二維超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜法解析替考拉寧雜質

邵伍軍,陳延安,袁紅露,金美春,周雪飛,覃玉梅,楊荷友,和燕玲(浙江海正藥業(yè)股份有限公司,浙江 臺州 318000)

替考拉寧是由放線菌發(fā)酵產(chǎn)生的一系列結構相似的糖肽類抗生素,主要用于治療嚴重的革蘭氏陽性菌感染[1]。替考拉寧結構由七肽苷元母核、N-乙酰葡萄糖、甘露糖、R-氨基葡萄糖組成[2,3]?！吨袊幍洹?020版及《歐洲藥典》10.0收錄的替考拉寧活性組分有TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5、TA2-6,其中TA2-2為主要組分,占各組分相對含量的40%以上,其主成分結構如圖1[4,5]。

替考拉寧母核是由7個氨基酸殘基之間氧化交聯(lián)產(chǎn)生的七肽苷元結構,氨基酸上的羥基會進一步糖基化連接N-乙酰葡萄糖、甘露糖、葡萄糖胺,葡萄糖胺會繼續(xù)發(fā)生脂肪?；?連接的脂肪鏈的長短、取代基及碳鏈的不飽和度造成了替考拉寧各組分之間的差異性。目前,對替考拉寧主成分及雜質的研究方法主要有超高效液相色譜-質譜聯(lián)用、核磁、高效液相色譜-核磁共振聯(lián)用、氣相色譜-質譜聯(lián)用等技術。Barna等[6]通過水解純化、核磁共振、高分辨質譜等技術對替考拉寧5個組分進行了結構鑒定,為以后替考拉寧其他組分及雜質結構鑒定奠定了基礎。Tengattin等[7]基于高效液相色譜-質譜方法發(fā)現(xiàn)TA3-1由TA2-2水解脫去R-氨基葡萄糖而產(chǎn)生。Cometti等[8]通過二維液相色譜-核磁、氣相色譜-質譜技術證明TA2-6a及TA2-6b側鏈為十二烷基?；?0-甲基十一烷基酰基。Borghi等[9]通過純化制備、核磁共振、高分辨質譜等技術證明TA2-1a和TA2-1b側鏈為6-甲基辛?；腿甚；?。Marrubini等[10]建立了液相色譜-質譜方法對替考拉寧主成分及雜質的結構推斷,替考拉寧結構由于含有2個Cl,采用低分辨質譜很難顯示同位素峰,對某些特征離子碎片的推測也存在偏差。García-Gómez等[11]使用不同填料的色譜柱分離替考拉寧組分,通過高分辨質譜推斷了14個其他組分的結構。張含智等[12]基于高效液相色譜-飛行時間質譜推導了11個具有替考拉寧母核組分的結構和4個R-氨基葡萄糖化合物。

TeicoplaninRR′FormulaTA2-1aTA2-1bTA2-1TA2-2TA2-3TA2-4TA2-5TA2-6aTA2-6bC87H95Cl2N9O33C87H95Cl2N9O33C88H95Cl2N9O33C88H97Cl2N9O33C88H97Cl2N9O33C89H99Cl2N9O33C89H99Cl2N9O33C90H101Cl2N9O33C90H101Cl2N9O33TA3-1H/C72H68Cl2N8O28圖1 《歐洲藥典》中替考拉寧的結構Fig.1 StructureofteicoplanininEuropeanpharmacopoeia

近年來,多維或二維液相色譜-質譜聯(lián)用技術對復雜體系的分離分析是分析化學的重要研究方向。與一維液相色譜-質譜聯(lián)用相比,多維或二維液相色譜-質譜聯(lián)用技術既能實現(xiàn)多維或二維液相色譜對復雜體系的分離分析,又能體現(xiàn)質譜高靈敏度及對未知雜質進行定性定量研究的特點,已成為復雜樣品分離分析中的一種非常有效的工具。迄今為止,已有很多關于多維或二維液相色譜-質譜聯(lián)用技術的應用報道,如陳璇等[13]使用在線二維集束毛細管柱-高氣壓光電離-飛行時間質譜測定單萜類化合物;王智聰?shù)萚14]對金銀花中綠原酸和木犀草苷含量的測定;柴爽爽等[15]對水稻葉片蛋白質組的研究;徐明明等[16]使用在線脫鹽質譜法識別了氨基葡萄糖液相色譜的可疑色譜峰等。替考拉寧為發(fā)酵藥物,成分復雜,雜質較多,《歐洲藥典》10.0中替考拉寧分析方法中流動相含有磷酸二氫鈉不揮發(fā)性鹽,與質譜檢測的要求不匹配,重新建立適合質譜檢測的系統(tǒng),雖然對檢出雜質的結構可以推導,但無法實現(xiàn)與藥典色譜條件下各雜質峰的準確定位。因此本實驗建立二維超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜法(2D-UPLC-Q/TOF-MS),對替考拉寧的雜質進行分析,一維液相色譜采用藥典方法對各色譜峰進行分離,對《歐洲藥典》10.0收錄的10個成分根據(jù)相對保留時間進行了準確定位,二維液相色譜與質譜聯(lián)用使用適合質譜檢測的流動相體系進行脫鹽,對替考拉寧的10個成分進行結構確認,同時對其他未知雜質進行一級、二級質譜分析,確認了張含智等[12]推導的11個具有替考拉寧母核組分的結構和4個R-氨基葡萄糖化合物,還發(fā)現(xiàn)了2個替考拉寧母核特征碎片離子及3個未知雜質,為替考拉寧質量控制和工藝改進提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

Waters Acquity UPLC 2D/Xevo G2-XS Q/TOF二維超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)。Milli-Q Advantage A10超純水儀(德國Merck公司)。

乙腈為色譜純(德國Merck公司);甲酸銨、甲酸均為質譜純(德國Sigma公司);其余試劑均為分析純;歐洲藥典委員會替考拉寧對照品(批號:2.0)。

1.2 色譜與質譜條件

1.2.1一維液相色譜方法

色譜柱:Octadecyl silica (ODS) hypersil色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);波長:254 nm;流速:2.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:20.0 μL;流動相A:3.0 g/L磷酸二氫鈉溶液(pH 6.0)/乙腈=9/1(v/v),流動相B:3.0 g/L磷酸二氫鈉溶液(pH 6.0)/乙腈=3/7(v/v)。梯度洗脫程序:0～34.50 min,0B～50%B;34.50～35.60 min,50%B～90%B,35.60～40.25 min,90%B;40.25～47.15 min,90%B～0B;47.15～51.00 min,0B。

1.2.2二維液相色譜方法

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:45 ℃;流動相A:0.01 mol/L甲酸銨水溶液(pH 6.0),流動相B:乙腈;流速:0.5 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min,2%B;2.0～30.0 min,2%B～80%B;30.0～35.0 min,80%B;35.0～35.1 min,80%B～2%B;35.1～38.0 min,2%B。

1.2.3質譜條件

電噴霧電離(ESI)源;正離子模式;全掃描范圍:m/z100～2 500;錐孔氣流速:50 L/h;錐孔電壓:60 V;離子源溫度:120 ℃;霧化氣流速:900 L/h;霧化氣溫度:500 ℃;毛細管電壓:2 500 V;采集模式:全信息串聯(lián)質譜(MSE)模式;碰撞能量:20～50 eV。

1.3 溶液配制

稱取替考拉寧20 mg,置于10 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,混勻,配制成質量濃度為2 mg/mL的替考拉寧溶液。

2 結果與討論

2.1 一維液相色譜分析

替考拉寧一維液相色譜圖中有26個峰(如圖2所示),根據(jù)《歐洲藥典》10.0中的相對保留時間及一級質譜結果,替考拉寧10個主要組分TA3-1、TA2-1a、TA2-1b、TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5、TA2-6a、TA2-6b的色譜保留時間分別為8.92、17.77、18.42、19.55、20.95、21.50、23.59、24.07、27.12、27.63 min,其他色譜峰均為雜質峰。

2.2 替考拉寧TA2-2裂解途徑推導

圖2 替考拉寧的一維液相色譜圖Fig.2 One-dimensional liquid chromatogram of teicoplanin 1.TA3-1;5.TA2-1a;6.TA2-1b;7.TA2-1;11.TA2-2;13.TA2-3;18.TA2-4;20.TA2-5;24.TA2-6a;25.TA2-6b;2,3,4,8,9,10,12,14,15,16,17,19,21,22,23,26.impurities.

圖3 TA2-2的二級質譜圖Fig.3 Secondary mass spectra of TA2-2

替考拉寧組分復雜,但其結構相似,在質譜中的裂解途徑基本一致,TA2-2是替考拉寧含量最多的組分,其結構已知,可以通過其二級質譜信息(如圖3所示)來推測替考拉寧其他組分及雜質的裂解方式,TA2-2可能的裂解方式見圖4。TA2-2組分(圖2中峰11,下文中峰號均與圖2中峰號相對應)的準分子離子峰m/z為1 878.5 643([M+H]+);TA2-2組分失去C5H6N2O4基團、R-氨基葡萄糖、甘露糖、N-乙酰葡萄糖后得到m/z為1 720.4 591、1 563.3 643、1 401.3 124、1 360.2 847的替考拉寧母核離子;m/z1 401.3 124的離子失去氨、N-乙酰葡萄糖后得到m/z為1 384.2 740、1 198.2 306的離子;m/z1 198.2 306的離子失去氨得到m/z為1 181.1 993的離子。R-氨基葡萄糖特征離子(m/z316.213 1)失水后得到m/z298.203 3的離子,再失去1分子水得到m/z280.193 9的離子,該烯醇式離子可以轉化成相應的酮式結構m/z為250.180 9。N-乙酰葡萄糖特征離子(m/z204.286 3)也會經(jīng)歷相同的失水過程得到m/z為186.075 4和168.068 0的離子。m/z186.075 4的離子失去N-乙?；退玫絤/z144.065 8的離子,再失去1分子水得到m/z126.057 0的離子。

2.3 替考拉寧雜質解析

替考拉寧各組分主要區(qū)別在于R-氨基葡萄糖與糖苷不同,但其裂解規(guī)律與主成分TA2-2的裂解規(guī)律一致,其次結合一維液相色譜的相對保留時間對主成分也可以準確定位。本實驗結合相對保留時間及二級質譜信息(主成分及雜質MS數(shù)據(jù)見表1)確認了《歐洲藥典》中的10個組分,并對其他22個雜質進行了裂解分析。

圖4 TA2-2的質譜裂解規(guī)律Fig.4 MS fragmentation pathway of TA2-2

峰2的準分子離子m/z為1 563.3 555 ([M+H]+),相對保留時間為0.51,推測分子式為C72H68Cl2N8O28,二級質譜信息與TA3-1基本一致,確認為TA3-1的同分異構體。

峰3的準分子離子m/z為1 360.2 870 ([M+H]+),相對保留時間為0.53,推測分子式為C64H55Cl2N7O23,二級質譜中未發(fā)現(xiàn)N-乙酰葡萄糖和R-氨基葡萄糖的相關離子,其他質譜信息與TA3-1基本一致,確認為TA3-1脫去N-乙酰葡萄糖的降解產(chǎn)物。

峰4的準分子離子m/z為1 874.5 238 ([M+H]+),相對保留時間為0.81,推測分子式為C88H93Cl2N9O33,其準分子離子m/z1 874.5 238比TA2-1準分子離子m/z1 876.5 498少2,m/z為312.181 3、294.169 1、276.161 5、246.146 7的離子均比TA2-1R-氨基葡萄糖的相關離子少2;m/z為204.086 3、186.075 4、168.068 0、144.065 8、126.057 0的離子與TA2-1中N-乙酰葡萄糖基團的相關離子基本一致,推測其R′分子式為C10H15O,確認為TA2-1在R′端脫去2H。

峰8有兩個組分,準分子離子m/z為1 673.4 567 ([M+H]+)和1 876.5 613 ([M+H]+),相對保留時間為0.96,其中m/z1 876.5 613的色譜峰二級質譜信息與TA2-1基本相同,確認為TA2-1同分異構體;準分子離子m/z為1 673.4 567的色譜峰二級質譜中未發(fā)現(xiàn)N-乙酰葡萄糖基團的相關離子,推測分子式為C80H82Cl2N8O28,其他二級質譜信息與TA2-1基本相同,確認為TA2-1脫去N-乙?；咸烟堑慕到猱a(chǎn)物。

峰9準分子離子m/z為1 878.5 585 ([M+H]+),相對保留時間為0.97,其二級質譜信息與TA2-2基本一致,根據(jù)相對保留時間確認為TA2-2同分異構體。

峰10的準分子離子m/z為2 040.6 152 ([M+H]+),相對保留時間為0.99,推測分子式C94H107Cl2N9O38,與TA2-2分子式相比多C6H10O5(甘露糖),其中m/z為1 883.5 231、1 725.4 077、1 563.3 669、1 546.3 328、1 522.3 447的離子與TA2-2二級質譜信息m/z為1 720.4 591、1 563.3 654、1 401.3 124、1 384.2 740、1 360.2 847的離子相比均多162(C6H10O5),其他二級質譜信息與TA2-2基本一致,結合相對保留時間確認為TA2-2加甘露糖。

表1 替考拉寧樣品中主成分及雜質的MS數(shù)據(jù)Table 1 MS data of principal components and impurities in teicoplanin

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

峰12有兩個組分,準分子離子m/z為2 040.6 152 ([M+H]+)和1 675.4 928 ([M+H]+),相對保留時間為1.01,其中m/z為2 040.6 152的色譜峰二級質譜信息與TA2-2加一分子甘露糖基本一致,根據(jù)相對保留時間確認為TA2-3加甘露糖;m/z為1 675.4 928的色譜峰二級質譜中未發(fā)現(xiàn)N-乙酰葡萄糖基團的相關離子,其他二級質譜信息與TA2-3基本相同,結合相對保留時間確認為TA2-3脫去N-乙酰葡萄糖的降解產(chǎn)物。

峰14有兩個組分,準分子離子m/z為1 878.5 706 ([M+H]+)和1 716.5 077 ([M+H]+),相對保留時間為1.04,m/z1 878.5 706的色譜峰二級質譜信息與TA2-2基本一致,根據(jù)相對保留時間確認為TA2-3同分異構體;m/z1 716.5 077的色譜峰推測分子式為C82H87Cl2N9O28,與TA2-2分子式相比少C6H10O5(甘露糖),其他二級質譜信息與TA2-2基本一致,結合相對保留時間確認為TA2-2脫去甘露糖的降解產(chǎn)物。

峰15有兩個組分,準分子離子m/z為1 716.5 150 ([M+H]+)和1 912.5 557 ([M+H]+),相對保留時間為1.07,其中m/z1 716.5 150的色譜峰二級質譜信息與TA2-2脫去甘露糖基本一致,根據(jù)相對保留時間確認為TA2-3脫去甘露糖的降解產(chǎn)物;m/z1 912.5 557的色譜峰推測分子式為C88H96Cl3N9O33,與TA2-2分子式相比多1個Cl,準分子離子m/z比TA2-2多34,m/z為1 435.2 800、1 418.2 363、1 394.2 437、1 232.1 987、1 215.1 553的離子均比TA2-2中相關離子多34,結合相對保留時間確認為TA2-2母環(huán)上的某個H被Cl取代,但取代位置還有待核磁技術去證明。

峰16有兩個組分,準分子離子m/z為1 844.6 136 ([M+H]+)和1 890.5 781 ([M+H]+),相對保留時間為1.10,其中m/z1 890.5 781的色譜峰推測分子式為C89H97Cl2N9O33,與TA2-4分子式相比少2H,m/z為328.211 2、310.203 8、292.193 8、262.182 5的離子均比TA2-4中R-氨基葡萄糖相關離子m/z少2,其他質譜信息與TA2-4基本一致,根據(jù)相對保留時間及二級質譜信息確認為TA2-4在R′端脫去2H;m/z1 844.6 136的色譜峰推測分子式為C88H98ClN9O33,與TA2-2分子式相比少1個Cl,m/z為1 367.3 529、1 326.3 231、1 164.2 623、1 147.2 397、1 129.2 288的離子均比TA2-2中相關離子m/z少34,結合相對保留時間確認為TA2-2母環(huán)上的某個Cl被H取代,但取代位置無法用質譜來證明。

峰17有兩個組分,準分子離子m/z為1 890.5 781 ([M+H]+)和2 054.6 470 ([M+H]+),相對保留時間為1.11,其中m/z1 890.5 781的色譜峰二級質譜與峰16(TA2-4在R′端脫2H)基本一致,根據(jù)相對保留時間確認為TA2-5在R′端脫2H;m/z2 054.6 470的色譜峰推測分子式為C95H109Cl2N9O38,與TA2-4分子式相比多C6H10O5(甘露糖),其中m/z為1 890.5 248、1 725.4 247、1 563.3 669、1 546.3 328、1 522.3 447的離子與TA2-4中相關離子相比m/z均多162(C6H10O5),其他二級質譜信息與TA2-4基本一致,結合相對保留時間確認為TA2-4加甘露糖。

峰19準分子離子m/z為2 054.6 284 ([M+H]+),相對保留時間為1.14,二級質譜信息與峰17(TA2-4加甘露糖)基本一致,結合相對保留時間確認為TA2-5加甘露糖。

峰21準分子離子m/z為1 892.5 801 ([M+H]+),相對保留時間為1.17,二級質譜信息與TA2-5基本一致,結合相對保留時間確認為TA2-5同分異構體。

峰22準分子離子m/z為1 730.5 262 ([M+H]+),相對保留時間為1.19,推測分子式為C83H89Cl2N9O28,與TA2-5分子式相比少C6H10O5(甘露糖),其他質譜信息與TA2-5基本一致,結合相對保留時間確認為TA2-5脫去甘露糖的降解產(chǎn)物。

峰23準分子離子m/z為1 976.6 354 ([M+H]+),相對保留時間為1.27,推測分子式為C94H107Cl2N9O34,與TA2-2分子式相比多C6H10O,m/z為126.053 2、144.066 7、168.063 8、186.076 6、204.087 6的離子與TA2-2中N-乙酰葡萄糖基團的相關離子基本一致,m/z為250.176 0、280.188 8、298.198 1、316.207 8的離子與TA2-2中R-氨基葡萄糖的相關離子基本一致,m/z1 918.5 934的離子比m/z1 976.6 354少58(C3H6O),m/z1 661.4 230的離子與TA2-2中m/z1 563.3 643的離子相比多98(C6H10O),m/z1 603.3 770的離子與TA2-2中m/z1 563.3 643的離子相比多40 (C3H4),結合相對保留時間及二級質譜信息確認為TA2-2/3母環(huán)上的2個H被丙醇和環(huán)丙烷取代,但取代位置還需制備純化雜質通過核磁精確鑒定。

峰26準分子離子m/z為1 918.5 992 ([M+H]+),相對保留時間為1.42,推測分子式為C91H101Cl2N9O33,與TA2-2分子式相比多C3H4,m/z為126.057 0、144.065 8、168.062 7、186.075 4、204.086 3的離子與TA2-2中N-乙酰葡萄糖基團的相關離子基本一致,m/z為250.180 9、280.187 1、298.203 3、316.213 1的離子與TA2-2中R-氨基葡萄糖的相關離子基本一致,m/z1 760.4 945的離子比TA2-2中m/z1 720.4 591的離子多40(C3H4),m/z1 441.3 494的離子比TA2-2中m/z1 401.3 124的離子多40(C3H4),結合相對保留時間及二級質譜信息確認為TA2-2/3母環(huán)上的1個H被環(huán)丙烷取代,但取代位置無法通過質譜確定。

3 結論

本研究建立了二維超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜對替考拉寧雜質的研究方法,對替考拉寧主成分及22個雜質進行了二級質譜分析,方法簡便、靈敏,有效地解決了流動相中含不揮發(fā)性鹽的色譜系統(tǒng)不適用于質譜快速鑒定雜質的難題。本研究新發(fā)現(xiàn)了3個雜質TA2-2加氯、TA2-2/3母環(huán)上的2個H被丙醇和環(huán)丙烷取代與TA2-2/3母環(huán)上的1個H被環(huán)丙烷取代;m/z為1 720.4 591、1 601.3 199的2個母核特征離子。研究結果為嚴格控制替考拉寧質量及替考拉寧工藝純化提供了一種新解決思路。

致謝:感謝沃特世科技(上海)有限公司楊青老師在實驗和解譜上的幫助與指導!