新一代基因編輯工具研究進展

王 瑞，周欣潔，杜熙欽，郝 翟，王 琛，鄒秉杰*，宋沁馨**，周國華

（1中國藥科大學藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，南京 210009；2南京大學生命分析化學國家重點實驗室，南京 210093；3東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床藥學科，南京 210002）

基因編輯（gene editing）是指在活體基因組中，通過基因編輯工具（一般是核酸酶），進行特定地基因序列的剪切刪除、插入或者單個堿基的突變等。人類基因組由兩組31.6 億個堿基的DNA 組成，從胚胎開始，就有很多無法預知的基因組DNA突變發(fā)生，這常常會導致各種基因疾病的產生，例如鐮刀型紅血球疾病、杜氏肌營養(yǎng)不良、早衰癥等［1］。目前已經發(fā)現了有多達7 000種單基因遺傳病，但是其中95%以上都沒有有效的治療方法［2］。基于此，越來越多的基因編輯工具被開發(fā)并在人體內進行初步應用。

傳統的基因編輯技術可以簡單總結為3 個步驟：①基因編輯工具的定位，②通過核酸酶介導的DNA 損傷（一般會產生DNA 雙鏈斷裂DSB），③通過細胞內DNA 損傷修復機制（同源定向修復HDR、非同源末端連接NHEJ 等）介導的DNA 修復，達到基因組刪除、插入、基因點突變的目的［3］?；蚓庉嫻ぞ叩拈_發(fā)可以追溯到1996年，從第一代基因編輯工具鋅指核酸酶（ZFN）的構建開始［4］，2009年出現了第二代基因編輯工具轉錄激活子樣效應子核酸酶（TALEN）［5］，直到第三代基因編輯工具規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（CRISPR）系統的出現［6］，新興基因編輯工具有了突飛猛進的發(fā)展，并成功應用于許多基因遺傳?。ɡ缦忍煨远@、杜氏肌營養(yǎng)不良等）的治療。本文將以基因編輯工具的發(fā)展為脈絡，主要對第三代基因編輯技術之后的新興基因編輯工具的創(chuàng)新與優(yōu)化進行總結評述，即對新一代基因編輯的發(fā)展和應用展開綜述，并對下一代基因編輯工具的開發(fā)與臨床應用進行展望。

1 傳統基因編輯工具

傳統的基因編輯工具，一般是指以產生DNA雙鏈斷裂（DSB）為基礎的基因編輯工具，通常指：第一代鋅指核酸酶（ZFNs）基因編輯系統、第二代轉錄激活子樣效應子核酸酶（transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）基因編輯系統和第三代CRISPR/Cas9基因編輯系統。

1.1 鋅指核酸酶

ZFNs 是由核酸結合蛋白Cys2-His2 鋅指蛋白（ZFP）和核酸內切酶FokⅠ建立的融合蛋白，通過鋅指DNA 結合域的定位和FokⅠ核酸內切酶結構域的二聚形成靶向DNA 雙鏈斷裂。ZFNs 的工作原理見圖1。Kim 等［7］構建出了第1 個鋅指蛋白核酸酶，并在2005年，對人類細胞基因組進行編輯。

圖1 鋅指核酸酶（ZFNs）工作原理[8]（每個鋅指核酸酶識別3 個堿基，當ZFNs 與DNA 結合后，兩個Fok Ⅰ切割結構域會在靶位點形成二聚體，使雙鏈斷裂，進行基因編輯）

1.2 轉錄激活子樣效應子核酸酶

TALENs 技 術的核心 是TALE 蛋白。TALE 蛋白可以識別特定核苷酸序列。與ZFNs 結構類似，TALENs 也是通過TALE 蛋白的DNA 結合域與FokⅠ核酸內切酶結構域的二聚形成靶向DNA 雙鏈斷裂。TALENs的工作原理見圖2。

圖2 轉錄激活子樣效應子核酸酶（TALENs）工作原理[8]（TALE 部分串聯重復的結構可以特異性地識別對應堿基，兩個Fok Ⅰ切割結構域會在靶位點形成二聚體，使雙鏈斷裂，進行基因編輯）

TALENs 于2009年由Becker 等［9］首次發(fā)現，并于2011年在人類細胞進行基因編輯。TALENs 相較于第一代基因編輯工具ZFNs，具有更高的基因編輯效率和更精準的靶向識別功能。目前，ZFNs與TALENs 已成功地應用于編輯體外T 細胞中CCR5 基因以抵御HIV 病毒［10］。然而，這兩種基因編輯工具都需要對編輯的DNA 序列設計特定的核酸酶，還需要進行復雜的組裝，成本高、編輯效率低等都限制了上述基因編輯工具的應用。

1.3 CRISPR/Cas系統

2012年，一種來源于細菌和古細菌免疫系統的規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（CRISPR/Cas）系統被用于基因編輯工作，其工作原理見圖3。Knott等［11］發(fā) 現Cas9 通 過 一 個 特 異 性 識 別DNA 的crRNA 和與Cas9 重復序列幾乎互補的反式激活crRNA（tracrRNA）可以實現與相應的DNA 結合。而crRNA 和tracrRNA 可以融合為一個指導RNA（sgRNA），只需設計gRNA 就可以引導CRISPRCas9 核酸酶與目標DNA 結合來切割DNA。這種既具備靶向定位功能，又具備靶向結合切割功能的核酸酶很快就被開發(fā)用于基因編輯。

圖3 CRISPR 編輯系統工作原理[Cas9靶向切割與sgRNA 互補結合的目標DNA，形成隨機的插入或缺失（indels），通過同源定向修復或非同源末端連接等整合供體DNA，完成基因編輯]

2013年初，Cong 等［12］設計了兩種不同來源的Cas9（分別來自嗜熱鏈球菌和化膿性鏈球菌），首先成功地將CRISPR-Cas9 用于真核細胞的基因組編輯。隨即，CRISPR-Cas9就被用于遺傳疾病的治療。Geurts等［13］利用CRISPR/Cas9對人干細胞中一種與囊腫性纖維化相關聯的基因進行基因治療。

然而，CRISPR/Cas9 系統已被許多研究者報道存在嚴重的脫靶效應，更嚴重的是，以上3 類基因編輯工具都基于DSB，DSB造成的隱患也在被編輯的生物體內不斷被發(fā)現，DNA 雙鏈斷裂的速度超過細胞自身修復損傷的速度就會導致細胞死亡。有多項研究指出CRISPR 系統能激活p53 而引發(fā)DNA 損傷，最終干擾其基因編輯效率［14］；研究還發(fā)現，CRISPR-Cas9還會導致包括大片段缺失在內的各種復雜的染色體結構異常乃至染色體整體缺失［15］。p53 因子在細胞的生長周期中發(fā)揮負調節(jié)的功能，基因組的損傷會被p53 基因識別。而用CRISPR-Cas9 基因編輯細胞后，往往會發(fā)現p53 基因突變，這常常與癌細胞的發(fā)生密切相關。此外，研究人員還發(fā)現，CRISPR 基因編輯可能會激活或抑制具有其他癌癥的相關基因，比如激活KRAS致癌基因。CRISPR-Cas9 還會與DNA-PK 復合物結合，破壞DNA-PK依賴的修復通路導致嚴重的細胞損傷甚至死亡［16］。

基于DSB 帶來不可逆的損傷和細胞死亡，研究人員開始著手于開發(fā)新一代不形成DSB 的基因編輯工具。

2 不依賴DNA雙鏈斷裂的新一代基因編輯工具

2.1 單堿基編輯（base editing，BE）

在CRISPR 編輯系統中，DSB 由Cas9 的雙鏈切割活性導致。為了不產生DSB 達到更精準的基因編輯，2016年Komor 等［17］構建了胞嘧啶堿基編輯器（CBE），將失去切割活性的dead Cas9（dCas9）與胞嘧啶脫氨酶APOBEC 偶聯，通過向導RNA 引導dCas9結合在DNA雙鏈上，再通過脫氨酶將胞嘧啶（C）脫氨基突變?yōu)槟蜞奏ぃ║）。CBE 的構建到完善也經歷了許多波折，一開始CBE1 使用的是完全沒有切割活性只有結合活性的dCas9，U 只存在于RNA 的轉錄過程，DNA 中的U 會激活尿嘧啶糖基化酶（uracil DNA glycosylase，UDG）來修復這一異常，導致編輯效率大打折扣。于是，通過融合抑制UDG 的尿嘧啶糖基化酶抑制子（UGI）來保護編輯后的U。進一步研究人員又對Cas9 進行突變。Cas9 有兩個切割域：HNH 結構域和RuvC 結構域，分別切割DNA 的兩條鏈。一開始的版本使用了完全沒有切割活性的dCas9，為了讓細胞不去修復被編輯的堿基，研究人員想到用dCas9（A840H）切割沒有被編輯的那條鏈，“迷惑”細胞修復機制，細胞會誤以為需要修復的是斷裂的那條鏈，實現所需要的C to T的編輯，這就是目前的CBE4.0。

嘧啶之間的突變實現后，開始著手解決導致更多單基因遺傳病的G to A點突變。然而，自然界中并沒有作用于DNA 的腺嘌呤脫氨酶，Gaudelli等［18］通過細菌抗性篩選的原理開發(fā)出一種定向進化蛋白系統——噬菌體輔助進化技術，將大腸桿菌來源的tRNA 特異性腺苷脫氨酶（TadA），定向進化為對DNA 底物有腺苷脫氨基活性的酶，用于DNA單堿基編輯。這兩種堿基編輯器實現了4種堿基的顛換，解決了60%的點突變遺傳病。單堿基編輯（base editing，BE）系統的工作原理見圖4。

圖4 單堿基編輯系統工作原理[由dCas9（A840H）融合脫氨酶，切割非編輯鏈，在編輯鏈上進行脫氨，完成4種堿基的顛換]

BE 的應用成果也令人欣喜，2021年初，基因編輯公司BEAM 宣布了首個進入臨床的單堿基編輯器體內基因編輯項目VERVE-101，該項目選擇關閉治療雜合子家族性高膽固醇血癥的靶點PCSK9。臨床試驗結果顯示，經過BE 編輯的受試者血液中PCSK9 下降了89%，更重要的是并未觀察到脫靶現象。其他難以攻克的隱性遺傳?。ɡ缦忍煨远@）的治療，也得益于單堿基編輯器的出現，在耳聾小鼠中得到成功應用［19］。

但是，據統計單基因遺傳病只占全部遺傳病中的三分之二，單堿基編輯器只能實現其中兩種堿基顛換。并且，單堿基編輯器會將編輯窗中的C或者A 都進行突變，胞嘧啶堿基編輯器中的胞嘧啶脫氨酶也被報道是導致嚴重脫靶效應［隨機的插入與缺失（indels）］的因素之一。

2.2 先導編輯（prime editing，PE）

2019年，又一突破性的基因編輯工具出現。Anzalone 等［20］開發(fā)出一種“搜索與替換”的基因編輯工具——先導編輯，其工作原理見圖5。PE 主要的結構是nCas9（H840A）蛋白融合逆轉錄酶（reverse transcriptase，RT），并 延 長Cas9 的 向 導RNA，在向導RNA 后半段增加一段逆轉錄模板，命名為pegRNA。當DNA 產生缺口后，逆轉錄酶會按照模板延伸替換掉原來的序列，這就是“搜索與替換”的含義。

圖5 先導編輯系統工作原理[由nCas9（H840A）融合逆轉錄酶，切割非互補鏈，暴露3'flap，逆轉錄酶沿著pegRNA 上的逆轉錄模板延伸出新的DNA，達到精準的替換、插入、刪除與整合]

與上文介紹的BE 不同，PE 中的Cas9 切割的是需要被編輯的那條鏈。當PE 融合蛋白結合到DNA 雙鏈上時，編輯鏈會暴露并被切割形成一個3'flap，沿著pegRNA 上的模板序列合成新的DNA 鏈。同時，5'flap 處的舊DNA 鏈會激活細胞的3'flap-5'flap equilibration 機制裂解5'flap。最后，編輯鏈和非編輯鏈通過錯配修復（mismatch repair，MMR）機制完成整個修復過程。

研究人員進一步對幾個組分都進行優(yōu)化，從PE1.0 開發(fā)到PE5.0。優(yōu)化過程可以概括為：改造pegRNA 為epegRNA 保護其不會在細胞中被裂解；突變逆轉錄酶，增加逆轉錄活性，間接提高編輯效率；抑制DNA 錯配修復（MMR）通路，防止修復后編輯鏈被裂解，降低MMR 相關基因的表達或在編輯鏈修復后再在非編輯鏈上引入切口等。

通過一系列的改進與優(yōu)化，目前PE5.0 可以在細胞中達到30%～60%的編輯效率，實現所有12 種單堿基的自由轉換，小片段的插入與刪除。據報道，PE有望治療89%的遺傳疾病，并陸續(xù)在動植物體推進應用。2021年，拉瓦爾大學的Tremblay等［21］通過PE在體外培養(yǎng)的人類細胞基因組中插入“冰島突變”，旨在降低阿爾茨海默病基因攜帶者發(fā)病率?！氨鶏u突變”是報道過的一種保護性突變，發(fā)現冰島人群中的A673T 突變會降低AD 的發(fā)生。研究人員選擇PE 精確引入A673T 突變并不會破壞附近其他基因，有望防止遺傳性AD。

然而，基于CRISPR 系統的基因編輯工具應用還存在許多限制。首先，這些基于CRISPR 系統的基因編輯工具要實現DNA 定位，主要依賴于前間區(qū)序列鄰近基 序（protospacer adjacent motifs，PAM），人類基因組中只有9.9%的基因存在可以被識別的PAM 基序［22］。其次，PE 由于編輯效率等一系列限制，不能插入長基因組序列，長序列的插入還是需要借助重組酶和DNA 供體，這限制了對多個位點突變的基因編輯。最后，基因編輯工具應用到人體內還需要遞送，FDA 已經批準腺病毒相關病毒作為基因編輯的臨床技術方案。BE 和PE 的主要組分都是CRISPR 融合蛋白，其中PE就有11.4 kb，而腺病毒的基因組只能容納編碼4.7 kb 左右的遺傳物質，CRISPR/Cas 系統融合其他酶所構建的編輯工具難以被遞送。

2.3 多類型基因編輯工具

針對PE 需要被解決的問題，科學家們又開發(fā)了一系列新型基因編輯工具。

以BE 為基礎，有3 種雙堿基編輯工具同時發(fā)表，對胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶進行整合優(yōu)化，開發(fā)了兩種A&C-BEmax 和SPACE 雙堿基編輯器［23-24］。這兩種雙堿基編輯器都成功實現了在一個靶位點C to T 和A to G 的突變。與單堿基編輯器相比，編輯窗口的精確度與編輯效率都得到提升，可以進行額外60個堿基的突變編輯，從而替換更多的氨基酸。接下來，為了滿足建立突變飽和的要求，研究人員還融合ABE 與一種糖苷酶堿基編輯（CGBE）系統，構建了AGBE［25］。AGBE 可以同時誘變一個靶位點進行A to G、C to G 或T 或A這4種突變，是構建突變文庫和基因單核苷酸突變功能研究的強有力工具。這些雙堿基編輯系統的開發(fā)，為構建多種基因突變模型提供了可能。

以PE為基礎，為解決原始PE對大片段基因編輯效率低下的問題，科學家們先后開發(fā)了幾種雙PE基因編輯工具。

以雙pegRNA 為基礎構建的大片段基因編輯工具PEDAR（PE-Cas9-based deletion and repair）［26］和PRIME-Del［27］，通過兩條pegRNA 擴大了基因組刪除的規(guī)模。PEDAR 和PRIME-Del 都可以解決PE 對超過100 bp 的大片段基因組難以編輯的問題，表征了長達10 kb 的高效率缺失。不僅如此，還可以將大片段缺失與小片段插入相結合，實現基因組的重排編程，擴寬PE 的編輯類型與范圍。Anzalone 等［28］開發(fā)出TwinPE。TwinPE 顧名思義，是通過兩個PE編輯器來突破原始單個PE的限制，并成功糾正了亨特綜合征基因突變，在致病基因組中結合Bxb1 重組酶完成了39 kb DNA 片段倒位。同樣的，雙pegRNA 策略開發(fā)的HOPE 也表征了長片段基因編輯的效率與精度［29］。此外，用兩條帶有逆轉錄模板的pegRNA 的GRAND 編輯器，實現了無供體DNA的大片段基因組插入［30］。

長片段基因組的重新編程使同時修正多個致病位點成為可能，并且，長片段序列的替換與糾正為罕見基因疾病的基因治療增加了通用性與便捷性。但是，顯而易見，多類型基因編輯工具的開發(fā)思路都是通過增加一個編輯器或增加向導RNA 的方法，過大過復雜的基因編輯工具更是難以被遞送進入人體。

總而言之，通過以上工作，基因編輯工具可以實現的基因編輯類型已經涵蓋了所有單堿基的自由轉化、突變，DNA 片段的插入、刪除、替換等，基本滿足了基因治療的應用需求。但是，基因編輯工具還有兩個限制并未解決，PAM 的限制使其不能靶向全部人類基因組，基因編輯工具大小的限制也是臨床應用的一大瓶頸。

3 其他新一代基因編輯工具

除了開發(fā)不產生DSB 的新型基因編輯工具，科學家們還在對傳統基因編輯工具的序列限制和體型限制進行改進優(yōu)化。

3.1 無PAM限制的基因編輯工具

為了打破PAM 序列的限制，研究者們開展了很多工作。Christie 等［31］嘗試對野生型Cas9 突變，構建出了首個幾乎可以識別整個基因組序列的變體SpRY，并于細胞系中驗證SpRY 可以識別幾乎所有位點，PAM 序列特征為NNN（N 是任意堿基），這一工作在基因編輯和分子克隆中都展現了巨大潛力。

但是SpRY 變體對嘧啶類位點的親和力還有待提高，并且從Cas9 延伸的變體都存在體積太大難以遞送的問題。Huang 等［32］繼續(xù)通過前文提及的噬菌體輔助連續(xù)演化系統（PACE），對小型的Cas9 系統進行優(yōu)化，改造后的變體突破了傳統PAM限制，可以識別的位點拓展到N4YN（Y是C或T），且在多種細胞系中都表現出與傳統Cas9 變體相當的編輯效率與更小的脫靶風險。

除了對野生型Cas9 進行蛋白改造，科學家們也在尋找其他的基因編輯酶。

武漢大學Shi 等［33］報道了AtCas9。AtCas9 來源于嗜熱菌，是首個被報道的天然廣譜PAM 的基因編輯器。

南京大學Xu 等［34］將目光聚焦到了一種可以特異性識別flap 結構的核酸內切酶FEN1，將之與ZFNs和TALENs編輯器中的FokⅠ內切酶融合，構建出了新一代無序列限制的，結構識別的基因編輯工具SGN。研究人員進一步改進，去除FokⅠ內切酶，僅通過FEN1 的三堿基重疊切割能力，優(yōu)化到完全無PAM 限制，實現精準單核苷酸切割的基因編輯工具HpSGN［35］，其工作原理見圖6。更值得關注的是，FEN1酶的超小型結構（約300個氨基酸殘基）是目前CRISPR/Cas 系統融合蛋白無法達到的。這也給基因編輯領域開拓了新思路，開發(fā)內源性的核酸酶作為基因編輯工具。

圖6 HpSGN 編輯系統工作原理（hpDNA 通過發(fā)夾結構與向導DNA 組成，靶向編輯鏈，FEN1 會特異性識別hpDNA 與編輯鏈形成的三堿基重疊結構，進行切割，完成基因編輯）

3.2 小型基因編輯工具

如何實現精準有效的遞送是基因編輯工具應用在人體的最后一公里。為了早日實現臨床應用與提高遞送效率，科學家們也在遞送方面做出了很多努力。前文說到，CRISPR 相關融合蛋白構建的基因編輯系統很難被遞送，所以開發(fā)更小型易于遞送的工具是很必要的。目前的研究主要從縮小Cas蛋白和拆分融合蛋白兩個方向推進。

從構建更小的基因編輯蛋白方向，除了上文提過的Huang 等［32］構建的無PAM 限制的小型基因編輯工具，和南京大學Xu 等［35］構建的只有300 個氨基酸殘基的SGN 基因編輯工具，科學家們還構建了更小的CRISPR相關蛋白。

上?？萍即髮WWu等［36］表征了極小型的CRISPR 相關蛋白AsCas12f1，該蛋白僅有422 個氨基酸殘基，是當時報道的最小的CRISPR 相關蛋白。無獨有偶，同一天發(fā)表的另外一個研究，Kim 等［37］也開發(fā)出迷你版的CRISPR 系統Cas12f1，該蛋白只有529 個氨基酸殘基。這兩種迷你基因編輯工具給CRISPR 相關基因編輯工具的遞送與應用提供了新的思路。不過目前Cas12f 還是無法達到精準基因編輯工具的水平，在人類細胞系中編輯效率最高為30%左右，進一步提高編輯效率、減少脫靶編輯，真正達到臨床應用的基因編輯系統標準還有許多工作要做。

清華大學Tsuchida 等［38］開發(fā)了CasX，兼顧了小型與高效的基因編輯。CasX 大小為980 個氨基酸殘基，但是在細胞中內源位點的編輯效率可以達到50%，媲美常用的Cas9 核酸酶，這是目前小型Cas9 基因編輯工具難兼顧的，有望替代Cas9 在人體內進行下一步的基因編輯。

康奈爾大學的Schuler等［39］開發(fā)了目前世界上最小的Cas9 蛋白——IscB。研究人員對Cas9 的遠古祖先Isc 家族進行解析與蛋白突變，IscB 大小僅為傳統Cas9 蛋白的三分之一，還保留了核酸酶活性，但是細胞中的編輯效率還有待驗證。這種返璞歸真的研究方向，不僅發(fā)現了更小體型的Cas9蛋白“祖先”，通過研究Isc 蛋白的電鏡結構，還發(fā)現了減少Cas9基因編輯系統脫靶編輯的方法。

從拆分融合蛋白的方向，也有幾個重要的發(fā)現。中山大學Zhi 等［40］通過內涵肽拆分策略，將PE 系統拆分為N 端和C 端兩部分，并通過雙腺相關病毒（AAV）系統遞送，構建了Split-inteinPE2 系統，并在小鼠眼底進行了應用。隨后美國哈佛大學麻省總醫(yī)院與德國慕尼黑工業(yè)大學Grünewald等［41］也合作發(fā)表了拆分的PE 蛋白。研究人員在實驗中發(fā)現，PE 系統的逆轉錄酶無論融合在Cas9蛋白的N 端、C 端還是中間，都不會影響PE 的編輯能力，這一發(fā)現為PE 系統的拆分提供了思路。于是，研究人員直接將Cas9 與逆轉錄酶拆開分別遞送，構建了Split-PE2ΔRH 系統。這種直接拆分策略比內涵肽拆分策略的編輯效率更高，也不再需要優(yōu)化融合蛋白和蛋白接頭，僅需分別優(yōu)化Cas9蛋白與逆轉錄蛋白就可以高效地構建PE 蛋白突變體，為后續(xù)的研究提高了效率。

除了拆分PE 融合蛋白，拆分過長的pegRNA也是優(yōu)化思路。目前已經報道了將pegRNA 拆分后環(huán)化和增加MS2 適體，增加suntag 等策略［42］。這種思路可以防止過長的pegRNA 在體內被降解，還增加了pegRNA的多樣性與通用性。

西北大學的Huang 等［43］還另辟蹊徑，基于構建球形核酸SNA 的經驗，構建了一種CRISPR 球形核酸，CRISPR 球形核酸具有與球型核酸同樣不需要載體僅孵育即可遞送的優(yōu)點，這種開創(chuàng)性的想法為CRISPR 的優(yōu)化與應用提供了一個全新的思路。

這些小型基因編輯工具的優(yōu)化都是為了滿足在人體內的應用，使其能夠被腺病毒相關病毒所遞送。但是，無論是縮小蛋白還是拆分基因編輯工具，都不可避免地犧牲基因編輯效率與可編輯類型。所以，構建出一個突破各方面限制的基因編輯工具，走好基因治療應用的最后一公里，在遞送方面還需不斷優(yōu)化和改進。

4 基因編輯工具的安全性

盡管基因編輯技術被譽為21世紀生命科學領域的突破性革命，但是其安全性和倫理問題仍備受爭議。

4.1 基因編輯工具風險

基因編輯技術的開發(fā)致力于從人體胚胎進行應用，一次性解決致病基因。然而，目前并未開發(fā)出完全無脫靶風險的編輯工具。多篇文章報道對CRISPR/Cas9 相關編輯系統進行全基因組脫靶分析，被編輯的動物體內許多原癌基因、抑癌基因出現有害突變。

不僅是體內基因編輯難以應用，即使目前FDA 已經批準了一系列體外基因編輯項目的臨床應用，但是體外基因編輯后的CAR-T 細胞也被多個研究報道了會對人體造成基因毒性。2021年，由于在輸注了CAR-T 細胞的病人體內發(fā)現了由基因編輯導致的染色體易位，FDA 緊急叫停了臨床研究。

2022年7月，首個獲批臨床試驗的基因編輯藥物VERVE-101 在新西蘭完成了首例患者給藥，利用堿基編輯器沉默PCSK9致病基因，這也是第1個直接在體內進行基因編輯的臨床項目。但是FDA在2022年11月突然暫停臨床實驗，且雙方都沒有公布具體原因。后續(xù)FDA 要求公司提供更多數據，主要是包括編輯風險，脫靶分析和是否會遺傳給后代的證明。并且一位接受CRISPR 基因編輯療法的DMD 患者也不幸死亡，具體原因也并不清晰。

隨著基因編輯藥物相關脫靶致癌風險的不斷發(fā)現以及臨床試驗的屢次叫停，基因編輯技術的開發(fā)與應用蒙上了陰影，但是這也為基因編輯領域的空白地帶研究給出了新的方向與動力。即使基因編輯工具的風險因素不斷被提出，但是針對檢測與表征基因編輯工具的脫靶程序也相繼在研發(fā)，不斷有更安全更精準可控的基因編輯工具被提出，科學家們也在著手建立更全面的基因治療安全標準，打破基因編輯工具在體內的應用壁壘，推動基因治療能夠早日安全應用。

4.2 基因編輯工具的倫理問題

基因編輯的倫理問題伴隨著基因編輯技術的提出就一直備受爭議，毫無疑問這是一把雙刃劍。

從適用范圍來說，倫理委員會與研究人員達成的共識是，基因編輯技術可以應用的是已經有證明是明確單獨決定因素的致病位點，這種疾病已經帶來了極大痛苦。但是，目前基因編輯的相關研究成果都證明了在一些相關基因編輯后的良好治療結果（例如HIV），這就引發(fā)了倫理與科學的思考。

從自然進化來說，對于胚胎的基因編輯，宣稱從根本上治療遺傳疾病，但是這無疑是違背自然規(guī)律的，打破了人與自然的平衡。并且，基因編輯工具的風險還并未研究透徹，無法預期的脫靶也會隨著胚胎基因編輯整合到后代中，無論任何后果都難以想象。

因此，如何利用好這把雙刃劍去攻克基因疾病，正是一代又一代基因編輯工具開發(fā)的初衷。掌握好這項技術也許能夠給無數罕見病患者家庭帶來生的希望，但是真正應用于臨床依舊任重道遠。

5 總結與展望

基于不同原理的基因編輯工具比較見表1。基因編輯技術的兩位發(fā)明者在2020年獲得諾貝爾化學獎，基因編輯技術被寄予厚望。面對95%沒有有效治療藥物的罕見病，基因編輯工具的開發(fā)與驗證為這些罕見病帶來了曙光。從形成DNA 雙鏈斷裂的基因編輯工具，到能夠精確突變一個位點的單堿基編輯器和引導編輯器等，對人類基因組的改變與操縱也漸漸成為現實。在科學家們的不斷努力下，對基因編輯工具不斷優(yōu)化，在突破序列的限制上、編輯效率的優(yōu)化上、編輯類型的拓展上以及遞送工具的開發(fā)設計和臨床試驗的推進上，基因編輯技術的發(fā)展似乎已經勢不可擋。

表1 基于不同原理的基因編輯工具比較

新一代基因編輯工具，即可以實現全部基因組編輯、實現任意類型插入刪除突變的易于應用以及能夠減少毒性的基因編輯工具。新工具的不斷開發(fā)，可以看到正在向這個理想的方向接近。同時，構建能夠高通量檢測基因編輯工具脫靶水平和編輯效率的平臺也在進一步研究中，有望對基因編輯毒性的空白領域進行探索。

積極研發(fā)能夠安全遞送的基因編輯工具與遞送系統，完成基因治療的最后一公里。完善相關倫理與法律監(jiān)管問題，攻克罕見病，是未來科學家們共同努力的方向。