與惰性氣體分子發(fā)生劇烈碰撞,促進(jìn)母離子的裂解,即碰撞電壓的大小能影響母離子的裂解程度。通常選擇能使母離子充分裂解的電壓以確?；衔锒?jí)質(zhì)譜的響應(yīng)達(dá)到最大,但不同化合物裂解情況不一,如降低殺撲磷激發(fā)電壓反而可以增加子離子的豐度,當(dāng)激發(fā)電壓由1 V降低至0.8 V時(shí)子離子豐度增加了43.4%(見圖4a)。又如溴苯磷的激發(fā)電壓由1 V增加到1.5 V時(shí),雖然可以使其母離子m/z377碎裂更完全,可子離子m/z362的豐度也隨之降低36.3%,因此仍然采用1 V作為激發(fā)電壓(見圖4b)。

圖4 不同激發(fā)電壓下(a)殺撲磷和(b)溴苯磷的母離子碎裂質(zhì)譜圖Fig.4 Precursor ion cleavage MS spectra of (a) methidathion and (b) leptophos at different excitation voltages

最后,離子阱的特征是選擇和儲(chǔ)存離子,最大激發(fā)能量(q值)是表征離子在阱中穩(wěn)定性的無量綱參數(shù)。q值大,離子在阱中的振蕩能量高,離子易裂解,但同時(shí)也會(huì)造成碎片離子易從阱中拋出。相反,q值小,離子在阱中相對(duì)穩(wěn)定,但母離子不易裂解,相應(yīng)的子離子產(chǎn)率比較低。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)q值為0.225、0.3、0.45時(shí)對(duì)多數(shù)母離子碎裂的影響不大,因此全部采用0.3,這也與Derouiche等[23]的研究結(jié)果一致。

2.3 前處理?xiàng)l件的選擇

考慮到對(duì)多種農(nóng)藥殘留的整體提取效率,重點(diǎn)考察了乙腈、丙酮和乙酸乙酯等3種常用于多殘留檢測(cè)的提取溶劑,經(jīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)比,3種溶劑雖然在個(gè)別農(nóng)藥上的提取效率各有高低、但綜合來看乙腈對(duì)多種農(nóng)藥成分的整體提取效率略好于另外兩種,目標(biāo)檢測(cè)物的響應(yīng)值較高,同時(shí)提取的色素和油脂等雜質(zhì)也相對(duì)較少,這有利于降低背景干擾,提高檢測(cè)靈敏度,因此選定乙腈作為提取溶劑。

凈化方式對(duì)去除雜質(zhì)、降低背景干擾、提高方法檢出限具有重要意義,實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了各種常用SPE固相萃取小柱和GPC的凈化效果。由于中藥材基質(zhì)復(fù)雜、脂類雜質(zhì)較多,經(jīng)過對(duì)比碳十八固相萃取柱(C18)、弗羅里硅土固相萃取柱(Florisil)、中性氧化鋁固相萃取柱(N-Al2O3)以及GPC凈化后的效果(見圖5),凈化效果從總離子流圖上判斷依次為GPC>Florisil≈N-Al2O3>C18。因此,決定采用GPC凈化。

圖5 不同凈化方法下空白加標(biāo)桔梗基質(zhì)的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatograms of of Platycodonis radix in blank spiked matrix solution with different clean methods GPC:gel permeation chromatography.

2.4 線性范圍、定量限和回收率

本實(shí)驗(yàn)采用空白樣品提取液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線,以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度(X,μg/L)及該化合物峰面積(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性方程和相關(guān)系數(shù)(r2),見附表1和附表2(詳見https://www.chrom-China.com)。結(jié)果表明,101種農(nóng)藥在一定線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)>0.995,滿足分析要求。以基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液S/N≥3和10分別計(jì)算得到方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),101種農(nóng)藥的檢出限和定量限范圍分別為0.2～40.0 μg/kg和0.6～120.0 μg/kg,具體數(shù)值見附表1和附表2。

分別對(duì)桔梗原藥和當(dāng)歸提取物進(jìn)行了高、中、低3水平添加試驗(yàn)(n=10),計(jì)算回收率和精密度。測(cè)定結(jié)果表明,101種農(nóng)藥在這兩種基質(zhì)中的平均回收率為58.3%～108.9%,10次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～16.5%,結(jié)果均滿足定量分析要求,每種基質(zhì)中各農(nóng)藥的添加水平和回收率等測(cè)定結(jié)果詳見附表1和附表2。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法檢測(cè)了本市藥店購(gòu)買的3批桔梗和3批當(dāng)歸原藥,未檢測(cè)到樣品中含有本方法相關(guān)農(nóng)藥,隨樣品進(jìn)行基質(zhì)添加,其回收率滿足方法要求。通過對(duì)當(dāng)歸原藥基質(zhì)添加的方法,采用本方法和《桑枝、金銀花、枸杞子和荷葉中488種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》(GB 23200.10-2016)同時(shí)檢測(cè),相同農(nóng)藥定量結(jié)果的精密度小于15%,說明本方法可用于相關(guān)農(nóng)藥在中藥材中的定量檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究通過使用氣相色譜-離子阱質(zhì)譜技術(shù)建立了一種可操作性強(qiáng)、高效且可同時(shí)檢測(cè)桔梗原藥及當(dāng)歸提取物中101種農(nóng)藥殘留的方法。本方法采用GPC為凈化手段,有效去除了樣品中的油脂、色素等干擾儀器檢測(cè)的雜質(zhì),采用氣相色譜-離子阱質(zhì)譜二級(jí)離子模式檢測(cè),通過對(duì)色譜條件、質(zhì)譜掃描參數(shù)的優(yōu)化,進(jìn)一步排除了基質(zhì)干擾。通過對(duì)比桔梗原藥及當(dāng)歸提取物的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對(duì)于雜質(zhì)含量較少的提取物,原藥中絕大部分農(nóng)藥的回收率和靈敏度沒有明顯差異,說明本方法的凈化手段和檢測(cè)技術(shù)能有效排除復(fù)雜中藥基質(zhì)中雜質(zhì)的影響,實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)101種農(nóng)藥的高效、高靈敏度定性和定量分析,方法可滿足當(dāng)前韓國(guó)、日本、歐盟規(guī)定的相關(guān)農(nóng)藥最大殘留限量要求,是對(duì)現(xiàn)有中藥材中多農(nóng)殘檢測(cè)方法的有益補(bǔ)充。