• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    HIF-1α/SHH信號(hào)通路在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義

    2021-09-09 08:09:48嚴(yán)志龍吳曄明
    關(guān)鍵詞:上海交通大學(xué)組織化學(xué)低氧

    陳 盛,嚴(yán)志龍,吳曄明,徐 敏,顧 松,馬 靖

    1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心普外科,上海 2 0 0 1 2 7;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒外科,上海 200092;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心病理科,上海 200127

    神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)源于交感神經(jīng)節(jié)的原始神經(jīng)嵴細(xì)胞,是最常見(jiàn)的兒童惡性實(shí)體腫瘤之一。雖然有手術(shù)、化學(xué)治療(化療)、放射治療(放療)、自身造血干細(xì)胞移植等多種治療方式,但由于進(jìn)展期NB具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、預(yù)后較差的特點(diǎn),治療效果均不理想。據(jù)文獻(xiàn)[1-2]報(bào)道,國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期系統(tǒng)(International Neuroblastoma Staging System,INSS)3期的NB患兒5年生存率約為50%,4期NB的5年生存率僅為20%。因此,尋找NB發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵分子靶點(diǎn),對(duì)提高該病的療效、判斷其預(yù)后具有重要意義。

    實(shí)體腫瘤快速生長(zhǎng),而腫瘤滋養(yǎng)血管生長(zhǎng)速度相對(duì)落后,并可能存在血管畸形,因此,腫瘤內(nèi)部存在血液供應(yīng)不足、缺氧是典型的微環(huán)境特征[3-4]。已知低氧導(dǎo)致NB具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力,也使得NB細(xì)胞去分化,具備腫瘤干細(xì)胞特征,對(duì)放療、化療有更強(qiáng)的耐受性[5-6]。在缺氧過(guò)程中,NB的低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達(dá)增加,HIF-1α在NB細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境、惡性程度增加的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7-8]。本課題組前期研究[7]首先發(fā)現(xiàn),NB細(xì)胞中HIF-1α通過(guò)激活下游的音猬因子(sonic hedgehog,SHH)信號(hào)通路,促進(jìn)NB細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。在前期研究的基礎(chǔ)上,本研究通過(guò)測(cè)定HIF-1α/SHH通路在NB中的表達(dá),報(bào)道該信號(hào)通路與NB臨床特征的聯(lián)系,以及對(duì)其預(yù)后的提示意義。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 研究對(duì)象

    選擇2009年1月—2014年12月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院住院行NB切除術(shù),手術(shù)年齡為0~18歲的兒童患者作為研究對(duì)象,在2家醫(yī)院的病理科調(diào)取NB石蠟切片。并選擇相同時(shí)間段和年齡段、接受節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤(ganglioneuroma,GN)切除術(shù)的患兒作為對(duì)照組,同樣調(diào)取其石蠟切片。NB患兒共101例,其中男性53例,女性48例;中位年齡為3歲(4個(gè)月~10歲);收集相關(guān)病史資料進(jìn)行回顧性分析。GN患兒共20例,其中男性8例,女性12例;中位年齡為10歲(4~17歲)。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)分別為SCMCIRB-K2017024、XHEC-D-2036)。

    1.2 主要試劑

    免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)所需的HIF-1α一抗(工作濃度1∶200)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,SHH一抗(工作濃度1∶200)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(工作濃度1∶100)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

    1.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

    采用免疫組織化學(xué)SP(streptavdin-peroxidase)法進(jìn)行染色,在NB和GN石蠟切片中檢測(cè)HIF-1α和SHH蛋白表達(dá),實(shí)驗(yàn)步驟如參考文獻(xiàn)[9]所述。

    切片由2位病理科醫(yī)師盲法閱片,對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分,如有意見(jiàn)不同則協(xié)商討論達(dá)成一致。每張石蠟切片隨機(jī)選5個(gè)高倍視野(×400),每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。按照細(xì)胞著色百分比和著色強(qiáng)度分別評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如參考文獻(xiàn)[10]所述:著色細(xì)胞≤5%計(jì)0分,6%~25%計(jì)1分,26%~50%計(jì)2分,51%~75%計(jì)3分,>75%計(jì)4分;細(xì)胞無(wú)著色計(jì)0分,淡黃色計(jì)1分,黃色計(jì)2分,棕褐色計(jì)3分。2種分值的乘積為最終得分,≥6分為高表達(dá),<6分為低表達(dá)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以中位數(shù)(全距)表示;定性資料以頻數(shù)(百分比)表示,采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)HIF-1α和SHH在NB中的表達(dá)水平進(jìn)行Spearman相關(guān)分析,采用Kaplan-Meier生存分析法進(jìn)行預(yù)后分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 NB患兒的一般信息

    將101例NB患兒按INSS分期標(biāo)準(zhǔn),分為1期患者20例、2期患者23例、3期患者22例、4期患者36例(包括4s期4例)。腫瘤原發(fā)部位位于腎上腺49例、后腹膜39例、后縱隔12例、頸部1例。所有患兒均接受NB完全或部分切除術(shù),61例術(shù)后接受正規(guī)化療,其中8例接受自體干細(xì)胞移植。有5例因家庭原因或經(jīng)濟(jì)原因術(shù)后未接受或未完成正規(guī)化療,均死亡。22例死于腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,3例死于化療后嚴(yán)重感染,失訪9例。去除失訪病例,本組病例5年總體生存(overall survival,OS)率為67.4%,5年無(wú)事件生存(event-free survival,EFS)率為62.0%。其中1期NB患兒OS率和EFS率均為100%,2期NB患兒OS率和EFS率均為95.7%,3期NB患兒OS率和EFS率分別為59.1%、45.5%,4期NB患兒OS率和EFS率分別為37.5%、31.2%。

    2.2 HIF-1α、SHH在NB和GN中的表達(dá)差異

    免疫組織化學(xué)顯示HIF-1α表達(dá)于細(xì)胞核,SHH表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)(圖1)。HIF-1α在27例(26.7%)NB患兒中高表達(dá),在74例(73.3%)例患兒中低表達(dá);SHH在33例(32.7%)NB患兒中高表達(dá),在68例(67.3%)例患兒中低表達(dá);在GN中,只有1例高表達(dá)HIF-1α(5.0%),2例高表達(dá)SHH(10.0%)(表1、圖1)。因此,HIF-1α、SHH在NB中的表達(dá)率高于GN,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。Spearman相關(guān)分析顯示,101例NB中HIF-1α、SHH表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.41,P=0.000)。

    表1 HIF-1α、SHH在NB和GN中的表達(dá)水平Tab 1 Expression levels of HIF-1αand SHH in NBs and GNs

    2.3 HIF-1α、SHH表達(dá)水平和NB臨床病理特征的關(guān)系

    3、4期NB中HIF-1α、SHH的高表達(dá)患者比例高于1、2期NB,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HIF-1α:38.6%vs11.4%,P=0.002;SHH:42.1%vs20.5%,P=0.021)(圖1、表2)。病理分類為組織分化不良型(unfavorable histology,UFH)NB中HIF-1α、SHH的高表達(dá)患者比例也高于組織分化良好型(favorable histology,F(xiàn)H)NB,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HIF-1α:37.0%vs14.9%,P=0.012;SHH:44.4%vs19.1%,P=0.007)(圖1、表2)。此外,HIF-1α、SHH的高表達(dá)也與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(HIF-1α:36.2%vs14.0%,P=0.012;SHH:46.6%vs14.0%,P=0.001),而與年齡、性別、MYCN proto-oncogene(MYCN)基因擴(kuò)增、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)(均P>0.05)(表2)。

    表2 HIF-1α、SHH表達(dá)水平和NB患兒臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between expression levels of HIF-1α/SHH and clinicopathological characteristics of NB patients

    圖1 HIF-1α、SHH在GN和NB中的典型表達(dá)Fig 1 Typical expression of HIF-1αand SHH in GN and NB

    2.4 HIF-1α、SHH表達(dá)水平和NB預(yù)后相關(guān)

    去除失訪病例,92例NB患兒中位隨訪時(shí)間為7.1年(5.1年~11.4年)。Kaplan-Meier生存分析顯示,HIF-1α高表達(dá)組的5年OS率和EFS率均低于HIF-1α低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OS率:40.9%vs75.7%,P=0.001;EFS率:40.9%vs70.0%,P=0.008)(圖2)。SHH高表達(dá)組的5年OS率、EFS率也同樣低于SHH低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OS率:42.9%vs78.1%,P=0.000;EFS率:39.3%vs73.4%,P=0.001)(圖2)。

    圖2 NB患兒中HIF-1α、SHH的表達(dá)水平和預(yù)后的關(guān)系Fig 2 Relationship between theexpression levels of HIF-1α/SHH and theprognosis in NBpatients

    3 討論

    腫瘤微環(huán)境中,低氧通過(guò)調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、凋亡、黏附、代謝、血管生成等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,使腫瘤細(xì)胞增殖性、耐藥性、侵襲力增加[11-12]。HIF-1是細(xì)胞在低氧下調(diào)節(jié)生理功能的重要轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)與氧氣輸送、利用,以及葡萄糖代謝有關(guān)的1 000多種人類基因的表達(dá)[13-14]。HIF-1是一個(gè)異二聚體,由氧調(diào)節(jié)性表達(dá)的α-亞基和組成性表達(dá)的β-亞基構(gòu)成。常氧下α-亞基中的2個(gè)關(guān)鍵脯氨酸殘基會(huì)被羥化,在von Hippel-Lindau腫瘤抑制蛋白的作用下,HIF-1α被泛素化,隨后被蛋白酶體降解;低氧下α-亞基的降解被阻斷,其表達(dá)升高,并促進(jìn)下游靶基因轉(zhuǎn)錄[13-14]。有文獻(xiàn)[7,15-16]報(bào)道,在包括NB在內(nèi)的一些惡性腫瘤中,HIF-1α高表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞的惡性程度,促進(jìn)其生長(zhǎng)侵襲,并提示不良預(yù)后。

    SHH信號(hào)通路在胚胎發(fā)育和組織分化中起到重要作用,但是該通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖,有產(chǎn)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[17]。研究[18]證明,NB中該信號(hào)通路存在異常激活,阻斷該通路后可有效抑制NB生長(zhǎng),促進(jìn)凋亡,降低MYCN的表達(dá)水平。本課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn),在NB中HIF-1α可正向調(diào)控SHH信號(hào)通路,通過(guò)激活該通路實(shí)現(xiàn)HIF-1α促NB生長(zhǎng)的效應(yīng)。本研究在較大樣本量的NB病例中測(cè)定HIF-1α/SHH信號(hào)通路的表達(dá),并將其和患者的臨床特征、遠(yuǎn)期預(yù)后相聯(lián)系,探索該通路的臨床意義。

    HIF-1α在NB中的作用仍有爭(zhēng)議。Dungwa等[19]發(fā)現(xiàn)NB中HIF-1α高表達(dá)與高的INSS分期、UFH病理類型、高危分組等臨床特征密切相關(guān),并提示患兒的不良預(yù)后。但也有研究[20]結(jié)論與之相反,即HIF-1α高表達(dá)的NB患兒傾向于有更低的INSS分期、更高的5年OS率。GN同樣起源于交感神經(jīng)節(jié)的原始神經(jīng)嵴細(xì)胞,和NB是同一家族的腫瘤,但GN組織分化成熟,是良性腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α、SHH在GN中均低表達(dá),而在NB中表達(dá)升高,尤其在進(jìn)展期NB中表達(dá)更高;說(shuō)明HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活和NB的惡性表型相關(guān),也可能在NB的發(fā)生、發(fā)展以及組織分化中起到重要作用。3、4期以及UFH型NB的HIF-1α、SHH表達(dá)水平高于1、2期以及FH型NB,有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NB中HIF-1α、SHH表達(dá)水平同樣升高,這進(jìn)一步說(shuō)明HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活可能是NB進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、去分化的分子機(jī)制。在本研究中,NB的HIF-1α和SHH表達(dá)水平呈正相關(guān),也證實(shí)HIF-1α對(duì)SHH通路的正向調(diào)控作用。我們也發(fā)現(xiàn)HIF-1α、SHH高表達(dá)組的5年OS率、EFS率均降低,提示HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活可能預(yù)示NB患兒的不良預(yù)后,可作為年齡、分期、MYCN基因擴(kuò)增、病理類型等已知的NB預(yù)后因素的補(bǔ)充條件,進(jìn)一步增加判斷NB預(yù)后的準(zhǔn)確性。

    原癌基因MYCN擴(kuò)增在促進(jìn)NB生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等方面發(fā)揮重要作用,強(qiáng)烈提示NB的不良預(yù)后[21-22]。MYCN在NB中的擴(kuò)增率為10%~25%,在進(jìn)展期NB中擴(kuò)增率更高[23]。HIF-1α/SHH信號(hào)通路和MYCN擴(kuò)增之間的關(guān)系尚不明確,需進(jìn)一步研究。本研究中MYCN的擴(kuò)增率為11.9%(12/101),我們未發(fā)現(xiàn)MYCN擴(kuò)增組和非擴(kuò)增組之間HIF-1α和SHH的表達(dá)差異,無(wú)法提示HIF-1α/SHH信號(hào)通路和MYCN之間的調(diào)控關(guān)系,這也可能和NB中MYCN的擴(kuò)增率較低有關(guān)。

    綜上所述,HIF-1α、SHH表達(dá)升高和NB高的INSS分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UFH病理分型等臨床特征密切相關(guān),并預(yù)示NB患兒的不良預(yù)后。因此,HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活可能在NB發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,該信號(hào)通路可能是NB潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

    參·考·文·獻(xiàn)

    [1] Tas ML,Reedijk AMJ,Karim-Kos HE,et al.Neuroblastoma between 1990 and 2014 in the netherlands:increased incidence and improved survival of high-risk neuroblastoma[J].Eur JCancer,2020,124:47-55.

    [2] 張安安,潘慈,葉啟東,等.4期神經(jīng)母細(xì)胞瘤綜合治療的遠(yuǎn)期隨訪觀察[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2014,94(20):1547-1552.

    [3] 連烜曄,崔晶.低氧對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用[J].癌癥進(jìn)展,2019,17(10):1139-1142.

    [4] Hapke RY,Haake SM. Hypoxia-induced epithelial to mesenchymal transition in cancer[J].Cancer Lett,2020,487:10-20.

    [5] Zhang L,Marrano P,Wu B,et al.Combined antitumor therapy with metronomic topotecan and hypoxia-activated prodrug,evofosfamide,in neuroblastoma and rhabdomyosarcoma preclinical models[J].Clin Cancer Res,2016,22(11):2697-2708.

    [6] Yu T,Li L,Liu W,et al.Silencing of NADPH oxidase 4 attenuates hypoxia resistance in neuroblastoma cells SH-SY5Y by inhibiting PI3K/Aktdependent glycolysis[J].Oncol Res,2019,27(5):525-532.

    [7] Chen S,Zhang M,Xing L,et al.HIF-1αcontributes to proliferation and invasiveness of neuroblastoma cellsviaSHH signaling[J].PLoSOne,2015,10(3):e0121115.

    [8] Sun W,Zhang L,Hou L,et al.Isatin inhibits SH-SY5Y neuroblastoma cell invasion and metastasis through MAO/HIF-1α/CXCR4 signaling[J].Anticancer Drugs,2017,28(6):645-653.

    [9] Xiao Y,Qu C,Ge W,et al.Depletion of thymosinβ4 promotes the proliferation,migration,and activation of human hepatic stellate cells[J].Cell Physiol Biochem,2014,34(2):356-367.

    [10] 陳康,莢衛(wèi)東,葛勇勝,等.KLK7在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2019,54(10):1637-1641.

    [11] Miranda-Galvis M, Teng Y. Targeting hypoxia-driven metabolic reprogramming to constrain tumor progression and metastasis[J].Int JMol Sci,2020,21(15):5487.

    [12] Xiong Q,Liu B,Ding M,et al.Hypoxia and cancer related pathology[J].Cancer Lett,2020,486:1-7.

    [13] Koyasu S,Kobayashi M,Goto Y,et al.Regulatory mechanisms of hypoxiainducible factor 1 activity:two decades of knowledge[J].Cancer Sci,2018,109(3):560-571.

    [14] Sousa Fialho MDL,Abd Jamil AH,Stannard GA,et al.Hypoxia-inducible factor 1 signalling, metabolism and its therapeutic potential in cardiovascular disease[J].Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis,2019,1865(4):831-843.

    [15] Lin CS,Liu TC,Lee MT,et al.Independent prognostic value of hypoxiainducible factor 1-αexpression in small cell lung cancer[J].Int JMed Sci,2017,14(8):785-790.

    [16] Sowa T,Menju T,Chen-Yoshikawa TF,et al.Hypoxia-inducible factor 1 promotes chemoresistance of lung cancer by inducing carbonic anhydraseⅨexpression[J].Cancer Med,2017,6(1):288-297.

    [17] Doheny D,Manore SG,Wong GL,et al.Hedgehog signaling and truncated GLI1 in cancer[J].Cells,2020,9(9):2114.

    [18] Wickstr?m M,Dyberg C,Shimokawa T,et al.Targeting the hedgehog signal transduction pathway at the level of GLI inhibits neuroblastoma cell growthin vitroandin vivo[J].Int JCancer,2013,132(7):1516-1524.

    [19] Dungwa JV,Hunt LP,Ramani P.HIF-1αup-regulation is associated with adverse clinicopathological and biological factors in neuroblastomas[J].Histopathology,2012,61(3):417-427.

    [20] Noguera R,Fredlund E,Piqueras M,et al.HIF-1αand HIF-2αare differentially regulatedin vivoin neuroblastoma:high HIF-1αcorrelates negatively to advanced clinical stage and tumor vascularization[J].Clin Cancer Res,2009,15(23):7130-7136.

    [21] Dzieran J,Rodriguez Garcia A,Westermark UK,et al.MYCN-amplified neuroblastoma maintains an aggressive and undifferentiated phenotype by deregulation of estrogen and NGF signaling[J].Proc Natl Acad Sci U SA,2018,115(6):E1229-E1238.

    [22] 湯夢(mèng)婕,袁曉軍,安霞,等.轉(zhuǎn)移性神經(jīng)母細(xì)胞瘤伴骨和骨髓轉(zhuǎn)移的治療療效及預(yù)后分析[J].中華轉(zhuǎn)移性腫瘤雜志,2019(03):18-24.

    [23] Lee JW,Son MH,Cho HW,et al.Clinical significance of MYCN amplification in patients with high-risk neuroblastoma[J].Pediatr Blood Cancer,2018,65(10):e27257.

    猜你喜歡
    上海交通大學(xué)組織化學(xué)低氧
    上海交通大學(xué)
    間歇性低氧干預(yù)對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響
    上海交通大學(xué)參加機(jī)器人比賽
    食管鱗狀細(xì)胞癌中FOXC2、E-cadherin和vimentin的免疫組織化學(xué)表達(dá)及其與血管生成擬態(tài)的關(guān)系
    Wnt/β-catenin信號(hào)通路在低氧促進(jìn)hBMSCs體外增殖中的作用
    大口黑鱸鰓黏液細(xì)胞的組織化學(xué)特征及5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的分布
    免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色在腎活檢組織石蠟切片磷脂酶A2受體檢測(cè)中的應(yīng)用
    裸鼴鼠不同組織中低氧相關(guān)基因的表達(dá)
    鴨肝組織中DHBcAg表達(dá)水平定量免疫組織化學(xué)方法的建立
    《疾風(fēng)圖》
    人民交通(2012年6期)2012-10-26 05:31:10
    欧美日本视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产精品一区www在线观看| 99热6这里只有精品| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲天堂av无毛| 精品久久久久久久久av| 久久久久网色| 国产日韩欧美亚洲二区| 日韩国内少妇激情av| 欧美精品一区二区大全| 我的女老师完整版在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日本三级黄在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 直男gayav资源| 极品教师在线视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 99热6这里只有精品| 亚洲综合精品二区| 久久久国产一区二区| 精品一区二区免费观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲高清免费不卡视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日韩强制内射视频| 91精品国产九色| 99re6热这里在线精品视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 各种免费的搞黄视频| 欧美成人a在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲av福利一区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产精品人妻久久久久久| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产亚洲最大av| 在线免费十八禁| 夜夜爽夜夜爽视频| 日韩一本色道免费dvd| 九色成人免费人妻av| 成年人午夜在线观看视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 色网站视频免费| 日本wwww免费看| 一二三四中文在线观看免费高清| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 99久久人妻综合| 国产黄片美女视频| 日韩大片免费观看网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品一二三| 久久久午夜欧美精品| 久久久久久久午夜电影| 国产v大片淫在线免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 九九爱精品视频在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 在线观看免费高清a一片| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产黄片美女视频| 各种免费的搞黄视频| 久久久色成人| 91精品一卡2卡3卡4卡| 只有这里有精品99| 欧美成人a在线观看| 国产乱人偷精品视频| 国产高清不卡午夜福利| 九色成人免费人妻av| 最近2019中文字幕mv第一页| 日本熟妇午夜| 亚洲av男天堂| 午夜爱爱视频在线播放| 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩制服骚丝袜av| 成年人午夜在线观看视频| a级一级毛片免费在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 一级毛片电影观看| 亚洲av不卡在线观看| 九草在线视频观看| 中国三级夫妇交换| 51国产日韩欧美| 日韩在线高清观看一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美zozozo另类| 国产久久久一区二区三区| 大陆偷拍与自拍| 精品午夜福利在线看| 99久国产av精品国产电影| 精品一区二区三卡| 久久99蜜桃精品久久| 嫩草影院新地址| 嘟嘟电影网在线观看| 国产成人精品福利久久| 免费电影在线观看免费观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲国产精品999| 日韩欧美精品v在线| 亚洲,一卡二卡三卡| av线在线观看网站| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美另类一区| 中文字幕制服av| 国产高清不卡午夜福利| 精品一区在线观看国产| 中文字幕制服av| 大陆偷拍与自拍| 久久人人爽人人爽人人片va| 嘟嘟电影网在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说 | 特大巨黑吊av在线直播| av.在线天堂| 在线观看三级黄色| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 亚洲第一区二区三区不卡| 2018国产大陆天天弄谢| 91精品国产九色| 日韩亚洲欧美综合| 黄色欧美视频在线观看| 久久99精品国语久久久| 性插视频无遮挡在线免费观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 午夜日本视频在线| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 一级爰片在线观看| 亚洲自拍偷在线| 日韩欧美精品免费久久| 男女无遮挡免费网站观看| 日韩一本色道免费dvd| 久久久久久久精品精品| videos熟女内射| 91久久精品电影网| 超碰av人人做人人爽久久| 成年av动漫网址| 国产精品.久久久| 最近最新中文字幕免费大全7| 成年人午夜在线观看视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 在线观看一区二区三区| 久久久久网色| 国产精品99久久久久久久久| 在线观看三级黄色| 成人亚洲精品av一区二区| 在线天堂最新版资源| 欧美国产精品一级二级三级 | 水蜜桃什么品种好| 成人免费观看视频高清| 精品久久久久久久久av| 内地一区二区视频在线| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 老女人水多毛片| 国产永久视频网站| 大片免费播放器 马上看| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产精品人妻久久久久久| 日韩精品有码人妻一区| 99热6这里只有精品| www.av在线官网国产| 日韩大片免费观看网站| 国产精品久久久久久久久免| 日韩欧美 国产精品| 日韩成人av中文字幕在线观看| 97在线人人人人妻| 2021天堂中文幕一二区在线观| 69人妻影院| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久久亚洲精品成人影院| 91在线精品国自产拍蜜月| 观看免费一级毛片| 少妇被粗大猛烈的视频| 99热6这里只有精品| 成人免费观看视频高清| 久久影院123| 国产久久久一区二区三区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| av国产免费在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美日本视频| 午夜激情久久久久久久| 久久久久久久国产电影| 午夜福利在线在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲在久久综合| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 亚洲国产精品成人综合色| 精品一区二区三区视频在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 少妇人妻一区二区三区视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 秋霞在线观看毛片| 国产精品国产av在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 97在线视频观看| 久久国内精品自在自线图片| 香蕉精品网在线| 国产欧美亚洲国产| 亚洲成人中文字幕在线播放| 色视频在线一区二区三区| 人妻系列 视频| 免费av观看视频| 午夜日本视频在线| 国产亚洲最大av| 国产精品一区www在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 少妇高潮的动态图| 欧美日韩精品成人综合77777| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美丝袜亚洲另类| 成年女人在线观看亚洲视频 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 女人被狂操c到高潮| 国产毛片在线视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 69人妻影院| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 九九在线视频观看精品| 久久精品综合一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品99久久久久久久久| 黄色配什么色好看| 如何舔出高潮| 欧美人与善性xxx| 久久国产乱子免费精品| 日韩三级伦理在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 免费少妇av软件| 国产精品福利在线免费观看| 国产高清有码在线观看视频| 免费黄网站久久成人精品| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 插逼视频在线观看| 欧美另类一区| 欧美 日韩 精品 国产| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲成人久久爱视频| 国产伦理片在线播放av一区| 精品国产三级普通话版| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美+日韩+精品| 国产精品av视频在线免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| av专区在线播放| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 大码成人一级视频| 久久久久精品性色| 欧美潮喷喷水| 亚洲成人精品中文字幕电影| 成人漫画全彩无遮挡| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美三级亚洲精品| 舔av片在线| 午夜激情福利司机影院| 午夜免费观看性视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久韩国三级中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产高清有码在线观看视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 一个人看的www免费观看视频| 国产一区二区在线观看日韩| 永久网站在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久久久久久精品精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 91狼人影院| 久久99热这里只有精品18| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产v大片淫在线免费观看| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 人妻系列 视频| 天堂中文最新版在线下载 | 国产黄a三级三级三级人| 午夜老司机福利剧场| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 身体一侧抽搐| 亚洲精品国产成人久久av| 国产69精品久久久久777片| 国产毛片a区久久久久| 亚洲成人中文字幕在线播放| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产久久久一区二区三区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 精品久久久久久久久亚洲| av卡一久久| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美精品一区二区大全| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲成人av在线免费| 精品久久久久久久久av| 国产人妻一区二区三区在| kizo精华| 成人国产麻豆网| 国产淫片久久久久久久久| 97超碰精品成人国产| 国产成人91sexporn| 亚洲人与动物交配视频| 日韩av不卡免费在线播放| 一本一本综合久久| 国产熟女欧美一区二区| 插阴视频在线观看视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 欧美成人a在线观看| 黄色一级大片看看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产伦理片在线播放av一区| 超碰av人人做人人爽久久| 在线播放无遮挡| 成人特级av手机在线观看| 精品视频人人做人人爽| 亚洲欧洲日产国产| 美女被艹到高潮喷水动态| av又黄又爽大尺度在线免费看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 一级毛片 在线播放| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| av国产免费在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 一区二区三区精品91| 欧美xxxx性猛交bbbb| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 好男人在线观看高清免费视频| 国产av码专区亚洲av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 亚洲精品自拍成人| 精品人妻熟女av久视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 乱系列少妇在线播放| 国产高潮美女av| 五月天丁香电影| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99久久精品国产国产毛片| 日本免费在线观看一区| 成年人午夜在线观看视频| 成人毛片60女人毛片免费| 国产淫片久久久久久久久| 1000部很黄的大片| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品福利在线免费观看| 晚上一个人看的免费电影| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产精品久久久久久久久免| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 极品教师在线视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 新久久久久国产一级毛片| 久久久成人免费电影| 国产久久久一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 国产综合懂色| 国产男人的电影天堂91| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 视频中文字幕在线观看| 国产精品.久久久| 欧美成人a在线观看| 免费av不卡在线播放| 一级毛片我不卡| 高清午夜精品一区二区三区| 成年人午夜在线观看视频| 国产爱豆传媒在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美xxⅹ黑人| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲成人av在线免费| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久这里有精品视频免费| 男女国产视频网站| 久久久久久久久久成人| 男男h啪啪无遮挡| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日韩欧美精品免费久久| 我的老师免费观看完整版| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 欧美日韩在线观看h| 免费看日本二区| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲av免费在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 精品一区在线观看国产| 日本熟妇午夜| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲电影在线观看av| 国产精品熟女久久久久浪| 交换朋友夫妻互换小说| 久久精品久久久久久久性| 3wmmmm亚洲av在线观看| av在线app专区| 亚洲国产欧美在线一区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 嫩草影院新地址| 亚洲经典国产精华液单| 美女cb高潮喷水在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久国产乱子免费精品| 又爽又黄a免费视频| xxx大片免费视频| 国产在线男女| 精品少妇久久久久久888优播| 三级经典国产精品| 亚洲四区av| 午夜福利高清视频| 热re99久久精品国产66热6| 99热国产这里只有精品6| 中文在线观看免费www的网站| 欧美精品国产亚洲| 亚洲国产精品999| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产成人a区在线观看| 精品久久国产蜜桃| 精品少妇黑人巨大在线播放| 成人无遮挡网站| 身体一侧抽搐| 国产亚洲一区二区精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 久久久久精品久久久久真实原创| 99热这里只有是精品50| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久久久国产网址| 午夜福利视频1000在线观看| 男人舔奶头视频| 晚上一个人看的免费电影| 七月丁香在线播放| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久影院123| 女人久久www免费人成看片| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产在线男女| 色播亚洲综合网| 国产免费福利视频在线观看| 性色av一级| 一区二区av电影网| 男人添女人高潮全过程视频| 男女国产视频网站| 成年版毛片免费区| 国产精品熟女久久久久浪| 免费高清在线观看视频在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩av免费高清视频| 久久久久久久久久成人| 亚洲欧美清纯卡通| av在线观看视频网站免费| 99热这里只有精品一区| 久久久国产一区二区| 91狼人影院| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产视频首页在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲精品成人久久久久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲精品国产色婷婷电影| 五月开心婷婷网| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产黄频视频在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 97在线视频观看| 少妇高潮的动态图| 国产淫片久久久久久久久| 久久国产乱子免费精品| 免费少妇av软件| 超碰av人人做人人爽久久| 人体艺术视频欧美日本| 久久人人爽人人片av| 国产精品av视频在线免费观看| 成人欧美大片| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲av欧美aⅴ国产| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲国产欧美在线一区| 不卡视频在线观看欧美| 五月天丁香电影| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产一区有黄有色的免费视频| 搡老乐熟女国产| 免费av不卡在线播放| 免费黄色在线免费观看| 少妇人妻 视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 日日摸夜夜添夜夜爱| 边亲边吃奶的免费视频| 中文字幕制服av| 啦啦啦在线观看免费高清www| 麻豆成人av视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费大片18禁| 国产午夜福利久久久久久| 男人狂女人下面高潮的视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲三级黄色毛片| 亚洲,一卡二卡三卡| 交换朋友夫妻互换小说| 免费黄网站久久成人精品| 97在线视频观看| .国产精品久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 久久久精品94久久精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩一区二区三区影片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产成人一区二区在线| 亚洲av免费高清在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 美女被艹到高潮喷水动态| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美高清性xxxxhd video| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美最新免费一区二区三区| 99热全是精品| 亚洲精品乱久久久久久| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩亚洲欧美综合| 久久久久精品久久久久真实原创| 午夜视频国产福利| 69av精品久久久久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 偷拍熟女少妇极品色| 日本黄大片高清| 中文字幕制服av| 久久久精品94久久精品| 插逼视频在线观看| 国产精品伦人一区二区| 午夜激情久久久久久久| 国产精品.久久久| 免费在线观看成人毛片| 日韩大片免费观看网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 下体分泌物呈黄色| 亚洲伊人久久精品综合| 久久久久久久久久成人| 简卡轻食公司| 亚洲综合色惰| 在线精品无人区一区二区三 | 精品视频人人做人人爽| 美女内射精品一级片tv| 一区二区三区精品91| 夜夜爽夜夜爽视频| 六月丁香七月| 国产精品成人在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美zozozo另类| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产黄色免费在线视频| 久久久a久久爽久久v久久| 久久6这里有精品| 2022亚洲国产成人精品| 一级爰片在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲真实伦在线观看| 国产综合懂色| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲真实伦在线观看| 青春草视频在线免费观看| 亚洲高清免费不卡视频| 日韩欧美精品v在线| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 美女内射精品一级片tv| 欧美日韩在线观看h| 成人午夜精彩视频在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久亚洲国产成人精品v|