達(dá)肝素鈉和肝素鈉對(duì)小鼠毒性的比較

張 媛，納 濤，吳彥霖，游贛花，劉 倩，賀 慶，高 華

（中國(guó)食品藥品檢定研究院1.藥理室，2.細(xì)胞資源保藏研究中心，北京 100050；3.貴州食品藥品檢驗(yàn)所藥理室，貴州貴陽(yáng) 550004）

達(dá)肝素鈉和肝素鈉對(duì)小鼠毒性的比較

張 媛1，納 濤2，吳彥霖1，游贛花3，劉 倩1，賀 慶1，高 華1

（中國(guó)食品藥品檢定研究院1.藥理室，2.細(xì)胞資源保藏研究中心，北京 100050；3.貴州食品藥品檢驗(yàn)所藥理室，貴州貴陽(yáng) 550004）

目的 比較達(dá)肝素鈉和肝素鈉對(duì)小鼠毒性的差異。方法 采用半數(shù)致死量（LD50）法測(cè)定兩藥對(duì)小鼠的急性毒性，達(dá)肝素鈉設(shè)6個(gè)劑量組，最低劑量為2.54×105U·kg-1；肝素鈉設(shè)5個(gè)劑量組，最低劑量為2.05×105U·kg-1；劑量間距均為1.25；達(dá)肝素鈉和肝素鈉干預(yù)L-929細(xì)胞48 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），達(dá)肝素鈉設(shè)7個(gè)濃度，最低濃度為0.78×105U·L-1，肝素鈉設(shè)6個(gè)濃度，最低濃度為0.39×105U·L-1；劑量間距均為2；采用碘化丙啶染色用流式細(xì)胞儀對(duì)L-929細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果達(dá)肝素鈉和肝素鈉對(duì)小鼠的LD50分別為4.44×105和3.68×105U·kg-1；對(duì)L-929細(xì)胞的IC50分別為1.42×106和3.54×105U·L-1。L-929細(xì)胞經(jīng)達(dá)肝素鈉處理后，G2/M期細(xì)胞百分率增加137.6%（P＜0.01）；經(jīng)肝素鈉處理后，G0/G1期細(xì)胞百分率增加33.8%（P＜0.01）。結(jié)論 達(dá)肝素鈉對(duì)小鼠及L-929細(xì)胞的毒性均小于肝素鈉，達(dá)肝素鈉和肝素鈉對(duì)細(xì)胞周期的影響分別阻滯在G2/M期和G0/G1期。

達(dá)肝素鈉；肝素鈉；急性毒性；細(xì)胞毒性；細(xì)胞周期

普通天然肝素是從哺乳動(dòng)物腸黏膜或肺等組織中提取的硫酸氨基葡聚糖，由糖醛酸和葡糖胺的衍生物構(gòu)成的約32種二糖單位連接而成，屬于多糖類物質(zhì)。由于各種取代基的位置和數(shù)量不同，肝素的分子質(zhì)量大小不一，5～30 ku。因此，普通天然肝素又稱為未分級(jí)肝素［1］。未分級(jí)肝素于1916年被Mclean在肝組織中首次發(fā)現(xiàn)，自1935年開始作為抗凝血藥物應(yīng)用于臨床，至今已近一個(gè)世紀(jì)。但普通天然肝素存在一個(gè)主要缺陷，在用藥過多的情況下可致自發(fā)性出血，臨床應(yīng)用肝素注射液時(shí)，需監(jiān)測(cè)活化部分凝血活酶時(shí)間［2］。

低分子肝素是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種新型抗凝血藥物，是普通肝素的短鏈劑，由普通肝素經(jīng)物理、化學(xué)或生物方法將其分級(jí)或降解，得到的具有較低相對(duì)分子質(zhì)量的組分或片段，平均為3～8 ku。根據(jù)低分子肝素的來(lái)源、生產(chǎn)工藝和末端結(jié)構(gòu)的不同，歐洲藥典和美國(guó)藥典對(duì)低分子肝素進(jìn)行了分級(jí)，分為達(dá)肝素鈉（dalteparin sodium）、依諾肝素鈉（enoxaparin sodium）和那屈肝素鈣（nadroparincalcium）等，它們的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布、硫酸化程度和抗凝活性均不相同。其中，達(dá)肝素鈉是一種臨床廣泛使用的低分子肝素，系由豬腸黏膜制備的肝素鈉通過可控亞硝酸解聚作用而產(chǎn)生的低分子肝素鈉，平均為5.6～6.4 ku。達(dá)肝素鈉與普通肝素鈉相比具有更大的抗Ⅹa/抗Ⅱa值、更長(zhǎng)的半衰期和更高的生物利用度等優(yōu)勢(shì)，因而二者在藥理學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)等方面均存在一定的差異［3-4］。但目前國(guó)內(nèi)有關(guān)達(dá)肝素鈉的報(bào)道更多地集中在藥效學(xué)，對(duì)二者的毒性比較研究未見報(bào)道。本研究將通過體內(nèi)外方法對(duì)達(dá)肝素鈉和普通肝素鈉的毒性進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞、試劑和主要儀器

SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2009-0017。小鼠飼養(yǎng)于該研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境許可證號(hào)：SYXK（京）2011-0008，自然照明，12 h晝夜交替，溫度為22～24℃，濕度為45%～60%，自由進(jìn)食飲水。本研究所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作均參照《中國(guó)食品藥品檢定研究院動(dòng)物倫理法規(guī)》進(jìn)行。L-929小鼠成纖維細(xì)胞，購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物寄存庫(kù)（ATCC）。

達(dá)肝素鈉和肝素鈉由國(guó)內(nèi)A廠家（因涉及廠家利益，此處隱去廠家名稱，以A代號(hào)代替）提供，效價(jià)分別為1.38×105和2.02×105U·g-1；CCK-8試劑盒，北京盛世前塵生物科技有限公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶-EDTA，美國(guó)Gibco公司；PBS，美國(guó)Hyclone公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）和RNA酶A，美國(guó)Sigma公司。FACS Calibur流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；3141CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；synergy HT酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTeK公司；CX41-32C02倒置顯微鏡，日本Olympus公司；AE240電子分析天平，瑞士Mettler公司；HFF-584電子天平，日本Tanita公司。

1.2 半數(shù)致死量法測(cè)定達(dá)肝素鈉和肝素鈉對(duì)小鼠的急性毒性

小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分6～7組，每個(gè)劑量組10只，雌雄各半。達(dá)肝素鈉設(shè)6個(gè)劑量組，最低劑量為2.54×105U·kg-1，劑量間距為1.25；肝素鈉設(shè)5個(gè)劑量組，最低劑量為2.05×105U·kg-1，劑量間距為1.25。正常對(duì)照組iv給予相應(yīng)體積0.9%氯化鈉溶液。達(dá)肝素鈉和肝素鈉組單次靜脈注射給藥，給藥體積為20mL·kg-1。采用概率單位法（Bliss法）計(jì)算LD50［5-6］。

各組小鼠靜脈注射受試物后4 h內(nèi)嚴(yán)密觀察小鼠毒性反應(yīng)和死亡情況，每天上、下午各觀察1次，連續(xù)觀察14 d。觀察指標(biāo)包括小鼠外觀、行為、分泌物、排泄物和死亡情況等。給藥前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束活殺小鼠前各稱重1次，記錄小鼠體質(zhì)量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有小鼠經(jīng)吸入CO2活殺，進(jìn)行大體解剖［7-8］。

1.3 CCK-8法測(cè)定L-929細(xì)胞存活及IC50的計(jì)算

達(dá)肝素鈉設(shè)7個(gè)濃度，最低濃度為0.78× 105U·L-1，劑量間距為2.0；肝素鈉設(shè)6個(gè)濃度，最低濃度為0.39×105U·L-1，劑量間距為2.0。將生長(zhǎng)旺盛的L-929細(xì)胞消化后，調(diào)至1.5×107L-1細(xì)胞，接種到96孔板，每孔200 μL，置于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后，棄去原培養(yǎng)基，加入含各濃度受試物（達(dá)肝素鈉：0.78×105，1.56×105，3.12×105，6.25× 105，1.25×106，2.50×106和5.00×106U·L-1；肝素鈉：0.39×105，0.78×105，1.56×105，3.12×105和6.25×105，1.25×106U·L-1）的培養(yǎng)基200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL CCK-8溶液，37℃孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔吸光度（absor?bance，A），計(jì)算細(xì)胞存活率。計(jì)算公式如下：細(xì)胞存活率（%）=給藥組A450nm/正常對(duì)照組A450nm×100%，重復(fù)4次。采用Bliss法計(jì)算兩種受試物的IC50［5-6］。

1.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期

生長(zhǎng)旺盛的L-929細(xì)胞消化后，接種于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后，棄去原培養(yǎng)基，加入含達(dá)肝素鈉（5.00×106U·L-1）或肝素鈉（1.25×106U·L-1）的1640培養(yǎng)基，正常對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，逐滴加入無(wú)水乙醇固定細(xì)胞，置于-20℃過夜。細(xì)胞固定后，750×g離心5 min，棄上清，揮發(fā)乙醇。加入300 mL PBS重懸細(xì)胞，加入15 mL RNA酶A，使其終濃度為1 g·L-1，置37°C水浴鍋中孵育1 h。最后加入200 mL PBS，混勻后加入PI 0.5 mL，使其終濃度為50 mg·L-1，30 min內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)均使用SAS軟件計(jì)算LD50和IC50；細(xì)胞毒性試驗(yàn)IC50采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，采用方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 達(dá)肝素鈉和肝素鈉對(duì)小鼠的急性毒性

如表1所示，分別給予相應(yīng)劑量肝素鈉和達(dá)肝素鈉后，各組小鼠均出現(xiàn)相似的毒性反應(yīng)，包括豎毛、震顫、呼吸急促、自主活動(dòng)減少、翻正反射消失、二便失禁、抽搐和部分小鼠死亡。給予肝素鈉或達(dá)肝素鈉后，小鼠死亡的發(fā)生可持續(xù)至給藥后4～5 d。死亡小鼠經(jīng)大體解剖檢查，可見胸腔和/或腹腔出血。存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束的各組小鼠體質(zhì)量無(wú)顯著性差異；大體解剖肉眼未見異常。Bliss法計(jì)算半數(shù)致死量（LD50），達(dá)肝素鈉為4.44×105U·kg-1（3.22 g·kg-1），肝素鈉3.68×105U·kg-1（1.82 g·kg-1），表明達(dá)肝素鈉的小鼠體內(nèi)毒性小于肝素鈉。

Tab.1 LD50of dalteparin sodium and heparin sodium in mice

2.2 達(dá)肝素鈉和肝素鈉對(duì)L-929細(xì)胞存活的影響

各濃度達(dá)肝素鈉和肝素鈉處理L-929細(xì)胞48h后的細(xì)胞存活率如圖1所示，經(jīng)Bliss法計(jì)算，達(dá)肝素鈉和肝素鈉對(duì)L-929細(xì)胞的IC50分別為1.42×106U·L-1和3.54×105U·L-1，達(dá)肝素鈉處理細(xì)胞的IC50顯著高于肝素鈉（P＜0.01）。提示達(dá)肝素鈉對(duì)L-929的細(xì)胞毒性低于達(dá)肝素鈉。

Fig.1 Effect of dalteparin sodium and heparin sodium on survival rate of L-929 cells.L-929 cells were treated with dalteparin sodium or heparin sodium for 48 h.±s，n=4.

2.3 達(dá)肝素鈉和肝素鈉對(duì)L-929細(xì)胞周期分布的影響

PI染色法測(cè)定細(xì)胞周期結(jié)果（表2）表明，與正常對(duì)照組比較，達(dá)肝素鈉作用于L-929細(xì)胞后，G2/M期細(xì)胞百分率增加137.6%（P＜0.01），G0/G1期及S期細(xì)胞百分率分別減少49.9%（P＜0.01）和15.1%（P＜0.05）。肝素鈉作用于L-929細(xì)胞后，G0/G1期百分率較正常對(duì)照組增加33.8%（P＜0.01），S期及G2/M期細(xì)胞百分率分別減少21.5%（P＜0.01）和27.3%（P＜0.01）。

Tab.2 Effect of dalteparin sodium and heparin sodium on percentage of cells at different cycle phases of L-929 cells detected by PI flow cytometry

3 討論

體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，達(dá)肝素鈉的毒性小于肝素鈉。急性毒性實(shí)驗(yàn)死亡小鼠經(jīng)大體解剖可見胸腔和腹腔出血。因而，推測(cè)達(dá)肝素鈉的低毒性與其降低出血風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。達(dá)肝素鈉與肝素鈉毒性比較結(jié)果及其可能原因，均與預(yù)期一致，亦符合其藥物特性。

兩藥處理小鼠成纖維細(xì)胞L-929結(jié)果顯示，達(dá)肝素鈉的IC50顯著高于肝素鈉，表明達(dá)肝素鈉的體外細(xì)胞毒性低于肝素鈉，與體內(nèi)急性毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。細(xì)胞的存活是通過細(xì)胞周期的運(yùn)行來(lái)實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞周期包括G0/G1期（細(xì)胞分裂間期/DNA合成前期）、S期（DNA合成期）及G2/M期（DNA合成后期/分裂期）；G0/G1期細(xì)胞比例主要反映處于分裂間期的細(xì)胞，S期和G2/M期細(xì)胞比例主要反映處于分裂增殖期的細(xì)胞。流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，兩藥均對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生影響。達(dá)肝素鈉干預(yù)L-929細(xì)胞后，G2/M期細(xì)胞顯著增多，G0/G1期及S期細(xì)胞均不同程度減少，表明達(dá)肝素鈉將細(xì)胞阻滯于G2/M期；肝素鈉干預(yù)L-929細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞顯著增多，表明肝素鈉將細(xì)胞阻滯于G0/G1期；二者通過影響細(xì)胞周期的不同階段阻止了細(xì)胞的正常分裂過程。分析其原因可能與它們的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞半衰期及生物利用度的差異有關(guān)，但仍需進(jìn)一步探討。

雖然，普通肝素在臨床使用已＞50年，但由于可導(dǎo)致自發(fā)性出血這一嚴(yán)重缺陷，臨床應(yīng)用受到限制。由于達(dá)肝素鈉相對(duì)普通肝素而言具有更高抗Ⅹa和抗Ⅱa活性比，抗血栓作用較強(qiáng)、抗凝作用較弱，因而臨床使用達(dá)肝素鈉可減少潛在出血及誘發(fā)血小板減少癥的風(fēng)險(xiǎn)，因而其臨床應(yīng)用日益增多，且更為安全有效［3，9-10］。本研究通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)兩藥的毒性進(jìn)行比較，為了解毒性提供參考，亦可為達(dá)肝素鈉的臨床安全用藥提供毒理學(xué)理論依據(jù)。

［1］Ji SL，Sang Q，Zhang TM.The research progress in heparin source，control，structure analysis and relationship between structure and biological activity［J］.Chin Pharm J（中國(guó)藥學(xué)雜志），2012，47（9）：660-663.

［2］Xiong LH.Low molecular weight heparin technology platform，varieties and market prospect［J］.Mod Bus Trade Ind（現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)），2012，24：235-236.

［3］Pei F.Clinical application of low molecular weight heparin［J］.Clin Medication J（臨床藥物治療雜志），2009，7（4）：40-44.

［4］Li J，Wang Y，Li YY，F(xiàn)an HH.Quality specification study of low molecular weight heparin［J］.Chin Pharm J（中國(guó)藥學(xué)雜志），2014，49（24）：2210-2218.

［5］Zhou HJ，Shen YR，Li JS.Statistical methods for biological assays［M］//Zhou HJ.Biological Assays for Drug（藥品生物檢定）.Beijing：People′s Medical Publishing House，2005：148-151.

［6］Tan DJ，Liu T，Qin L，Hu JT.Calculation of 50% reaction dosage and effect comparison［M］//Tan DJ，Ma SC.Statistic Applications in Biopharma?ceutical Regulatory Science（藥品監(jiān)督與檢定中的統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)用）.Beijing：China Science and Technol?ogy Press，2011：420-435.

［7］Zhao P，Xu J，Chen XB，Huang HL.Acute toxicity of（E）-4-（2-（4-chlorophenoxy）-2-methylpropanoyloxy）-3-methoxyphenyl acrylic acid in mice and longterm toxicity in rats［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志），2011，25（4）：391-396.

［8］Lou XW，Luan Y，Jiang BH，Chen XY，Zhong DF. Acute toxicity of sodium houttuyfonate in BALB/c mice and its injury to cells［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志），2012，26（5）：653-657.

［9］ Zhang Z.The structural characterization of low molecular weight heparin［J］.Chin J new drug（中國(guó)新藥雜志），2014，23（8）：901-905.

［10］ Sang Q，Cui HF，Ji SL.Research progress in heparin anticoagulants optimizing［J］.ChinJ Biochem Pharm（中國(guó)生化藥物雜志），2012，33（2）：188-191.

Comparison of toxicity of dalteparin sodium and heparin sodium of mice in vivo and in vitro

ZHANG Yuan1，NA Tao2，WU Yan-lin1，YOU Gan-hua3，LIU Qian1，HE Qing1，GAO Hua1
（1.Pharmacology Division，2.Cell Collection and Research Center，National Institute for Food and Drug Control，Beijing 100050，China；3.Pharmacology Division，Guizhou Institute for Food and Drug Control，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE To investigate the toxicity of dalteparin sodium and heparin sodiumin vitroandin vivo.METHODS The median lethal dose（LD50）of these two drugs in mice was determined.The proliferation activity of L-929 cells treated with dalteparin sodium（0.78×105-5.00×106U·L-1）or heparin sodium（0.39×105-1.25×106U·L-1）for 48 h was detected by CCK8 kit.The half maximal inhibitory concen?tration（IC50）of L-929 cells was calculated.The cell cycle was analyzed by flow cytometry.RESULTS LD50of mice with acute toxicity induced by dalteparin sodium or heparin sodium was 4.44×105and 3.68× 105U·kg-1，respectively.IC50of L-929 cells treated with them was 1.42×106and 3.54×105U·L-1，respec?tively.The percentage of G2/M-phase（137.6%，P＜0.01）and G0/G1-phase（33.8%，P＜0.01）cells was significantly increased after the treatment with dalteparin sodium or heparin sodium.CONCLUSION The toxicity of dalteparin sodiumin vivoandin vitrois not so strong as that of heparin sodium.Dalteparin sodium and heparin sodium arrest L-929 cells at G2/M-phase and G0/G1-phase，respectively.

dalteparin sodium；heparin sodium；acute toxicity；cytotoxicity；cell cycle

GAO Hua，E-mail：huag55@163.com，Tel：（010）67095231，F(xiàn)ax：（010）67058426

R99

A

1000-3002-（2016）11-1172-04

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.11.007

2015-07-22接受日期：2016-06-17）

（本文編輯：賀云霞）

張 媛，女，副研究員，藥理學(xué)碩士，主要從事藥檢和藥理學(xué)研究。

高 華，E-mail：huag55@163.com，Tel：（010）67095231，F(xiàn)ax：（010）67058426