UPLC-MS/MS法測(cè)定利奈唑胺原料和葡萄糖注射液中的疊氮類遺傳毒性雜質(zhì)

彭詩雁，陳 華，尹 婕*

（1中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 211198；2中國食品藥品檢定研究院，國家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102629）

利奈唑胺是一種人工合成唑烷類抗菌藥，主要用于治療革蘭氏陽性球菌引起的感染，包括醫(yī)院獲得性肺炎、社區(qū)獲得性肺炎、復(fù)雜性皮膚和皮膚軟組織感染以及耐萬古霉素腸球菌感染等，其結(jié)構(gòu)式見圖1。利奈唑胺抗菌機(jī)制為通過與30S和50S核糖體亞基上的rRNA結(jié)合以抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，其優(yōu)點(diǎn)在于不易與其他機(jī)制相同的抗菌藥產(chǎn)生交叉耐藥性，且在體外亦不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性［1］。目前，《中華人民共和國藥典》（2020年版）并未收載利奈唑胺，國外藥典僅有《美國藥典》（USP）收載了利奈唑胺原料藥。

利奈唑胺的一種合成途徑是以嗎啉和3，4-二氟硝基苯為起始原料，使用疊氮試劑，從而生成合成中間體（R）-5-（疊氮甲基）-3-［3-氟-4-（4-嗎啉基）苯基］-2-唑烷酮（利奈唑胺USP 雜質(zhì)A，結(jié)構(gòu)見圖1）［2］。采用Derek Nexus 和Sarah Nexus 軟件對(duì)利奈唑胺USP雜質(zhì)A進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系評(píng)估，結(jié)果均為陽性且評(píng)估報(bào)告顯示該雜質(zhì)警示結(jié)構(gòu)為疊氮基團(tuán)。后根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）于2017年發(fā)布的《評(píng)估和控制藥物中DNA反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)指南M7（R1）》［3］對(duì)利奈唑胺USP雜質(zhì)A進(jìn)行體外鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames 試驗(yàn)），試驗(yàn)結(jié)果呈陽性，表明其具有體外致突變性，為第二類遺傳毒性雜質(zhì)，故需嚴(yán)格控制其含量?！独芜虬房菇Y(jié)核治療專家共識(shí)》［4］建議使用利奈唑胺治療療程不超過24 個(gè)月，而《評(píng)估和控制藥物中DNA 反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)指南M7（R1）》中根據(jù)藥物暴露周期科學(xué)地控制遺傳毒性雜質(zhì)含量而提出的可接受攝入量及限度的計(jì)算方法，采用毒理學(xué)關(guān)注閾值（threshold of toxicological concern，TTC）10 μg/d 作為每日可接受攝入量，利奈唑胺每日最高服用劑量應(yīng)不大于1 200 mg，故計(jì)算得利奈唑胺雜質(zhì)A限度為8.3 ng/mL。

Figure 1 Chemical structures of linezolid(A) and linezolid USP impurity A (B)

國內(nèi)現(xiàn)有的利奈唑胺有關(guān)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和USP 中并未將利奈唑胺USP 雜質(zhì)A 作為特定雜質(zhì)控制。因此，本研究擬建立一種檢測(cè)利奈唑胺原料及葡萄糖注射液中痕量遺傳毒性雜質(zhì)利奈唑胺USP雜質(zhì)A的高靈敏度分析方法，以保證利奈唑胺原料及其葡萄糖注射液中遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)雜質(zhì)的可控性。

利奈唑胺有關(guān)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均采用高效液相色譜法檢測(cè)其原料及制劑中的有關(guān)物質(zhì)，耗時(shí)較長且靈敏度較低，難以實(shí)現(xiàn)利奈唑胺遺傳毒性雜質(zhì)的痕量檢測(cè)。而液相和質(zhì)譜檢測(cè)器聯(lián)用可具有更高的選擇性和靈敏度，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，適用于痕量遺傳毒性雜質(zhì)的檢測(cè)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

乙腈（LC-MS 級(jí)，美國Honeywell 公司）；甲酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；去離子水（Milli-Q純水儀）；（R）-5-（疊氮甲基）-3-［3-氟-4-（4-嗎啉基）苯基］-2-唑烷酮（純度：99.88%，批號(hào)：K1905171，中國Aladdin 公司）；利奈唑胺原料［江蘇正大豐海制藥有限公司（批號(hào)：2112012）；江蘇豪森制藥股份有限公司（批號(hào)：LZ-220201）］；利奈唑胺葡萄糖注射液（江蘇正大豐海制藥有限公司；批號(hào)：1901081、1901082、1901091；規(guī)格：300 mL，含利奈唑胺0.6 g與葡萄糖15.072 g）。

1.2 儀 器

Waters I Class/Xevo TQ-S UPLC-MS/MS（美 國Waters 公司）；十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；超純水儀（美國Millipore公司）。

2 方 法

2.1 液相條件

色 譜柱 為Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液（60∶40），等度洗脫；流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃；進(jìn)樣盤溫度為10 ℃；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

掃描方式：電噴霧（ESI）離子源，正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.20 kV；電噴霧離子源溫度150 ℃；去溶劑溫度：500 ℃；去溶劑氣流速：1 000 L/h；錐孔氣流速：150 L/h；MRM參數(shù)見表 1。

Table 1 MS/MS acquisition parameters of linezolid USP impurity A

2.3 溶液制備

稀釋劑：取水與乙腈，以體積比60∶40 混合均勻，即得。

對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取利奈唑胺USP雜質(zhì)A適量，加稀釋劑溶解并稀釋制成每毫升中含利奈唑胺USP雜質(zhì)A 160 ng的溶液。

對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加稀釋劑定量稀釋制成每毫升中含利奈唑胺USP 雜質(zhì)A 8 ng的溶液。

供試品溶液：精密稱取利奈唑胺原料及量取利奈唑胺葡萄糖注射液適量，分別加稀釋劑溶解并稀釋制成每毫升中含利奈唑胺約1 mg的溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：精密量取利奈唑胺葡萄糖注射液約5 mL 置于10 mL 量瓶中，精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL，加稀釋劑至刻度，搖勻。

線性系列對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加稀釋劑定量稀釋制成利奈唑胺USP 雜質(zhì)A 質(zhì)量濃度分別為12、10.8、9.6、8、6.4、5.2 和4 ng/mL的溶液。

檢出限（LOQ）及定量限（LOD）溶液：精密量取對(duì)照溶液適量，加稀釋劑定量稀釋制成質(zhì)量濃度約0.04 ng/mL的LOD溶液和質(zhì)量濃度約為0.1 ng/mL的LOQ溶液。

回收率加樣溶液：精密量取9 份利奈唑胺葡萄糖注射液約5 mL，分別置于9 個(gè)10 mL 量瓶中，后分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4、0.5、0.6 mL各3份，加稀釋劑至刻度，得低（80%限度濃度）、中（100%限度濃度）、高（120%限度濃度）濃度加樣溶液。

加樣重復(fù)性溶液：精密量取6份利奈唑胺葡萄糖注射液約5 mL，分別置于6 個(gè)10 mL 量瓶中，后分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL，加稀釋劑至刻度。

穩(wěn)定性溶液：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL共4 份，分別置于10 mL 量瓶中，各加入利奈唑胺葡萄糖注射液5 mL，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，其中2 份置于10 ℃條件保存，另外2 份置于常溫保存。

3 結(jié) 果

3.1 專屬性

分別取稀釋劑、對(duì)照品溶液、系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液、LOD 溶液和LOQ 溶液在建立的 UPLC-MS/MS 方法下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，在所建立的色譜-質(zhì)譜條件下，利奈唑胺USP 雜質(zhì)A 峰形良好，空白稀釋劑、供試品溶液對(duì)利奈唑胺USP 雜質(zhì)A的檢測(cè)無干擾（圖2）。

3.2 線性關(guān)系

取雜質(zhì)線性系列對(duì)照品溶液在建立的UPLCMS/MS 方法下進(jìn)樣測(cè)定，以MRM 離子流峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以利奈唑胺USP 雜質(zhì)A 的對(duì)照品濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程。結(jié)果表明，利奈唑胺USP 雜質(zhì)A 在4 ~ 12 ng/mL 內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，所得回歸方程為：Y= 5 434.4X+ 394.52，r= 0.999 6。

3.3 檢出限及定量限

取LOD 溶液和LOQ 溶液，在建立的UPLC-MS/MS 方法下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算檢出限及定量限。結(jié)果表明利奈唑胺USP 雜質(zhì)A 的LOD 和LOQ 分別為0.022 ng/mL 和0.073 ng/mL，該方法的靈敏度滿足檢測(cè)要求。

Figure 2 Typical chromatogram of solutions detected by UPLC-MS/MS

3.4 回收率

取回收率加樣溶液在建立的UPLC-MS/MS 方法下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明低、中、高濃度加樣溶液平均回收率分別為101.14%、100.59% 和101.47%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.73%、1.10%和0.91%，該方法具有較好的回收率。

3.5 加樣重復(fù)性

取平行制備的6 份加樣溶液，在建立的UPLCMS/MS 方法下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明6 份加樣重復(fù)性溶液RSD為1.09%，該方法具有較好的重復(fù)性。

3.6 穩(wěn)定性

3.6.1 樣品日內(nèi)穩(wěn)定性 取10 ℃和室溫保存的穩(wěn)定性溶液各1 份，分別于 0、2、6、10 和24 h 在建立的UPLC-MS/MS方法下進(jìn)行測(cè)定，并按照對(duì)照品溶液項(xiàng)下方法配制隨行對(duì)照品溶液計(jì)算溶液加樣回收率的RSD。結(jié)果表明，10 ℃和室溫條件下保存溶液的加樣回收率RSD 分別為0.72% 和1.38%，可見樣品在10 ℃和室溫條件下保存24 h穩(wěn)定。

3.6.2 樣品日間穩(wěn)定性 另取10 ℃和室溫保存的穩(wěn)定性溶液各1份，分別于 0、1、2、3和6 d在建立的UPLC-MS/MS 方法下進(jìn)行測(cè)定，并按照對(duì)照品溶液項(xiàng)下方法配制隨行對(duì)照品溶液計(jì)算溶液加樣回收率的RSD。結(jié)果表明，10 ℃和室溫條件下保存溶液的加樣回收率RSD 分別為0.94%和1.35%，可見樣品在10 ℃和室溫條件下保存6 d穩(wěn)定。

3.7 耐用性

取1 份中濃度回收率加樣溶液，分別改變液相色譜柱［改用Acquity UPLC HSS T3 （150 mm × 2.1 mm，1.8 μm，Serial No 02553117418342）色譜柱 及Acquity UPLC HSS T3 （100 mm × 2.1 mm，1.8 μm，Serial No 02013730718374）色譜柱］，改變流速（ ± 0.03 mL/min），改變柱溫（ ± 5 ℃），在建立的UPLC-MS/MS方法下進(jìn)行測(cè)定，考察方法的耐用性。結(jié)果表明，在上述條件下加樣回收率為98.21% ~ 103.15%，RSD 為1.84%，可見該方法耐用性良好。

3.8 樣品測(cè)定

取2 批利奈唑胺原料和3 批利奈唑胺葡萄糖注射液制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算利奈唑胺USP 雜質(zhì)A 含量。結(jié)果表明，在2 批利奈唑胺原料及3 批利奈唑胺葡萄糖注射液中均未檢出利奈唑胺USP雜質(zhì)A。

4 討 論

為實(shí)現(xiàn)利奈唑胺USP雜質(zhì)A的痕量檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該雜質(zhì)質(zhì)譜MRM 模式選用離子進(jìn)行了確認(rèn)，并在標(biāo)準(zhǔn)提供的高效液相色譜條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行了液相色譜條件的優(yōu)化。

4.1 利奈唑胺USP雜質(zhì)A定性研究

對(duì)利奈唑胺USP雜質(zhì)A進(jìn)行手動(dòng)調(diào)諧定性，得到檢測(cè)母離子、子離子及其電離電壓，由于子離子m/z165.1 響應(yīng)最高，故將其作為定量離子進(jìn)行檢測(cè)。

4.2 液相色譜條件研究

現(xiàn)有利奈唑胺相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中多采用0.1%三氟乙酸水溶液-0.1%三氟乙酸乙腈溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫來檢測(cè)利奈唑胺中的有關(guān)物質(zhì)，由于三氟乙酸在一定濃度范圍內(nèi)可能會(huì)抑制化合物電離，故為提高電離效率，最終選擇甲酸代替三氟乙酸進(jìn)行流動(dòng)相配制。但經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，新的梯度洗脫條件導(dǎo)致利奈唑胺USP 雜質(zhì)A 在檢測(cè)過程中存在干擾峰現(xiàn)象，綜合考慮檢驗(yàn)時(shí)間和靈敏度后最終選擇等度洗脫檢測(cè)目標(biāo)雜質(zhì)。

后續(xù)對(duì)等度洗脫的流動(dòng)相組成進(jìn)行了篩選，備選的0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液洗脫體積比分別為20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40和70∶30。結(jié)果顯示，隨著0.1%甲酸乙腈溶液體積比的增大，利奈唑胺USP 雜質(zhì)A 保留時(shí)間會(huì)相應(yīng)延長，利奈唑胺與利奈唑胺USP 雜質(zhì)A 分離度會(huì)更好，故基于主成分和目標(biāo)化合物分離度及檢測(cè)效率的考慮，最終選擇流動(dòng)相體積比60∶40進(jìn)行等度洗脫。此外，為避免主成分的干擾和污染，設(shè)置六通閥將0 ~ 2.7 min 時(shí)間段內(nèi)的流出物切換到廢液通道。

本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC-MS/MS 法具有較好的線性、靈敏度、回收率及重復(fù)性，可以同時(shí)用于檢測(cè)利奈唑胺原料及其制劑中的遺傳毒性雜質(zhì)含量，可為利奈唑胺原料及制劑的質(zhì)量控制提供參考。