納米二氧化硅對正常人外周血單個核細胞凋亡的誘導作用

鐘建斌，雷澤林，唐 艷，張 丹，劉舉科，馬建秀

（1.西北民族大學醫(yī)學院，甘肅蘭州 730030；蘭州大學第一醫(yī)院2.呼吸科，3.中心實驗室，甘肅蘭州 730000；4.蘭州城市學院，甘肅蘭州 730070）

納米二氧化硅對正常人外周血單個核細胞凋亡的誘導作用

鐘建斌1，雷澤林2，唐 艷3，張 丹1，劉舉科4，馬建秀1

（1.西北民族大學醫(yī)學院，甘肅蘭州 730030；蘭州大學第一醫(yī)院2.呼吸科，3.中心實驗室，甘肅蘭州 730000；4.蘭州城市學院，甘肅蘭州 730070）

目的 觀察納米二氧化硅（SiO2）對正常人外周血單個核細胞（PBMC）凋亡的誘導作用，探討納米SiO2對人體的毒理特性。方法 透射電子顯微鏡觀察納米SiO2粒徑、形態(tài)及分散性；采集6名健康志愿者外周血標本，進行體外全血培養(yǎng)和體外PBMC分離培養(yǎng)；納米SiO212.5，25，50，100和200 mg·L-1與外周全血細胞和PBMC作用24 h后，血常規(guī)法檢測外周血白細胞數(shù)目，羅丹明標記鬼筆環(huán)肽標記法于熒光倒置顯微鏡觀察PBMC骨架微絲結(jié)構(gòu)，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細胞早期凋亡率，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液活性氧（ROS）自由基水平。結(jié)果 與正常對照組相比，納米SiO2100和200 mg·L-1引起外周全血細胞中淋巴細胞和單核細胞數(shù)目明顯減少（P＜0.01）；PBMC胞體皺縮、變圓，細胞核固縮并出現(xiàn)空泡化，細胞骨架微絲結(jié)構(gòu)破壞；早期凋亡率和胞內(nèi)ROS水平明顯升高（P＜0.01），且細胞早期凋亡率與胞內(nèi)ROS水平呈明顯的正相關(guān)（R2=0.847，P＜0.01）。結(jié)論 納米SiO2對PBMC有明顯的細胞毒性作用，可誘導細胞凋亡；激發(fā)氧化應激反應可能是其導致細胞凋亡的主要原因。

納米二氧化硅；外周血；單個核細胞；氧化應激；細胞凋亡

大氣可吸入固體顆粒物是造成空氣污染的重要因素，在大氣對流層中礦物顆粒約達到大氣顆粒物總量的1/2［1］。越來越多的研究表明，在全世界干旱地區(qū)沙塵暴天氣是最常見的自然災害，沙塵暴塵埃顆粒對人體健康可產(chǎn)生危害［2-3］。二氧化硅（silica dioxide，SiO2）是亞洲地區(qū)沙塵暴塵埃顆粒中的重要組成成分［4-5］。相關(guān)學者對亞洲沙塵暴塵埃顆粒的分析得出，其粒徑范圍可在10 nm～40 μm之間［6-7］。除沙塵暴天氣等自然因素外，人為因素產(chǎn)生的納米SiO2也廣泛存在于自然環(huán)境中［8］。當前對大氣細顆粒物的研究主要集中于致病性相關(guān)的有機顆粒和重金屬離子［9-10］，對納米級塵埃顆粒研究較少。納米SiO2具有空氣動力學直徑小，較微米級顆粒具有更高的表面活性、生物相容性和載體量，更易通過呼吸、消化和皮膚等黏膜途徑進入機體，經(jīng)過胞吞和內(nèi)化等各類轉(zhuǎn)運機制進入潛在的致敏靶點，產(chǎn)生更為嚴重的毒性反應［11-13］。納米SiO2可使L-02細胞活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）自由基水平升高，啟動氧化應激反應進而誘導細胞凋亡［14］。另有研究發(fā)現(xiàn)，納米SiO2作用于PC12細胞后導致細胞膜損傷，誘發(fā)凋亡小體形成，從而引發(fā)細胞凋亡程序［15］。血液系統(tǒng)作為人體重要的免疫防線，其在納米顆粒進入人體過程中發(fā)揮了重要的識別和轉(zhuǎn)運作用，但是目前國內(nèi)外對納米SiO2造成免疫系統(tǒng)的毒性研究較少。納米SiO2對免疫細胞潛在的免疫刺激或免疫抑制作用目前尚未知曉，對健康人體外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）產(chǎn)生的毒性及凋亡誘導作用尚不明確。本研究以正常人PBMC作為細胞模型，通過體外培養(yǎng)的方法，觀察不同濃度納米SiO2對PBMC的毒性作用和可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

納米SiO2（直徑10 nm，純度99.8%，比表面積為200 m2·g-1）購自中國基材科技有限公司。LSM淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自美國Sigma公司，DAPI染液購自美國Molecular Probes公司，羅丹明標記鬼比環(huán)肽TRITC-Phal?loidin購自上海翊圣生物科技有限公司，人活性氧（reactive oxygen species，ROS）ELISA檢測試劑盒購自上海繼錦化學科技有限公司，AnnexinⅤ/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，其他試劑均為分析純。24孔板購自美國Costar公司，2 mL真空采血管購自泰州為爾康醫(yī)用品有限公司，IX51熒光顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品，XT-1800i全自動血液分析儀為日本SYSMEX株式會社產(chǎn)品，F(xiàn)ACSCAN流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 透射電子顯微鏡觀察納米SiO2的粒徑和分布

納米SiO2溶液用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液配制，終濃度為50 mg·L-1，超聲振蕩器超聲10 min，滴到銅網(wǎng)中，室溫下風干。透射電子顯微鏡觀察粒子直徑、分布情況及形態(tài)，Image-Pro plus軟件隨機測定300個粒子并計算顆粒平均粒徑。

1.3 血常規(guī)法檢測納米SiO2作用于外周血細胞的毒性效應

6名健康志愿者（獲得知情同意），男和女各3名，年齡為21～23歲，近期無感染史和其他疾病。運用真空采血管無菌抽取新鮮外周血。取外周全血于24孔板中，每孔1 mL。暴露組分別加入1 mL無血清RPMI 1640培養(yǎng)液配制納米SiO2溶液，調(diào)整終濃度為12.5，25，50，100和200 mg·L-1，空白對照組添加無血清RPMI 1640培養(yǎng)液，以上各溶液每孔1 mL。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24 h，于XT-1800i全自動血液分析儀檢測，并記錄結(jié)果。

1.4 PBMC分離獲取

PBMC的分離按照聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離PBMC。取健康志愿者新鮮外周血2 mL，按試劑盒說明書要求分離獲取PBMC。

1.5 羅丹明標記鬼筆環(huán)肽標記檢測PBMC微絲結(jié)構(gòu)

調(diào)整PBMC濃度1×109L-1后接種于24孔板中，每孔1 mL。納米SiO2暴露組分別加入1 mL無血清RPMI 1640培養(yǎng)液配制納米SiO2溶液，調(diào)整終濃度為12.5，25，50，100和200 mg·L-1，正常對照組添加1 mL無血清RPMI 1640培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。按試劑盒說明書要求對PBMC細胞進行細胞微絲標記，標記結(jié)束后置于Olympus IX51熒光顯微鏡下觀察熒光強度。微絲結(jié)構(gòu)完整性與熒光強度呈正相關(guān)。

1.6 流式細胞術(shù)檢測PBMC凋亡

PBMC接種和處理同1.5，納米SiO2暴露培養(yǎng)24 h后經(jīng)胰酶消化，PBS洗細胞2次，調(diào)節(jié)細胞終濃度為1.0×108L-1。使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒進行標記，具體步驟按照試劑盒說明書操作，標記結(jié)束后在室溫下避光反應10 min，使用FACSCAN流式細胞儀檢測PBMC凋亡，每樣本收集10 000個細胞，使用Cell Quest軟件（BD Biosci?ence），分析早期凋亡細胞（FITC+PI-）百分率。

1.7 ELISA測定細胞培養(yǎng)上清ROS含量

PBMC接種和處理同1.5，經(jīng)納米SiO2暴露培養(yǎng)24 h后，收集24孔板內(nèi)細胞培養(yǎng)上清液移至離心管，4℃下2000×g離心5 min后取上清液，使用人ROS ELISA試劑盒測定上清液中ROS水平，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)均以x±s表示。采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1納米SiO2的形貌和分散性

透射電子顯微鏡下觀察（圖1），納米SiO2分布存在輕度聚集，大小較均勻，顆粒形態(tài)呈球形，分散性較好，使用Image-Pro plus軟件分析得到顆粒粒徑為（10.53±1.25）nm。

Fig.1 Transmission electron microscopic photo of silica nanoparticles（nano-SiO2）.

2.2 納米SiO2對外周血白細胞數(shù)目的影響

血常規(guī)結(jié)果（表1）顯示，納米SiO212.5，25，50，100和200 mg·L-1作用外周全血24 h后，與正常對照組相比，納米SiO2100和200 mg·L-1可使外周全血白細胞數(shù)目減少（P＜0.05）；其中以淋巴細胞和單核細胞減少為主（P＜0.01）。

2.3 納米SiO2對PBMC形態(tài)的影響

圖2結(jié)果顯示，與正常對照組（圖2A）相比，當納米SiO2暴露濃度為12.5，25和50 mg·L-1時對PBMC形態(tài)并無明顯影響（圖2B，2C和2D）。當暴露濃度增加至100和200 mg·L-1時，PBMC胞體皺縮，變圓，細胞核出現(xiàn)固縮并且空泡化，細胞密度明顯降低并脫落（圖2E和2F）。

Tab.1 Effect of nano-SiO2on leukocytes of human peripheral blood cells（PBCs）

Fig.2 Effect of nano-SiO2on morphology of human PBMCs.See Tab.1 for cell treatment.A：normal control；B-F：nano-SiO212.5，25，50，100 and 200 mg·L-1，respectively.↑：karyopyknosis.

2.4納米SiO2對PBMC微絲結(jié)構(gòu)的影響

倒置熒光顯微鏡下觀察（圖3），與正常對照組（圖3A）相比，當納米SiO2濃度為12.5和25 mg·L-1時（圖3B和3C），對PBMC微絲結(jié)構(gòu)無明顯影響。暴露濃度增加至50和100 mg·L-1時（圖3D和3E），熒光強度呈減弱趨勢；暴露濃度為200 mg·L-1時，PBMC骨架微絲結(jié)構(gòu)明顯破壞（圖3F）。

Fig.3 Effect of nano-SiO2on microfilaments in human PBMCs.See Tab.1 for cell treatment.A：normal control；B-F：nano-SiO212.5，25，50，100 and 200 mg·L-1，respectively.↑：microfilament destruction.

2.5 納米SiO2對PBMC凋亡的影響

與正常對照組相比，納米SiO2暴露濃度為12.5 mg·L-1時，細胞早期凋亡率無明顯差異；濃度為25，50和100，200 mg·L-1時，早期凋亡率均升高（P＜0.01）（圖4和5），表明納米SiO2能誘導PBMC凋亡。

Fig.4 Effect of nano-SiO2on early apoptosis of human PBMCs.See Tab.1 for the cell treatment.A：normal control；B-F：nano-SiO212.5，25，50，100 and 200 mg·L-1，respectively.

Fig.5 Effect of nano-SiO2on early apoptosis in human PBMCs.See Tab.1 for cell treatment.±s，n=6.**P＜0.01，compared with normal control（0）group.

2.6 納米SiO2對PBMC胞內(nèi)ROS水平的影響

圖6結(jié)果顯示，與正常對照組相比，納米SiO2暴露濃度為25，50，100和200 mg·L-1時，隨暴露濃度的增加，PBMC胞內(nèi)ROS濃度明顯升高（P＜0.01），表明納米SiO2能誘導PBMC發(fā)生氧化應激反應，造成細胞損傷。

Fig.6 Effect of nano-SiO2on reactive oxygen species（ROS）level in human PBMCs.SeeTab.1forcell treatment.±s，n=6.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normal control（0）group.

2.7 PBMC早期凋亡率與ROS水平的相關(guān)性

圖7結(jié)果顯示，PBMC與納米SiO2共培養(yǎng)24 h后，PBMC早期凋亡率與ROS水平呈明顯的正相關(guān)性（R2=0.847，P＜0.01）。

Fig.7 CorrelationbetweenROS levelandearly apoptosis rate in human PBMCs after treatment with nano-SiO2.PBMCs were cultured for 24 h.

3 討論

納米SiO2的生物學效應與顆粒粒徑和暴露濃度存在密切的關(guān)系，粒徑越小，其顆粒表面的原子數(shù)越多，不飽和鍵的數(shù)目增多，同時表面能急劇增加，使得這些表面原子具有很高的反應活性［16］。本研究電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米SiO2在細胞培養(yǎng)液中存在輕微的團聚現(xiàn)象，這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與納米SiO2存在極高的表面能以及培養(yǎng)過程中細胞釋放的蛋白質(zhì)或培養(yǎng)液中存在的其他成分有關(guān)。但相關(guān)研究表明，納米SiO2進入細胞內(nèi)之后，團聚現(xiàn)象即會消失［13，17］。Mendoza等［13］研究表明，10 nm的納米SiO2較100 nm的納米SiO2更易通過胞吞或者吞噬作用進入PBMC的胞質(zhì)，從而造成更嚴重氧化損傷和細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)。本研究血常規(guī)結(jié)果表明，隨著納米SiO2暴露濃度增加，白細胞數(shù)目明顯減少，其中以淋巴細胞和單核細胞減少最為明顯。其原因可能是因納米SiO2進入細胞后，誘發(fā)氧化應激反應造成細胞膜流動性下降和通透性增加，并造成細胞核形態(tài)改變，誘導細胞發(fā)生凋亡，最終導致白細胞減少［18］。DNA損傷、氧自由基的產(chǎn)生、細胞膜損傷和離子穩(wěn)態(tài)失衡等的刺激信號均可誘導細胞凋亡的發(fā)生［19-20］。本研究聯(lián)合采用細胞骨架熒光標記、流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率、ELISA測定細胞內(nèi)ROS水平綜合探討納米SiO2誘導PBMC凋亡的現(xiàn)象和潛在的機制。細胞胞體呈球形或卵球形，并出現(xiàn)細胞核固縮或者碎裂是細胞凋亡的典型形態(tài)特征。本研究中不同濃度納米SiO2作用于PBMC 24 h后，光鏡下觀察細胞出現(xiàn)上述形態(tài)改變，提示納米SiO2可引起PBMC凋亡。本研究觀察PBMC骨架微絲結(jié)構(gòu)，PBMC骨架在高濃度納米SiO2（200 mg·L-1）處理后，出現(xiàn)明顯的微絲斷裂和骨架結(jié)構(gòu)破壞。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，各濃度納米SiO2均能引起PBMC早期凋亡的發(fā)生，并呈現(xiàn)典型的濃度依賴性。有關(guān)文獻結(jié)果也顯示，納米顆粒會造成細胞微絲結(jié)構(gòu)破壞進而誘導細胞凋亡［21］。本研究與Ye等［14］報道結(jié)果一致，即納米SiO2可以誘導細胞凋亡發(fā)生，并具有濃度依賴性。ROS是引發(fā)細胞凋亡的重要因素，當細胞內(nèi)ROS蓄積過量時啟動氧化應激反應，導致細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，引起細胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等發(fā)生氧化損害［22］。Tarantini等［23］研究發(fā)現(xiàn)，納米SiO2引起細胞內(nèi)ROS水平的升高，激發(fā)氧化應激反應，最終導致人腸道Caco-2細胞的凋亡發(fā)生。高濃度納米SiO2誘導細胞產(chǎn)生ROS等物質(zhì)，可破壞膜結(jié)構(gòu)的完整性并造成DNA的損傷［19］。本研究結(jié)果表明，PBMC胞內(nèi)ROS水平隨著納米SiO2暴露濃度的升高而明顯上升，且PBMC早期凋亡率與ROS水平呈明顯的正相關(guān)，也提示納米SiO2造成的PBMC凋亡很可能是通過升高細胞ROS水平而誘導的。然而細胞凋亡的產(chǎn)生受多重因素的調(diào)節(jié)，除線粒體相關(guān)的氧化應激通路外，T細胞介導免疫反應的啟動也是可能的因素，例如通過激活Fas/FasL途徑誘導受損靶細胞的凋亡［24-25］。我們認為，本研究中納米SiO2明顯誘導PBMC發(fā)生凋亡的機制也有可能是納米SiO2作為一類外源性抗原被巨噬細胞吞噬并加工后啟動相關(guān)免疫應答。綜上所述，不同濃度的納米SiO2作用于PBMC后，在一定濃度范圍內(nèi)可引起PBMC形態(tài)改變，細胞骨架破壞，造成胞內(nèi)ROS水平升高進而誘導細胞凋亡的發(fā)生。具體的凋亡誘導機制尚需深入研究。

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Induction of silica nanoparticles on apoptosis of normal human peripheral blood mononuclear cells

ZHONG Jian-bin1，LEI Ze-lin2，TANG Yan3，ZHANG Dan1，LIU Ju-ke4，MA Jian-xiu1
（1.Medical College of Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China；2.Department of Respiration，3.Department of Central Laboratory，the First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；4.Lanzhou City University，Lanzhou 730070，China）

OBJECTIVE To elucidate the toxicological properties of silica nanoparticles（nano-SiO2）by investigating their effect on human peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）.METHODS The particle size，morphology and dispersion of nano-SiO2were characterized by the transmission electron microscope.Human blood samples were provided by 6 healthy volunteers，while PBMCs were isolated from the peripheral blood cells and cultured in vitro.The cells were treated with 10 nm nano-SiO2in RPMI 1640 media at the concentration of 0（normal control），12.5，25，50，100 and 200 mg·L-1for 24 h.Blood routine examination was performed.The human PBMC morphology was observed under an inverted microscope，followed by detection and analysis of the microfilament using TRITC-phallodin and fluorescence microscopy，respectively.After staining with AnnexinⅤ-FITC and propidumiodide，the cell early apoptosis rate was measured by flow cytometry.Reactive oxygen species（ROS）production in the supernatant medium liquid was measured with ELISA.RESULTS Compared with normal control group，the proportion of lymphocytes and macrophages significantly decreased when the cells were treated with nano-SiO2100 and 200 mg·L-1.The cell morphology changed and the microfilament was disrupted.The early apoptosis rate and intracellular ROS level both significantly increased along with the nano-SiO2exposure concentration（P＜0.01）.In addition，there was a significant positive correlation between ROS and apoptosis rate（R2=0.847，P＜0.01）.CONCLUSION Nano-SiO2demonstrates cytotoxicity when exposed to PBMCs.The elevated level of oxidative stress is probably a major reason for early apoptosis.

silica nanoparticles；peripheral blood；mononuclear cells；oxidative stress；apoptosis

MA Jian-xiu，E-mail：gsmjx@hotmail.com

R994.6

A

1000-3002-（2016）11-1176-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.11.008

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（31260133）；and Northwest University for Nationalities 2015 National College Students Innovation and Entrepreneurship Training Program（201510742088）

2016-07-05 接受日期：2016-11-09）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學基金（31260133）；西北民族大學2015年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510742088）

鐘建斌，本科生，主要從事細胞毒性和納米材料研究。

馬建秀，E-mail：gsmjx@hotmail.com