三種信號通路抑制劑兩兩聯(lián)合用藥對胰腺癌細(xì)胞Panc-28和Panc-1增殖的影響

萬 君，盧銀忠，鄭 軍，吳 方，鄭衛(wèi)紅

（1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國家中藥藥理科研三級實驗室，湖北宜昌 443002；2.上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200240）

三種信號通路抑制劑兩兩聯(lián)合用藥對胰腺癌細(xì)胞Panc-28和Panc-1增殖的影響

萬 君1，2，盧銀忠2，鄭 軍1，吳 方2，鄭衛(wèi)紅1

（1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國家中藥藥理科研三級實驗室，湖北宜昌 443002；2.上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200240）

目的 選用表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑厄洛替尼、Anexelekto（AXL）抑制劑R428和γ-分泌酶抑制劑（2S）-N-N-（3，5-二氟苯乙?；?L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT），觀察兩兩聯(lián)合用藥對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響，為指導(dǎo)臨床用藥提供參考。方法 采用Panc-28和Panc-1胰腺癌細(xì)胞，厄洛替尼、R428和DAPT單用或兩兩聯(lián)用72 h，MTS法檢測細(xì)胞增殖率，乳酸脫氫酶（LDH）法檢測細(xì)胞毒性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。結(jié)果 用厄洛替尼5～80 μmol·L-1對Panc-28細(xì)胞增殖無明顯影響，DAPT 5～80 μmol·L-1或R428 50～800 nmol·L-1作用72 h可使Panc-28細(xì)胞增殖率呈濃度依賴性降低（rDAPT=0.995，P＜0.01；rR428=0.833，P＜0.01），最大下降約40%。厄洛替尼50 μmol·L-1，DAPT 50 μmol·L-1或R428 300 nmol·L-1分別兩兩聯(lián)用后，與單用相比均未明顯增加細(xì)胞毒性，厄洛替尼與R428聯(lián)用使胰腺癌細(xì)胞增殖率較R428單用下降＞40%（P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，厄洛替尼與R428聯(lián)用分別使Panc-28和Panc-1細(xì)胞S期和G1期增加（P＜0.01）。結(jié)論 DAPT和R428能一定程度地抑制胰腺癌細(xì)胞Panc-28和Panc-1增殖。厄洛替尼與R428聯(lián)用具有協(xié)同抑制Panc-28和Panc-1細(xì)胞增殖的作用，對細(xì)胞分裂間期阻滯更為明顯。

胰腺癌；厄洛替尼；R428；細(xì)胞增殖；細(xì)胞毒性；細(xì)胞周期

胰腺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)疾病之一［1］。盡管新型輔助療法和化療方案已取得一定療效，但胰腺切除依然是目前治愈胰腺癌最常用的方法［2］。即便是胰腺切除成功的癌癥患者，依然會有高達(dá)70%的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率。因此，在診斷期內(nèi)對多數(shù)患者而言，胰腺癌是一種系統(tǒng)性疾病，輔助化療對胰腺切除患者顯得尤為重要。據(jù)報道，輔助化療能使10%胰腺癌患者存活時間明顯延長［3］。在輔助化療中，靶向藥物治療是最廣泛也是最基本的治療方法之一。因此，尋找新型的靶向藥物以提高胰腺癌對化療藥物的敏感性已成為目前研究的重點和熱點。

研究表明，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和 Anexelekto（AXL）受體等對腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移以及黏附發(fā)揮著重要作用［4-5］。Notch信號通路作為跨膜蛋白，對腫瘤細(xì)胞的正常代謝亦發(fā)揮著重要作用。最近有研究報道，Notch通路激活與胰腺癌治療失敗密切相關(guān)［6］。在胰腺癌細(xì)胞Panc-28和Panc-1中，以上3種蛋白均有不同程度的表達(dá)，并發(fā)揮著相關(guān)作用，共同維持腫瘤細(xì)胞的活性。作為已知的EGFR抑制劑，厄洛替尼（erlotinib）已廣泛運用于癌癥的治療并取得了一定的治療效果［7］。臨床前研究表明，AXL受體在胰腺癌中高表達(dá)，抑制其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖［8］。R428是選擇性較好的AXL受體抑制劑，在乳腺癌小鼠模型中可阻止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并影響模型小鼠的新陳代謝［9］。（2S）-N-N-（3，5-二氟苯乙?；?L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯｛N-〔N-（3，5-difluorophenacetyl）-l-alanyl〕-S-phenylg?lycine t-butyl ester，DAPT｝是已知的γ-分泌酶抑制劑，可通過抑制γ-分泌酶活性而阻斷Notch信號通路，進(jìn)而影響胰腺癌細(xì)胞增殖［10］。藥物聯(lián)合用藥在癌癥治療中發(fā)揮著極其重要的作用。研究顯示，在Ⅱ期臨床試驗中，西妥昔單抗（cetuximab）與厄洛替尼聯(lián)用對結(jié)腸癌具有較好的抑制效果［11］，培美曲塞（pemetrexed）與厄洛替尼聯(lián)用對臨床Ⅱ期EGFR突變的非鱗狀非小細(xì)胞肺癌的治療具有協(xié)同效應(yīng)［12］。在治療胰腺癌的過程中，許多藥物單用并未達(dá)到預(yù)期的治療效果，故應(yīng)觀察多靶點聯(lián)用是否會達(dá)到滿意的效果。EGFR，AXL以及Notch信號通路被認(rèn)為是胰腺癌的藥物靶點。本研究以EGFR、AXL和Notch受體相關(guān)的信號通路為主要研究對象，通過阻斷相應(yīng)的受體或通路，觀察對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。本研究分別采用EGFR抑制劑厄洛替尼，AXL受體抑制劑R428和γ-分泌酶抑制劑DAPT單用或聯(lián)用，通過阻斷相應(yīng)的信號通路，觀察其對胰腺癌細(xì)胞Panc-28和Panc-1增殖、細(xì)胞毒性和細(xì)胞周期的影響，初步闡明其可能的作用機(jī)制，為胰腺癌的化療及聯(lián)合用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、試劑和儀器

人胰腺癌細(xì)胞Panc-28由中國科學(xué)院海洋研究所林秀坤研究員饋贈，Panc-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。厄洛替尼購自美國Cayman Chemical公司，DAPT和R428購自美國Selleck公司。碘化丙啶和二甲亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司，CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒購自美國Promega公司，多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和離心機(jī)購自美國Thermo公司，恒溫水槽購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司，流式細(xì)胞分選儀購自美國Beckman公司。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)

從液氮中分別取出Panc-28和Panc-1細(xì)胞凍存管，迅速置入37℃水浴鍋中，使其在短時間內(nèi)完全解凍，并在無菌條件下取出細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，100×g離心5 min，棄上層液，加入適量含1%青霉素和鏈霉素雙抗及10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，并接種到培養(yǎng)皿中，搖勻后在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。次日觀察細(xì)胞貼壁情況，并及時更換培養(yǎng)液，細(xì)胞傳3代以上進(jìn)行實驗。

1.3 MTS法檢測藥物單用對Panc-28細(xì)胞增殖的影響

用DMSO配置厄洛替尼、DAPT及R428貯存液，實驗時稀釋至需要濃度加入培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別用胰蛋白酶消化3～4 min后加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，以100×g離心5 min，棄上清，用無菌的PBS洗2遍后再用全DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取10 μL細(xì)胞懸液計數(shù)并稀釋，按每孔3.5×103個細(xì)胞分別將Panc-28細(xì)胞接種到96孔板中，每孔加培養(yǎng)基100 μL。細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，加入含有終濃度為5～80 μmol·L-1的厄洛替尼、終濃度為5～80 μmol·L-1的DAPT和終濃度為50～800 nmol·L-1的R428培養(yǎng)基（每孔100 μL）。R428針對AXL受體體外純酶的IC50約為14 nmol·L-1，故本實驗中采用納摩爾級的給藥濃度。每濃度設(shè)3復(fù)孔。同時設(shè)細(xì)胞對照組及僅含DMEM培養(yǎng)基的空白組。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL MTS，輕輕晃勻后在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育1 h。取出96孔板，避光搖勻10 s，用酶標(biāo)儀于490 nm波長下檢測每孔的吸光度（A490nm）值，計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率（%）=（實驗組A490nm-空白組A490nm）/（對照組A490nm-空白組A490nm）×100%。

1.4 MTS法檢測聯(lián)合用藥對Panc-28和Panc-1細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)厄洛替尼、DAPT和R428對Panc-28細(xì)胞的抑制作用，選取能抑制細(xì)胞增殖濃度的40%的抑制劑兩兩聯(lián)用，觀察上述3種抑制劑兩兩聯(lián)用對Panc-28和Panc-1細(xì)胞增殖的影響。由于Panc-28易對厄洛替尼產(chǎn)生耐藥，實驗中選其濃度為50 μmol·L-1；R428在200和400 nmol·L-1濃度下抑制效果無顯著差異，實驗中選取300 nmol·L-1；DAPT作用效果明顯，選取與厄洛替尼相同的濃度即50 μmol·L-1。Panc-28和Panc-1細(xì)胞雖然均為胰腺癌細(xì)胞，兩者對3種抑制劑的敏感性可能存在差異，但本研究的重點是探索聯(lián)合給藥策略，故Panc-1細(xì)胞的給藥濃度同Panc-28細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng)同1.3。Panc-28和Panc-1細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，分為細(xì)胞對照組、DMSO溶劑對照組、厄洛替尼50 μmol·L-1、DAPT 300 nmol·L-1和R428 50 μmol·L-1單用及同濃度兩兩聯(lián)用組，每組3復(fù)孔。藥物處理組分別加入含有相應(yīng)濃度厄洛替尼、DAPT和（或）R428的培養(yǎng)基（每孔100 μL）。細(xì)胞對照組和DMSO溶劑對照用等體積培養(yǎng)基代替藥物。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，同1.3方法用酶標(biāo)儀于490 nm波長下檢測每孔A490nm值，計算細(xì)胞增殖率。

1.5 LDH酶活性法檢測聯(lián)合用藥對Panc-28和Panc-1細(xì)胞的細(xì)胞毒性

細(xì)胞處理、分組和給藥同1.4。給藥72 h后，取50 μL培養(yǎng)基于黑色96孔板中，室溫靜置20～30 min，使培養(yǎng)基溫度達(dá)到室溫。每孔加入LDH檢測試劑盒中提供的底物50 μL，搖晃10 s。室溫反應(yīng)10 min后加25 μL終止液終止反應(yīng)。在激發(fā)光波長540 nm、發(fā)射光波長590 nm條件下，用酶標(biāo)儀讀取熒光強(qiáng)度。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測聯(lián)合用藥對Panc-28和Panc-1細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞處理、分組和給藥同1.4。按1×109L-1細(xì)胞密度、每孔2 mL接種于6孔板內(nèi)，給藥處理48 h后收集細(xì)胞。于4℃條件下用70%乙醇將細(xì)胞樣本固定2 h或過夜。用碘化丙錠染色液在37℃、避光條件下將細(xì)胞染色30 min后立即上機(jī)檢測。每個樣本收集細(xì)胞數(shù)量2×104，用流式細(xì)胞儀信息采集系統(tǒng)記錄數(shù)據(jù)，并借助FACSDiva軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 厄洛替尼、DAPT和R428聯(lián)合用藥濃度的確定

厄洛替尼5～80 μmol·L-1作用72 h后，Panc-28細(xì)胞增殖率與細(xì)胞對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（圖1A），表明在所測定的濃度范圍內(nèi)厄洛替尼對Panc-28細(xì)胞增殖無明顯影響。

DAPT 5～80 μmol·L-1作用72 h后，Panc-28細(xì)胞增殖率隨DAPT濃度的升高而降低，呈濃度依賴性（r=0.995，P＜0.01）（圖1B）。與細(xì)胞對照組相比，DAPT 5 μmol·L-1時Panc-28細(xì)胞增殖率下降20%；當(dāng)濃度增加到80 μmol·L-1時，細(xì)胞增殖率降低至58%（下降約40%）。表明DAPT能抑制Panc-28細(xì)胞增殖。

R428 100 nmol·L-1作用72 h，Panc-28細(xì)胞增殖率降低約10%；濃度增加到800 nmol·L-1時細(xì)胞增殖率下降約40%（圖1C），表明R428同樣能抑制Panc-28細(xì)胞增殖。

2.2 厄洛替尼、DAPT及R428兩兩聯(lián)用對Panc-28和Panc-1細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)厄洛替尼、DAPT及R428單獨給藥的實驗結(jié)果，選取能抑制胰腺癌細(xì)胞生長的合適濃度，采用兩種抑制劑聯(lián)合用藥方式觀察對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。由于厄洛替尼的溶解性較低且對Panc-28細(xì)胞增殖的抑制不明顯，故實驗選取其最大溶解濃度50 μmol·L-1。DAPT及R428選取單獨給藥抑制Panc-28細(xì)胞增殖率30%～40%的濃度。

Fig 1.Effect of erlotinib（A），N-〔N-（3，5-difluorophen?acetyl）-l-alanyl〕-S-phenylglycine t-butyl ester（DAPT）（B）and R428（C）for 72 h on proliferation of Panc-28 cells detected by MTS method.Cell viability（%）=（experi?mental groupA490nm-blank groupA490nm）/（control groupA490nm-blank groupA490nm）×100%.±s，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with cell control（0）group.

由圖2結(jié)果可見，與細(xì)胞對照組相比，厄洛替尼和DAPT聯(lián)用、或和R428聯(lián)用及DAPT和R428聯(lián)用均能抑制Panc-28和Panc-1細(xì)胞增殖（P＜0.001）。厄洛替尼和DAPT聯(lián)用與DAPT單用相比，細(xì)胞增殖率明顯變化，表明厄洛替尼和DAPT聯(lián)用的抑制作用主要來自于DAPT。盡管DAPT和R428聯(lián)用與R428單用相比，對胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)（細(xì)胞增殖率下降約40%），但與DAPT單用相比無明顯差異，提示兩藥合用無協(xié)同作用，藥物的作用主要來自DAPT。厄洛替尼和R428聯(lián)用后，與厄洛替尼或R428單用相比，胰腺癌細(xì)胞增殖率均明顯下降（P＜0.01），較R428單用下降＞40%，顯示出良好的聯(lián)用效果。

2.3 厄洛替尼、DAPT及R428兩兩聯(lián)合用藥對Panc-28和Panc-1細(xì)胞的毒性

Fig.2 Effect of combination of inhibitors on proliferation of Panc-28(A)and Panc-1(B)cells detected by MTS method. Panc-28 and Panc-1 cells were treated with erlotinib（50 μmol·L-1），DAPT（50 μmol·L-1）and R428（300 nmol·L-1）for 72 h，respectively.±s，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with control group；##P＜0.01，compared with erlotinib alone group；ΔΔP＜0.01，compared with R428 alone group.

Fig.3 Cytotoxicities of combination of inhibitors for Panc-28(A)and Panc-1(B)cells detected by LDH activity assay.See Fig.2 for the cell treatment.LDH activity of control group was taken as 100%.±s，n=3.

為了觀察上述抑制劑是否通過引起細(xì)胞壞死而降低細(xì)胞增殖率，用LDH活性法測定其細(xì)胞毒性。如圖3所示，厄洛替尼、DAPT及R428單用或聯(lián)用對Panc-28和Panc-1細(xì)胞無明顯毒性，LDH活性變化＜10%。提示其降低Panc-28和Panc-1細(xì)胞增殖率并非由于導(dǎo)致細(xì)胞壞死所致。

2.4 厄洛替尼、DAPT及R428兩兩聯(lián)用對Panc-28和Panc-1細(xì)胞周期的影響

由圖4可見，Panc-28細(xì)胞經(jīng)R428單獨處理48 h后，與細(xì)胞對照組相比，S期細(xì)胞百分比升高（P＜0.01）。R428聯(lián)合厄洛替尼或DAPT處理48 h，S期百分比與單用相比明顯增加（P＜0.01）。表明Panc-28細(xì)胞S期細(xì)胞增多，細(xì)胞周期阻滯在S期，細(xì)胞增殖減慢。厄洛替尼與DAPT聯(lián)用組與單用組相比，各期細(xì)胞百分比均無明顯變化。

Fig.4 Effect of combination of inhibitors on Panc-28 cell cycle detected by flow cytomtry.Panc-28 cells were treat?ed with erlotinib,DAPT and R428 for 48 h,respectively.±s，n=3.**P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with erlotinib alone group；△△P＜0.01，compared with R428 alone group；▲▲P＜0.01，compared with DAPT alone group.

Fig.5 Effect of combination of inhibitors on Panc-1 cell cycle detected by flow cytometry.Panc-1 cells were treated with erlotinib，DAPT and R428 for 48 h，respectively.±s，n=3.**P＜0.01，compared with control group；##P＜0.01，compared with erlo?tinib alone group；△△P＜0.01,compared with R428 alone group；▲▲P＜0.01，compared with DAPT alone group.

由圖5可見，Panc-1細(xì)胞給藥刺激48 h后，R428和DAPT單用組G1期細(xì)胞百分比與細(xì)胞對照組相比明顯增加（P＜0.01）；R428與厄洛替尼和DAPT聯(lián)用組與R428單用組相比，G1期細(xì)胞百分比進(jìn)一步增加（P＜0.01）。厄洛替尼單用作用不明顯。表明聯(lián)用對Panc-1細(xì)胞有G1期阻滯作用。各組G2期和S期細(xì)胞百分比無明顯變化。

3 討論

厄洛替尼作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑廣泛用于非小細(xì)胞肺癌的治療，但隨著病情的惡化易產(chǎn)生耐藥性［14］。本研究結(jié)果表明，厄洛替尼單用后，Panc-28細(xì)胞增殖率并無明顯變化，提示EGFR抑制劑厄洛替尼在本研究濃度范圍不能抑制Panc-28胰腺癌細(xì)胞增殖。盡管過表達(dá)的EGFR信號通路被證實參與了癌細(xì)胞的增殖、遷移、血管生成及新陳代謝［15］，但僅阻斷EGFR對胰腺癌Panc-28細(xì)胞的增殖作用有限。因為細(xì)胞可通過磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphaty-dylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）、Ras/ Raf/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）及Janus激酶/信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）途徑激活EGFR下游信號通路，使細(xì)胞繞過正常的EGFR調(diào)節(jié)而增殖。PI3K/AKT信號通路是介導(dǎo)多種生長因子促細(xì)胞增殖的主要通路。研究發(fā)現(xiàn)，約61%胰腺癌K-Ras發(fā)生了突變，從而導(dǎo)致依賴于EGFR的PI3K/AKT和 MEK/ERK下游信號的激活［16-17］。因此，可能需要阻斷EGFR及其他通路介導(dǎo)的PI3K/AKT等下游信號才能有效抑制Panc-28細(xì)胞增殖。

AXL受體是酪氨酸激酶家族成員之一。AXL信號能刺激細(xì)胞反應(yīng)，包括PI3K/AKT的活化、促分裂原活化蛋白激酶ERK和P38的活化以及NF-κB通路、STAT信導(dǎo)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄的活化［18］。此外，AXL信號通路還與癌細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖、血管生成、對化療藥物和靶向藥物的抵抗以及細(xì)胞增殖等生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)［19］，并在胰腺導(dǎo)管腺癌中得到證實［20］。本研究結(jié)果表明，單用AXL受體抑制劑R428能濃度依賴性地抑制Panc-28細(xì)胞增殖。最近研究結(jié)果顯示，AXL通過激活EGFR/PKC/mTOR通路從而介導(dǎo)PI3Ka抑制劑在食管鱗癌的耐藥性［21］。在多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，R428也被證實能選擇性地抑制AXL的活性及其下游信號［22］。因此，EGFR和AXL信號通路抑制劑的聯(lián)用可以阻斷腫瘤細(xì)胞的核心信號通路PI3K/AKT等，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。本研究結(jié)果也表明，厄洛替尼與R428聯(lián)用可使Panc-28和Panc-1細(xì)胞周期阻滯于S期或G1期，協(xié)同性地增強(qiáng)對胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制，較單用的抑制率提高約40%。

盡管確切的機(jī)制尚不清楚，但Notch信號通路的活化被認(rèn)為是引起胰腺癌發(fā)生的重要因素［23］。Notch信號通路再激活參與了胰腺導(dǎo)管腺癌的起始、發(fā)展和維持［24］。據(jù)報道，通過γ-分泌酶抑制劑或Hes1小發(fā)夾RNA（shRNA）抑制胰腺癌細(xì)胞中Notch的表達(dá)可減少瘤體積和腫瘤干細(xì)胞的百分比；相反，通過增加外源Notch配體等方法激活Notch，可增加腫瘤干細(xì)胞的百分比及實體瘤的形成［25］。Notch作為γ-分泌酶的底物能被該酶識別并剪切，產(chǎn)生Notch受體細(xì)胞內(nèi)域（Notch receptor intracellular domain）而發(fā)揮相應(yīng)的功能。因此，γ-分泌酶是影響Notch代謝的關(guān)鍵酶。DAPT作為γ-分泌酶抑制劑已被廣泛運用于各種分子或細(xì)胞實驗中。本研究結(jié)果表明，DAPT能濃度依賴性地抑制胰腺癌Panc-28細(xì)胞增殖。該結(jié)果進(jìn)一步表明Notch信號通路參與了胰腺癌細(xì)胞的增殖，阻斷Notch通路可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果表明，與單獨給藥相比，兩兩聯(lián)用后Panc-28和Panc-1細(xì)胞增殖能力均有不同程度的下降，說明聯(lián)用以EGFR，AXL及Notch信號通路為作用靶點的抑制劑比單用效果更好。尤其以厄洛替尼與R428聯(lián)用對胰腺癌細(xì)胞的抑制效果最明顯。這與文獻(xiàn)關(guān)于AXL過表達(dá)能引起厄洛替尼耐藥性的報道［26］相吻合。當(dāng)抑制AXL受體的表達(dá)后，EGFR抑制劑的作用更明顯。本研究檢測結(jié)果表明，Panc-28細(xì)胞給藥處理后主要引起S期細(xì)胞百分比升高，Panc-1細(xì)胞給藥處理后G1期細(xì)胞百分比升高，這可能與兩種細(xì)胞在形態(tài)、傳代時間及周期性等方面存在一定的差異有關(guān)。上述結(jié)果提示，上述3種抑制劑能抑制胰腺癌細(xì)胞的分裂，將細(xì)胞周期阻滯在分裂間期。

綜上所述，本研究從細(xì)胞水平檢測了厄洛替尼、R428和DAPT 3種抑制劑對胰腺癌細(xì)胞的作用。結(jié)果表明，R428和DAPT可濃度依賴性地抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，其作用可能與阻斷AXL受體和Notch通路有關(guān)。厄洛替尼與R428聯(lián)用后作用較單用時明顯增強(qiáng)，二者聯(lián)用效果大于單用效果之和，表明其對胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制具有協(xié)同效應(yīng)，對細(xì)胞周期阻滯作用更為明顯。本研究3種藥物作用靶點不同，提示多作用靶點的藥物對胰腺癌細(xì)胞的抑制效果可能更好，這一結(jié)果為指導(dǎo)臨床用藥提供了一定的參考。

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Effect of combination of two of three signal pathway inhibitors on proliferation of Panc-28 and Panc-1 pancreatic cancer cells

WAN Jun1，2，LU Yin-zhong2，ZHENG Jun1，WU Fang2，ZHENG Wei-hong1
（1.The Third-level Pharmacological Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine，Medical Science College of China，Three Gorges University，Yichang 443002，China；2.Shanghai Center for Systems Biomedicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China）

OBJECTIVE To observe the effect of three signal pathway inhibitors：epidermal growth factor receptor（EGFR）inhibitor erlotinib，Anexelekto（AXL）inhibitor R428 and γ-secretaseinhibitor N-〔N-（3，5-difluorophenacetyl）-l-alanyl〕-S-phenylglycine t-butyl ester（DAPT）,on the proliferation of pancreatic cancer cells when any two of them are used in combination in order to offer experimental evidence for clinical medication.METHODS Panc-28 and Panc-1 cell lines were selected in this experi?ment.Erlotinib，R428 and DAPT were administered alone or in combination for 72 h before MTS assay was used to detect cell proliferation.Lactate dehydrogenase（LDH）activity assay was used to investi?gate the cytotoxicities.The flow cytometry was used to evaluate the cell cycle.RESULTS Erlotinib 5-80 μmol·L-1alone had no significant effect on the proliferation of Panc-28 cells，whereas DAPT 5-80 μmol·L-1or R428 50-800 nmol·L-1inhibited the proliferation of Panc-28 cells in a concentrationdependent manner（rDAPT=0.995，P＜0.01；rR428=0.833，P＜0.01）after being treated for 72 h.Compared with single use，the combination of two of the three inhibitors（erlotinib 50 μmol·L-1，DAPT 50 μmol·L-1，R428 300 nmol·L-1）inhibited the Panc-28 and Panc-1 cell proliferation but didn′t cause more cytotoxicity. Erlotinib and R428 in combination inhibited the proliferation rate of two pancreatic cancer cells by more than 40%compared with R428 used alone（P＜0.01）.In erlotinib and R428 combination group，cell cycle of Panc-28 and Panc-1 cells at S and G1was increased（P＜0.01）.CONCLUSION DAPT and R428 can inhibit the proliferation of pancreatic cancer cells to some extent.The combination of erlotinib and R428 has a synergistic inhibitory effect on proliferation of pancreatic cancer cells.

pancreatic cancer；erlotinib；R428；cell proliferation；cytotoxicity；cell cycle

ZHENG Wei-hong，E-mail：zwh20110606@163.com，Tel：（0717）6397501

R966

A

1000-3002-（2016）11-1156-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.11.005

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of Chna（31270853）；and Graduate Research Innovation Fund of Three Gorges University

2016-03-17接受日期：2016-11-01）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學(xué)基金項目（31270853）；三峽大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金項目

萬 君，碩士研究生主要從事分子藥理學(xué)研究。

鄭衛(wèi)紅，E-mail：zwh20110606@163.com，Tel：（0717）6397501