楊 軻,于 濤
(中國藥科大學(xué)理學(xué)院,南京 210098)
手性藥物的對映異構(gòu)體往往表現(xiàn)出不同的生物活性和不良反應(yīng),部分對映異構(gòu)體對人體及環(huán)境傷害巨大。自“反應(yīng)?!钡戎T多重大事件后,關(guān)于手性藥物毒副作用的認識及高效簡便的識別檢測技術(shù)已成為藥物分析專業(yè)領(lǐng)域研究及教學(xué)的重要內(nèi)容[1],但由于對映體之間理化性質(zhì)幾乎相同,常規(guī)分離分析手段很難實現(xiàn)分離。近年來,毛細管電泳(CE)對于手性藥物分離表現(xiàn)出極大的優(yōu)越性[2]。其中,由Terabe等[3]在1984年提出的膠束電動毛細管色譜(MEKC),更是將分析物的范圍從帶電物質(zhì)擴展到了中性化合物,使得CE 成為最有效的手性分離技術(shù)之一。
在MEKC 模式下,溶質(zhì)不僅可以因為表觀淌度差異而分離,還可以基于在水相和在電場中的膠束相之間的分配系數(shù)不同而被分離,從而使在毛細管區(qū)帶電泳(CZE)模式下不能被分離的中性分子得到分離。因此,MEKC的分離能力很大程度上依賴于形成膠束的表面活性劑的結(jié)構(gòu)[4]。表面活性劑按親水端基團的帶電性可以分為陰離子型、陽離子型、兩性離子型和非離子型,其中,陰離子型表面活性劑SDS 是最常用于手性分離體系的表面活性劑[5-6]。
離子液體是一類在室溫附近或低于100 ℃呈現(xiàn)液態(tài)狀態(tài)的鹽類的統(tǒng)稱,具有較低的熔點、可忽略的蒸汽壓、高的熱穩(wěn)定性、良好的溶解性和環(huán)境友好等特點,被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域[7-9]。具有長烷基鏈的離子液體具有明顯的兩親性,被稱為表面活性離子液體,是一種具有離子液體和表面活性劑結(jié)合性質(zhì)的功能性離子液體[10]。近幾年的研究表明,新型的離子液體表面活性劑表現(xiàn)出很好的作為MEKC 體系準(zhǔn)固定相的潛力[11-15]。已報道的離子液體表面活性劑以陽離子表面活性劑居多,即其長烷基鏈連接在離子液體的陽離子部分,而陰離子型離子液體型表面活性劑用于MEKC 的研究少見報道,特別是用于手性分離的研究幾乎沒有。
本研究依據(jù)文獻[10],用類似的方法合成了陰離子型離子液體表面活性劑N-丁基-N-甲基吡咯烷十二烷基硫酸鹽([C4MP][C12SO4])(結(jié)構(gòu)式見圖1),并將其與中性手性選擇劑葡萄糖基-β-環(huán)糊精(Glu-β-CD)構(gòu)建CD-MEKC 體系在低pH 條件下分離4種酸性手性藥物(萘普生、華法令、酮洛芬和布洛芬,結(jié)構(gòu)式見圖2)。
Figure 1 Stucture of [C4MP][C12SO4]
Figure 2 Chemical structure of naproxen,warfarin,ketoprofen and ibuprofen
N-丁基-N-甲基吡咯烷氯鹽([C4MP]Cl,上海成捷化學(xué)有限公司);Glu-β-CD(≥ 98%,山東淄博千匯精細化工有限公司);萘普生和華法令(四川西亞試劑有限公司);酮洛芬和布洛芬(美國Sigma-Aldrich 公司)。所有的手性藥物都是消旋體混合物。甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇(色譜純,江蘇漢邦科技有限公司);磷酸二氫鈉(≥ 99.0%)、磷酸(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);實驗用水為二次蒸餾水。
Agilent3DCE G7100A(美國Agilent 科技公司);未涂層熔融石英毛細管(河北永年銳灃色譜器件有限公司);BT-25S 電子天平和PB-10 型pH 計(德國Sartorius 公司);N-1100D-WD 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Eyela公司)。
未涂層石英毛細管柱(33 cm × 50 μm,有效長度24.5 cm)。運行緩沖液為pH 3.0(萘普生、華法令、酮洛芬)、pH 3.3(布洛芬)的50 mmol/L磷 酸 鹽(含30 mmol/L Glu-β-CD、40 mmol/L [C4MP][C12SO4]和20%甲醇);運行電壓:-15 kV或-20 kV;檢測波長:萘普生(235 nm)、華法林(210 nm)、酮洛芬和布洛芬(225 nm);壓力進樣,30 mbar(1 bar = 6.895 kPa),4 s;運行溫度,25 ℃。
2.2.1 運行緩沖液配制 緩沖鹽溶液為50 mmol/L磷酸緩沖鹽(含有一定量的有機溶劑)。運行緩沖鹽全部當(dāng)時配制,將Glu-β-CD和陰離子型表面活性劑溶于包含有機溶劑的緩沖鹽溶液(特定pH)中,用極少量的10%磷酸溶液調(diào)節(jié)至所需的pH。
2.2.2 樣品溶液配制 分別稱取萘普生、華法令、酮洛芬、布洛芬適量,用水-甲醇(1∶1)溶解,進樣質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL。
所有樣品溶液及運行緩沖溶液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后使用。
[C4MP][C12SO4]的合成參照文獻[10],具體步驟如下:將[C4MP]Cl和SDS 取相同當(dāng)量,置圓底燒瓶內(nèi),加入適量的二氯甲烷,室溫下攪拌4 h。抽濾,去除沉淀物,有機相用水洗數(shù)次,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機溶劑,真空干燥24 h,得蠟狀離子液體。
[C4MP][C12SO4]作為一種新型離子液體表面活性劑,在298 K下的水溶液中的臨界膠束濃度(CMC)為2.7 mmol/L,同條件下SDS的CMC為8.1 mmol/L。[C4MP][C12SO4]擁有優(yōu)越的表面活性,且由于其陽離子為吡咯烷陽離子,紫外吸收極弱,作為背景添加劑,對樣品干擾少,基線平穩(wěn)。本研究使用的表面活性劑濃度均在其CMC以上。
實驗中首先考察了CZE 模式和MEKC 模式下,Glu-β-CD手性選擇劑對4種酸性藥物(萘普生、華法令、酮洛芬和布洛芬)的拆分效果。結(jié)果表明,在低pH 條件的CZE 下,酸性藥物均不帶電,中性環(huán)糊精不能實現(xiàn)對4種藥物的手性分離;當(dāng)緩沖液pH大于藥物的pKa時,萘普生和華法令可實現(xiàn)部分分離,酮洛芬和布洛芬不能被分離。因此,本研究建立低pH 條件下的MEKC 體系,低pH 條件下,酸性藥物呈電中性,藥物根據(jù)其在含環(huán)糊精的緩沖液相中和膠束相中的分配不同而實現(xiàn)分離,環(huán)糊精對手性藥物的識別效果較好。如采用正電壓模式,由于膠束帶負電向正極遷移,樣品不能出峰,而采用反向電壓,樣品在帶負電的膠束帶動下出峰。因此采用負電壓模式構(gòu)建CD-MEKC分離體系。
Figure 3 Typical electropherograms of micellar electrokinetic chromatography( MEKC) systems based on SDS and [C4MP] [C12SO4]Conditions: fused-silica capillary, 33 cm (24.5 cm effective length) × 50 μm; 50 mmol/L phosphate buffer (20% of methanol included) containing 30 mmol/L Glu-β-CD and (a) 40 mmol/L SDS; (b) 40 mmol/L [C4MP][C12SO4]; (A) and (B) pH 3.0, applied voltage -15 kV; (C) pH 3.0, applied voltage -20 kV and (D) pH 3.3,applied voltage -20 kV; capillary temperature, 25 °C
在MEKC 模式下,分別采用SDS 和[C4MP][C12SO4]作為表面活性劑,其中基于SDS 的體系除了可對萘普生實現(xiàn)分離,其余藥物無法分離,而基于[C4MP][C12SO4]的體系能大大提高萘普生的分離結(jié)果,而對華法令、酮洛芬和布洛芬均可實現(xiàn)部分分離,MEKC體系電泳對比如圖3。由電泳圖譜可看出,基于[C4MP][C12SO4]的CD-MEKC 體系相比于基于SDS 的體系,對萘普生的分離效果大大改善,其中選擇性因子(α)從1.14提高到1.20,分離度從2.05 提高到6.75;對華法令、酮洛芬和布洛芬則從不能分離到部分分離。這可能是由于[C4MP][C12SO4]和SDS 在水相中的聚集行為以及膠束排列都有所不同,有研究表明[C4MP][C12SO4]具有比傳統(tǒng)表面活性劑SDS 更優(yōu)的膠束特征[9]。
3.2.1 有機溶劑的種類和比例對分離的影響 本研究重點考察了甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇這4種有機溶劑對酸性藥物分離的影響。在不添加有機溶劑或有機溶劑比例在低于20%時,手性藥物在長分析時間(大于60 min)內(nèi)不能出峰。固定比例為20%,4 種有機溶劑中,甲醇為更適合該CDMEKC 體系的有機溶劑。進一步考察甲醇的比例對分離的影響,發(fā)現(xiàn)甲醇比例增大后,手性藥物的遷移時間均大大延長,而分離度也呈現(xiàn)下降的趨勢,可能是因為遷移時間較長,分離效率下降,峰展寬導(dǎo)致分離結(jié)果變差。因此,選擇20%甲醇作為該系統(tǒng)的有機溶劑。
3.2.2 緩沖鹽濃度及pH 對分離的影響 通常,緩沖鹽種類及濃度會影響緩沖液離子強度、電滲流大小及溶質(zhì)在毛細管壁的吸附等。當(dāng)緩沖系統(tǒng)濃度增加時,離子強度增大,會使電滲流減小,有利于減少溶質(zhì)和管壁的相互作用,改善分離;但濃度過大則會使電流過大,焦?fàn)枱嵊绊懜鼮閲?yán)重,峰展寬進而不利于分離。
選擇在低pH 范圍內(nèi)有較好緩沖能力的磷酸鹽作為緩沖體系,考察了不同磷酸鹽濃度(30、50和70 mmol/L)對藥物手性分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著磷酸鹽濃度從30 mmol/L 增至50 mmol/L 藥物的分離得到改善;而當(dāng)磷酸鹽濃度由50 mmol/L 進一步增至70 mmol/L 時,電流較大,峰展寬,藥物的分離度呈下降趨勢。因此,選擇50 mmol/L 的磷酸鹽作為CD-MEKC拆分的緩沖鹽體系。
在50 mmol/L 的磷酸鹽(包含體積分數(shù)20% 的甲醇)緩沖溶液中加入30 mmol/L Glu-β-CD 并在40 mmol/L [C4MP][C12SO4]條件下,考察了不同緩沖溶液pH(2.7、3.0、3.3、3.6 和3.9)對手性藥物分離的影響,結(jié)果見表1。
Table 1 Effect of buffer pH on enantioseparation of chiral drugs
表1中顯示,在考察的pH 范圍內(nèi),手性藥物的遷移時間隨pH 升高而延長。而藥物的分離結(jié)果在整個pH 范圍內(nèi)變化并不特別明顯,可能是因為藥物在pH 低于其pKa的緩沖溶液中,解離情況較弱,大部分以分子形式存在,因此,對溶液pH 變化相對不敏感。考慮到分析時間和樣品峰形,萘普生、華法令和酮洛芬的最佳pH 為3.0,而布洛芬則選擇3.3作為其分離pH。
3.2.3 環(huán)糊精濃度對分離的影響 本研究采用
Glu-β-CD 作為手性選擇劑建立基于離子液體表面活性劑的CD-MEKC 手性分離體系,為考察環(huán)糊精濃度對手性分離的影響,設(shè)定其濃度范圍為10 ~ 40 mmol/L。考察結(jié)果如表2所示。
當(dāng)環(huán)糊精濃度在10 mmol/L 時,除了萘普生有部分分離外,其余手性藥物均不能實現(xiàn)分離,說明環(huán)糊精濃度過低時不能充分發(fā)揮其手性識別能力。當(dāng)環(huán)糊精濃度增大時,可以看出藥物的遷移時間延長,分離度和選擇性因子(α)提高。而當(dāng)Glu-β-CD 濃度增大至40 mmol/L 時,手性藥物在60 min內(nèi)均未出峰,可能是由于此時緩沖溶液黏度升高,藥物在環(huán)糊精中的分配增加,在膠束相中的分配減小,膠束不足以將藥物較快帶至出口端。考慮到分離度和α達到最佳時,選擇30 mmol/L 作為該體系的Glu-β-CD濃度。
3.2.4 離子液體表面活性劑濃度對分離的影響 因為華法令、酮洛芬和布洛芬的分離度在較低的水平,故選擇萘普生這一手性藥物考察離子液體表面活性劑[C4MP][C12SO4]的濃度,考察范圍為35 ~ 60 mmol/L,實驗結(jié)果見表3。
Table 2 Effect of concentration of Glu-β-CD on enantioseparation of chiral drugs
Table 3 Effect of concentration of [C4MP][C12SO4] on enantioseparation of chiral drugs
在考察的濃度范圍內(nèi),當(dāng)離子液體[C4MP][C12SO4]濃度低于40 mmol/L 時,萘普生樣品峰在較長分析時間內(nèi)仍未可見。推測可能是因為形成的膠束相濃度太低,在負壓模式下膠束無法快速地將萘普生帶至檢測端。隨著[C4MP][C12SO4]濃度升至40 mmol/L時,樣品能夠出峰,且分離效果極佳。當(dāng)濃度進一步增大到45 ~ 50 mmol/L,萘普生遷移時間在逐漸縮短,分離度也在降低,可能是因為膠束濃度增大,反而對對映體的區(qū)分作用減弱導(dǎo)致的。隨著離子液體濃度上升至55 ~ 60 mmol/L,樣品的遷移時間突然大大延長,可能是由于陽離子濃度也在增大,使得對毛細管壁的吸附增強,對電滲流產(chǎn)生影響所致。另外則可能是陽離子大量存在中和了負電性膠束表面部分負電荷使膠束粒子表面電荷密度變小,膠束粒子變大,從而影響了膠束相的遷移速度。
3.2.5 運行電壓對分離的影響 通常來說,較高的運行電壓往往能帶來較高的分離效能和較短的分析時間,但是高的電壓也會產(chǎn)生過多的焦耳熱從而降低分離效率。為了獲得合適的運行電壓,本研究考察的電壓范圍為-5 ~ -25 kV,結(jié)果表明,降低反向電壓的大小,藥物的遷移時間延長,如預(yù)期的一樣,較低的電壓能延長分析時間,給予分析物和手性選擇劑之間更多的作用機會,然而也會造成分離效率較低和峰展寬等問題,使得樣品的分離度隨著電壓降低呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。對于萘普生和華法令來說,-15 kV 為其最佳運行電壓;對于酮洛芬和布洛芬,-20 kV 的運行電壓則更適合。
本工作合成了陰離子型離子液體表面活性劑[C4MP][C12SO4],并將其與中性手性選擇劑Glu-β-CD 用于膠束電動毛細管色譜手性分離體系的構(gòu)建,首次在低pH 條件下分離4 種酸性藥物(萘普生、華法令、酮洛芬和布洛芬)。相比于同條件下的SDS 體系,基于[C4MP][C12SO4]的MEKC 體系大大提高了萘普生的分離效果,并使其余3 種在SDS體系中無法分離的藥物實現(xiàn)部分分離。這一研究擴展了Glu-β-CD 在CE 手性拆分中的應(yīng)用范圍,探索了離子液體表面活性劑在MEKC 體系中的分離潛力。同時本團隊以文章內(nèi)容設(shè)計“藥學(xué)拔尖學(xué)生培養(yǎng)計劃”示教實驗,結(jié)合健康中國戰(zhàn)略,闡述了手性藥物研發(fā)風(fēng)險及最新研究進展。