一株諾西肽產(chǎn)生菌的發(fā)掘及發(fā)酵條件優(yōu)化

孫啟航，徐允聰，吳羚銳，容佳樂，王彥文，曹玉丹，羅 晨，吳旭日

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)教研室，南京 211198）

抗生素是對(duì)抗病原微生物感染的重要武器，為公共健康事業(yè)做出了巨大貢獻(xiàn)［1-3］。然而，抗生素的濫用使得細(xì)菌耐藥性傳播速度迅速增長(zhǎng)［4-5］。因此，尋找具有新骨架、新機(jī)制的化合物迫在眉睫。

諾西肽是一種核糖體翻譯后修飾肽［6］，對(duì)革蘭氏陽性病原體的各種耐藥株，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌具有極強(qiáng)的抗菌活性［7-8］，由于其抗菌機(jī)制新穎受到廣泛的關(guān)注［9］。但是，因?yàn)槿狈w內(nèi)活性，諾西肽的成藥研究一直受到阻礙［10］。然而，同樣屬于硫肽類抗生素的諾卡沙星Ⅰ則具有較好的體內(nèi)活性［11］，其活性主要?dú)w功于結(jié)構(gòu)中的特殊糖基——二甲氨基葡萄糖，該糖基的存在一定程度上增加了溶解度，有助于藥物在體內(nèi)的分布，從而具有較好的體內(nèi)活性。然而，諾卡沙星Ⅰ的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差的缺陷限制了其成藥開發(fā)［12］，盡管對(duì)諾卡沙星Ⅰ的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了各種修飾［13-15］，但由于諾卡沙星Ⅰ的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和有限的修飾位點(diǎn)，其成藥性差這一難題仍未解決。在比較了諾西肽與諾卡沙星Ⅰ的結(jié)構(gòu)后（圖1），諾西肽由于豐富的可修飾位點(diǎn)及良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性使其成為了發(fā)現(xiàn)具有體內(nèi)活性的新類似物的合適模型。

Figure 1 Structural comparison of nosiheptide and nocathiacin I

隨著基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，以及公共數(shù)據(jù)庫中可用基因組數(shù)據(jù)的增加，生物合成基因簇的挖掘成為了獲得新天然產(chǎn)物的常用手段［16-17］。本研究從諾西肽的生物合成基因簇出發(fā)，對(duì)可能的諾西肽衍生物生物合成基因簇進(jìn)行搜索，以獲得具有更好抗菌活性和理化性質(zhì)的衍生物。

1 材 料

1.1 試 劑

乙腈（色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?；甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲醇（分析純，蘇州亞盛藥業(yè)有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

LC-MS（日本島津公司）；凝膠成像儀（上海天能生命科學(xué)有限公司）；ODS色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm，日本YMC公司）；高速離心機(jī)（美國賽默飛世爾公司）；Bruker Avance 500MHz 核磁共振波譜儀（德國布魯克公司）；制備液相（美國Waters公司）。

1.3 菌 株

Actinoalloteichussp. AHMU CJ021 購自中國普通微生物菌種保藏中心。

2 方 法

2.1 基因組數(shù)據(jù)挖掘諾西肽衍生物的生物合成基因簇

將S.actuosusATCC 25421 諾西肽生物合成基因簇中15個(gè)核心生物合成基因［18］用作探針在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，含有13 個(gè)或以上相似基因且包含編碼諾西肽前體肽的關(guān)鍵基因nosM［19］的生物合成基因簇被用于進(jìn)行antiSMASH 分析［20］推測(cè)可能的代謝產(chǎn)物。

2.2 菌株的發(fā)酵

28 ℃條 件 下，Actinoalloteichussp. AHMU CJ021 培養(yǎng)于ISP2 固體培養(yǎng)基以產(chǎn)生孢子。將孢子懸浮液50 μL 接種到液體ISP2 培養(yǎng)基50 mL 中，28 ℃、220 r/min 下培養(yǎng)2 d 以產(chǎn)生種子培養(yǎng)物。將種子培養(yǎng)液1 mL 分別接種于50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基SM1（大豆粉10 g/L、葡萄糖18 g/L、Na2SO41 g/L、CaCO30.2 g/L）、SM5（蛋白胨20 g/L、牛肉浸膏8 g/L、葡萄糖15 g/L、甘油10 g/L、CaCO30.2 g/L、）、SM25（蛋白胨10 g/L、麥芽浸膏21 g/L、甘油40 g/L）、SM27（可溶性淀粉15 g/L、K2HPO40.4 g/L、蛋白胨4 g/L、NaCl 0.4 g/L、牛肉浸膏1 g/L、MgSO40.6 g/L、KNO31 g/L、FeSO40.01 g/L）和SM31（酵母提取物9 g/L、蛋白胨1.8 g/L、葡萄糖20 g/L、K2HPO41 g/L、MgSO40.5 g/L、pH 4.5），進(jìn)行單菌多次級(jí)代謝產(chǎn)物（one strain many compounds，OSMAC）策略分析。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物的分離與鑒定

發(fā)酵7 d后，加入等體積甲醇，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)行LC-MS 檢測(cè)。以10% ~ 90%的乙腈洗脫25 min，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)190 ~ 330 nm。MS 檢測(cè)參數(shù)為：負(fù)電離模式，接口溫度295 °C，保護(hù)氣12 L/min，干燥氣體氮?dú)饬髁? L/min，霧化器壓力206.85 kPa，噴嘴電壓1.5 kV，毛細(xì)管電壓4 kV，掃描范圍m/z100 ~ 2 000。用Waters 制備液相對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行純化，制備30 mg 純品（純度＞ 99.7%）后在核磁共振波譜儀上進(jìn)行分析。

2.4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白NocP的引入

利用特異性引物從Nocardiasp. ATCC 202099擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白NocP的基因nocP，PCR 產(chǎn)物用NdeⅠ和EcoRⅤ雙酶切并連接到pSET152E 載體（pSET152E為帶有紅霉素啟動(dòng)子的pSET152載體）上。將重組質(zhì)粒通過結(jié)合轉(zhuǎn)移［21］導(dǎo)入Actinoalloteichussp.AHMU CJ021中。

2.5 單因素分析確定發(fā)酵培養(yǎng)基成分

Actinoalloteichussp. AHMU CJ021 原發(fā)酵培養(yǎng)基成分為20 g/L 蛋白胨、8 g/L 牛肉浸膏、15 g/L 葡萄糖、10 g/L 甘油和0.2 g/L CaCO3。用單一的碳源、氮源、無機(jī)鹽和氨基酸替換原發(fā)酵培養(yǎng)基成分，并通過HPLC 檢測(cè)諾西肽產(chǎn)量。替換的6 種碳源為麥芽糖、葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米淀粉和甘油，質(zhì)量濃度為40 g/L。氮源為牛肉浸膏、蛋白胨、酵母提取物、大豆粉、玉米漿和（NH4）2SO4，質(zhì)量 濃 度 為20 g/L。無 機(jī) 鹽 為CaCl2、FeSO4、KCl、MgCl2、MgSO4和ZnCl2，質(zhì)量濃度為0.2 g/L。氨基酸為精氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和谷氨酸，質(zhì)量濃度為0.2 g/L。

2.6 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)中獲得的5種最佳營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了12 組5 因素2 水平的Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)，利用Design Expert 10.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定對(duì)諾西肽產(chǎn)量有顯著影響的成分，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面法（CCD）優(yōu)化培養(yǎng)基

通過20 次3 因素5 水平的CCD 實(shí)驗(yàn)對(duì)Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)得出的對(duì)諾西肽產(chǎn)量有顯著影響的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行優(yōu)化。利用Design Expert 10.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算各營(yíng)養(yǎng)成分的最佳濃度，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié) 果

3.1 諾西肽類似物的生物合成基因簇

經(jīng)過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)共有5 個(gè)菌株中含有13 個(gè)及以上的諾西肽核心生物合成基因，且包含編碼諾西肽前體肽的關(guān)鍵基因nosM。同時(shí)用antiSMASH 定位這些菌株中的諾西肽生物合成基因簇并分析其中是否含有糖基轉(zhuǎn)移酶NocS1 的相似蛋白。符合條件的基因簇及其宿主菌見表1。

結(jié)果顯示，僅有Actinoalloteichussp. AHMU CJ021 基因簇中的ctg1-102與糖基轉(zhuǎn)移酶NocS1 的氨基酸序列具有43.3%的同源性，且該基因簇包含諾西肽生物合成的15 個(gè)關(guān)鍵生物合成基因（表2）。推測(cè)該菌株具有產(chǎn)生糖基化諾西肽的潛力，該糖基化衍生物可能具有與諾卡沙星Ⅰ相似的較好的體內(nèi)活性。

3.2 Actinoalloteichus sp. AHMU CJ021 發(fā)酵產(chǎn)物的檢測(cè)

使用SM1、SM5、SM25、SM27和SM31發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)Actinoalloteichussp. AHMU CJ021 進(jìn)行發(fā)酵，利用LC-MS 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見圖2。結(jié)果表明5 種培養(yǎng)基的提取物在15.1 min 時(shí)都產(chǎn)生了與諾西肽標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)應(yīng)的峰（化合物1）以及分子離子峰m/z1 220.139 2（M-H）-。該產(chǎn)物在SM5 發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)率最高，達(dá)到了8.23 mg/L。核磁共振分析表明，化合物1與諾西肽具有一致的結(jié) 構(gòu)［22］，為 同 一 物 質(zhì)，證 明Actinoalloteichussp. AHMU CJ021為一株諾西肽產(chǎn)生菌。然而，盡管存在糖基轉(zhuǎn)移酶基因ctg1-102，卻并沒有在發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)到糖基化諾西肽。通過RT-PCR對(duì)Actinoalloteichus sp. AHMU CJ021 諾西肽生物合成基因簇中各基因的轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，所有與諾西肽生物合成有關(guān)的基因，包括存在其簇內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因ctg1-102均能正常轉(zhuǎn)錄，從而排除了因糖基轉(zhuǎn)移酶基因沉默導(dǎo)致的糖基化諾西肽缺失。

Table 1 AntiSMASH analysis of screened strains by genome mining

Table 2 Deduced functions of genes in the predicted glycosylated nosiheptide biosynthetic gene cluster of Actinoalloteichus sp.AHMU CJ021

Figure 2 OSMAC strategy for the fermentation of Actinoalloteichus sp. AHMU CJ021

3.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白NcoP的調(diào)控效應(yīng)

nosP在S. actuosusATCC 25421 的諾西肽生物合成基因簇中編碼SARP家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NosP，可激活簇內(nèi)各基因的轉(zhuǎn)錄［23-24］。在諾卡沙星Ⅰ的生物合成基因簇中，NocP 作為NosP 的同源物，發(fā)揮同樣的轉(zhuǎn)錄激活功能［25］。因此推測(cè)存在于Actinoalloteichussp. AHMU CJ021 諾西肽生物合成基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因ctg1-102可能無法被NosP 有效激活，但由于ctg1-102與nocS1較高的相似性，ctg1-102的激活可能受到NocP 調(diào)控。因此，將NocP 在Actinoalloteichussp. AHMU CJ021 中 異源表達(dá)可能會(huì)激活糖基化諾西肽的產(chǎn)生。然而，通過穿梭載體pSET152E 將nocP導(dǎo)至Actinoalloteichussp. AHMU CJ021 異源表達(dá)后仍未產(chǎn)生糖基化諾西肽（圖3-A）。

盡管預(yù)期的糖基化諾西肽沒有產(chǎn)生，但是在比較Actinoalloteichussp. AHMU CJ021 與S. actuosusATCC 25421 的諾西肽生產(chǎn)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，Actinoalloteichussp. AHMU CJ021 發(fā)酵得到的諾西肽具有更高的純度（圖3-B），其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，一種末端脫氫丙氨酸缺失的諾西肽類似物［26］，含量?jī)H為2.8%（保留時(shí)間14.3 min），遠(yuǎn)低于S. actuosusATCC 25421（28.63%）。因此該菌株可作為生產(chǎn)高純度諾西肽的生產(chǎn)菌株。

Figure 3 Effects of NocP on fermentation extractive of Actinoalloteichus sp. AHMU CJ021 and S. actuosus ATCC 25421

3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的單因素分析

不同的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生具有較大影響［27-28］。本研究采用單因素法研究了不同碳源、氮 源、無 機(jī) 鹽、氨 基 酸 對(duì)Actinoalloteichussp. AHMU CJ021 諾西肽產(chǎn)量的影響。圖4 表明，4 類營(yíng)養(yǎng)因素中適合諾西肽發(fā)酵的成分為葡萄糖、酵母提取物、牛肉膏、酪氨酸及KCl。

3.5 基于Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法的諾西肽發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)［11，29］被用于確定對(duì)諾西肽產(chǎn)量有顯著影響的營(yíng)養(yǎng)成分。在對(duì)單因素分析篩選出的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了12 組5 因素2 水平的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，諾西肽的最低產(chǎn)量和最高產(chǎn)量分別為3.26 和59.57 mg/L（表3）。且葡萄糖（P＜ 0.01）、牛肉浸膏（P＜ 0.05）和酵母提取物（P＜ 0.05）對(duì)諾西肽的產(chǎn)量有顯著影響。

通過CCD對(duì)PB實(shí)驗(yàn)中得出的3種營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了3因素5水平的20組實(shí)驗(yàn)［30-31］，結(jié)果如表4。

擬合的二階回歸方程為：

其中，Y表示諾西肽的產(chǎn)量（mg/L），A、B 和C 分別表示葡萄糖、牛肉浸膏和酵母提取物的質(zhì)量濃度（g/L）。

采用ANOVA 評(píng)價(jià)CCD 產(chǎn)生的模型的合理性，R2為0.99 表明該模型的結(jié)果可信度為99%。其他相關(guān)參數(shù)例如PredR2（0.98）、AdjR2（0.94）和Adeq 精度（27.34 ＞ 4）均表明二階回歸方程及其應(yīng)用模型的合理性。同時(shí)，F(xiàn)檢驗(yàn)計(jì)算出該模型的P＜ 0.001，表明該模型在統(tǒng)計(jì)分析中具有顯著性。為了驗(yàn)證各變量統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)葡萄糖（A）、牛肉浸膏（B）以及酵母提取物（C）進(jìn)行F檢驗(yàn)。如圖5所示，葡萄糖和牛肉浸膏具有極顯著的線性和平方效應(yīng)（P＜ 0.001）。酵母提取物的平方效應(yīng)C2（P＜ 0.001）具有顯著性，而交互組AB、AC、BC 的顯著性不明顯，在二階回歸方程中可以忽略。因此，葡萄糖、牛肉浸膏和酵母提取物是影響諾西肽產(chǎn)生的重要因素，對(duì)于Actinoalloteichussp. AHMU CJ021諾西肽的產(chǎn)生有重要影響。

Figure 4 Effects of nutritional factors on the production of nosiheptide (± s, n = 3)

Table 3 Effects of variables on nosiheptide production using P-B design

Table 4 Experimental design and results of central composite design

Figure 5 Response surface plots for optimized nosiheptide production

3.6 諾西肽最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基的驗(yàn)證

通過回歸方程計(jì)算出諾西肽理論最高產(chǎn)量為56.84 mg/L，對(duì)應(yīng)的葡萄糖質(zhì)量濃度為28.16 g/L，牛肉浸膏質(zhì)量濃度為21.43 g/L，酵母提取物質(zhì)量濃度為19.87 g/L。用該培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵后，得到的諾西肽為58.73 mg/L，副產(chǎn)物含量?jī)H0.96%，與理論值相近，比原始發(fā)酵培養(yǎng)基SM5 的產(chǎn)量提高了約6倍。

4 討 論

盡管異源表達(dá)調(diào)控蛋白NocP，通過基因組數(shù)據(jù)挖掘定位的Actinoalloteichussp.AHMU CJ021 仍未產(chǎn)生預(yù)期的糖基化諾西肽。在排除基因沉默的情況下，可能負(fù)責(zé)糖基模塊生物合成的基因與該基因簇的調(diào)控系統(tǒng)不兼容，因此異源表達(dá)不起作用。然而，本研究發(fā)現(xiàn)該菌株所產(chǎn)生的諾西肽在純度方面優(yōu)于諾西肽產(chǎn)生菌S. actuosusATCC 25421。通過響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件后，產(chǎn)量提高了約6倍。在細(xì)菌耐藥性傳播如此嚴(yán)重的時(shí)代，這為研究諾西肽類似物以解決其水溶性和體內(nèi)活性較差的問題奠定了研究基礎(chǔ)。

5 結(jié) 論

雖然預(yù)期的糖基化衍生物無法獲得，但是由于Actinoalloteichussp.AHMU CJ021 發(fā)酵生產(chǎn)諾西肽的副產(chǎn)物含量遠(yuǎn)低于常用的諾西肽生產(chǎn)菌株S. actuosusATCC 25421。通過響應(yīng)面法優(yōu)化后，諾西肽產(chǎn)量達(dá)58.73 mg/L，副產(chǎn)物含量?jī)H0.96%，本研究認(rèn)為該菌可以成為工業(yè)化生產(chǎn)高純度諾西肽的合適候選菌株。