新型嗪類熒光染料用于術(shù)中神經(jīng)成像

包瑞楚，李昌盛，顧月清

（中國(guó)藥科大學(xué)，南京 211198）

外科手術(shù)是大多數(shù)疾病和損傷最有效的治療選擇，全世界每年有超過(guò)3 億次手術(shù)［1］。外科手術(shù)的最終目標(biāo)是通過(guò)保留神經(jīng)組織、血管等重要結(jié)構(gòu)來(lái)移除或修復(fù)組織，同時(shí)最大限度地減少并發(fā)癥。醫(yī)源性神經(jīng)損傷是最令人頭疼的術(shù)后并發(fā)癥之一，其引起的慢性神經(jīng)疾病不僅降低了患者的生活質(zhì)量，而且增加了醫(yī)療費(fèi)用［2］。盡管外科技術(shù)和醫(yī)療設(shè)備不斷發(fā)展，核磁共振成像［3］、肌電圖［4］、超聲波［5］、光學(xué)相干斷層掃描［6］和共聚焦顯微內(nèi)鏡檢查已被應(yīng)用于輔助術(shù)中神經(jīng)識(shí)別。但是，這些技術(shù)缺乏特異性、分辨率和寬視場(chǎng)成像功能，使得神經(jīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)變得困難。熒光引導(dǎo)手術(shù)通過(guò)增強(qiáng)術(shù)中特定組織的可視化［7］，有效地將術(shù)前成像和手術(shù)指導(dǎo)結(jié)合起來(lái)，具有革新手術(shù)的潛力，非常適合神經(jīng)組織等重要結(jié)構(gòu)保護(hù)。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的幾類神經(jīng)特異性熒光團(tuán)，包括二苯乙烯衍生物［8］、二苯乙烯基苯（DSB）［9］、香豆素衍生物［10］、苯乙烯基吡啶（FM）、三碳菁、神經(jīng)特異性多肽［11］和鈉通道選擇性多肽［12］都受到發(fā)射波長(zhǎng)較短、組織非特異性攝取高的困擾，而嗪類熒光團(tuán)［13］是發(fā)射波長(zhǎng)在可見(jiàn)光波段的神經(jīng)特異性熒光染料，具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)、結(jié)構(gòu)可修飾空間。

臨床中，喉返神經(jīng)的醫(yī)源性損傷是一種常見(jiàn)的甲狀腺術(shù)后并發(fā)癥，通過(guò)肉眼識(shí)別進(jìn)而保護(hù)喉返神經(jīng)是甲狀腺手術(shù)中保證喉返神經(jīng)安全的金標(biāo)準(zhǔn)［14］。然而，對(duì)于需進(jìn)行二次甲狀腺手術(shù)的患者，由于正常的解剖結(jié)構(gòu)的破壞，再次手術(shù)過(guò)程中單純通過(guò)肉眼識(shí)別喉返神經(jīng)的難度大大增加。因此，在甲狀腺再次手術(shù)過(guò)程中如何精準(zhǔn)定位、識(shí)別喉返神經(jīng)，是避免術(shù)中神經(jīng)損傷的關(guān)鍵。

MBP 是神經(jīng)髓鞘的主要成分，在形成和維持髓磷脂的穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能非常重要［15］。MBP 是1，4-雙（對(duì)氨基苯乙烯基）-2-甲氧基苯（BMB）的潛在分子靶標(biāo)［16］，可能與髓鞘堿性蛋白中的β-折疊片狀構(gòu)象有關(guān)［17］。在目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)或發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)熒光染料中，同一類別的物質(zhì)具有相似的性質(zhì)，嗪類衍生物基于與BMB 的化學(xué)相似性，MBP 也可能是其潛在分子靶標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道，除大鼠外，對(duì)豬神經(jīng)進(jìn)行嗪4的免疫組織化學(xué)研究，可以應(yīng)用兔抗髓鞘堿性蛋白來(lái)顯示髓鞘，同時(shí)用MBP 抗體染色，結(jié)果顯示嗪4與纖維束中的髓鞘共定位［15］。

本研究中在嗪類化合物母核結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，得到了YQN-3～YQN-6 4 個(gè)化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振氫譜確證，并且其最大吸收和最大發(fā)射波長(zhǎng)分別在625 nm 和640 nm 左右，具有較好的光譜性質(zhì)。進(jìn)一步在大鼠中篩選出具有神經(jīng)組織高特異性靶向的YQN-3，最后在甲狀腺手術(shù)切除過(guò)程中驗(yàn)證了，探針YQN-3 具有喉返神經(jīng)特異性靶向能力，能很好地靶向、定位喉返神經(jīng)，有效地避免術(shù)中損傷。YQN-3 具有良好的安全性，具有潛在的臨床神經(jīng)顯影應(yīng)用前景。

1 材 料

1.1 試 劑

高氯酸（70%）、二甲基亞砜、高氯酸嗪4（阿拉丁生化科技股份有限公司）；叔丁醇鉀、間羥基-N，N-二乙基苯胺、間溴苯甲醚（畢得醫(yī)藥科技股份有限公司）；四（三苯基膦）鈀（阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；環(huán)丁胺、環(huán)己胺（分析純，邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）；水合氯醛（分析純，賢鼎生物科技有限公司）；胎牛血清（生物級(jí)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Cell Counting Kit-8（碧云天生物技術(shù)有限公司）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（源葉生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（生物級(jí)，凱基生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀 器

Hei-VAP Core型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)海道夫有限公司）；Avance-400型核磁共振波譜儀（德國(guó)布魯克公司）；6540-ESI-MS 型高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津儀器有限公司）；F-4700 型熒光光譜儀（日本日立有限公司）；IVIS Lumia Ⅲ小動(dòng)物活體成像儀（美國(guó)珀金埃爾默公司）；Leica CM1950 型冷凍切片機(jī)（德國(guó)徠卡有限公司）；ELx800型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰有限公司）。

1.3 動(dòng) 物

SPF 級(jí)SD 大鼠，雄性，體重（210 ± 10）g，由南京青龍山動(dòng)物繁殖中心提供，許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。手術(shù)前，用腹腔注射水合氯醛麻醉動(dòng)物（120 mg/kg）。在所有研究完成后，用吸入二氧化碳的方法對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，然后再進(jìn)行頸椎脫位。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 合成方法和表征數(shù)據(jù)

化合物YQN-3 ~ YQN-6 的合成路線示意圖如路線1所示。

土壩劈裂灌漿防滲加固機(jī)理是多方面的，首先是壩體內(nèi)部應(yīng)力的分布規(guī)律為劈裂灌漿提供了可能性，再就是灌漿過(guò)程中的泥漿的劈裂充填作用、漿壩互壓作用、壩體濕陷固結(jié)作用、壩體內(nèi)部應(yīng)力調(diào)整作用等。

2.1.1 化合物YQN-3的合成

步驟一：25 mL 三頸瓶中，加入間溴苯甲醚1.50 g（8.02 mmol），環(huán)丙胺0.73 g（12.79 mmol），叔丁醇鉀1.36 g（12.12 mmol），四（三苯基膦）鈀0.05 g（0.043 mmol）和甲苯（8 mL），氮?dú)獗Ｗo(hù)下80 ℃加熱反應(yīng)8 h。降至室溫后將反應(yīng)液旋干、硅膠柱色譜純化，可得到棕色油狀液體N-環(huán)丙基-3-甲氧基苯胺。MS，m/z：164.14。

步驟二：取將步驟一得到的N-環(huán)丙基-3-甲氧基苯胺200 mg（1.23 mmol）溶解在冷的稀鹽酸（2 mol/L）溶液5 mL 中，隨后加入亞硝酸鈉103 mg（1.49 mmol），冰水浴中攪拌反應(yīng)2 h（控制反應(yīng)液溫度 ＜ 5 ℃），反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液滴入飽和碳酸鉀溶液中，再用乙酸乙酯萃取、無(wú)水硫酸鈉干燥后，旋干得黃綠色固體N-環(huán)丙基-3-甲氧基-4-亞硝基苯胺。MS，m/z：192.09。

步驟三：間羥基-N，N-二乙基苯胺86 mg（0.52 mmol）溶 解 在i-PrOH-H2O（9∶1，4 mL）中80 ℃攪拌30 min 后，將N-環(huán)丙基-3-甲氧基-4-亞硝基苯胺100 mg（0.52 mmol）和高氯酸（70%，47 μL）的i-PrOH/H2O（9∶1，4 mL）溶液緩慢加到反應(yīng)中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下80 ℃反應(yīng)8 h（反應(yīng)體系由棕色漸變?yōu)榫G色，最后變成深藍(lán)色），反應(yīng)完全后旋干、經(jīng)硅膠柱色譜純化，得YQN-3（40 mg，收率24.9%），深藍(lán)色固體，經(jīng)質(zhì)譜、核磁氫譜確證結(jié)構(gòu)。MS，m/z：308.22，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.53（s，1H），7.87 ~ 7.77（m，1H），7.77 ~ 7.67（m，1H），7.49 ~ 7.40（m，1H），7.16 ~ 7.08（m，1H），7.05（s，1H），7.00 ~ 6.89（m，1H），3.76（q，J= 7.0 Hz，4H），2.94 ~ 2.84（m，1H），1.26（t，J= 7.1 Hz，6H），1.01 ~ 0.94（m，2H），0.72 ~ 0.65（m，2H）。如圖1和圖2所示。

Scheme 1 Synthetic route of YQN-3-YQN-6

Figure 1 Mass spectra of YQN-3

2.1.2 YQN-4的合成

化合物YQN-4 的合成參考YQN-3 合成，其中在步驟一中以環(huán)丁胺代替環(huán)丙胺進(jìn)行反應(yīng)，得到N-環(huán)丁基-3-甲氧基苯胺，后續(xù)合成方法參考YQN-3 合成中的步驟二、三，最終得目標(biāo)化合物YQN-4（40 mg，收率23.8%），深藍(lán)色固體，經(jīng)質(zhì)譜、核磁氫譜確證結(jié)構(gòu)。MS，m/z：322.21，1H NMR（400 MHz，

DMSO-d6）δ：9.67（d，J= 6.5 Hz，1H），7.79（d，J= 9.4 Hz，1H），7.73（d，J= 9.3 Hz，1H），7.47 ~ 7.33（m，1H），7.15（d，J= 9.3 Hz，1H），6.97（s，1H），6.67（s，1H），4.44 ~ 4.24（m，1H），3.74（q，J= 7.1 Hz，4H），2.49 ~ 2.39（m，2H），2.09（p，J= 9.6 Hz，2H），1.84（q，J= 9.1，8.6 Hz，2H），1.25（t，J= 7.0 Hz，6H）。如圖3和圖4所示。

2.1.3 YQN-5的合成

2.1.4 YQN-6的合成2H），3.74（q，J= 7.1 Hz，5H），2.04 ~ 1.89（m，2H），1.83 ~ 1.71（m，2H），1.69 ~ 1.55（m，1H），1.53 ~ 1.26（m，6H），1.26 ~ 1.16（m，6H）。如圖7和圖8所示。

化合物YQN-6 的合成參考YQN-3 合成，其中在步驟一中以環(huán)己胺代替環(huán)丙胺進(jìn)行反應(yīng)，得到N-環(huán)己基-3-甲氧基苯胺，后續(xù)合成方法參考YQN-3 合成中的步驟二、三，最終得目標(biāo)化合物YQN-6，深藍(lán)色固體，經(jīng)質(zhì)譜、核磁氫譜確證結(jié)構(gòu)（47 mg，收 率25.8%）。 MS，m/z：350.24，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.39（s，1H），7.80（d，J= 9.5 Hz，1H），7.73（d，J= 9.5 Hz，1H），7.38（d，J= 8.9 Hz，1H），7.19（d，J= 9.4 Hz，1H），7.07 ~ 6.75（m，

Figure 2 1H NMR spectra of YQN-3

Figure 3 Mass spectra of YQN-4

2.1.5 熒光染料YQN-3等的光譜特性用乙腈將熒光染料YQN-3 ~ YQN-6 配成濃度125 μmol/L 溶液備用。分別用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和熒光光譜儀測(cè)定這4 種熒光染料的紫外和熒光光譜（比色皿：1.0 cm，石英，四通），確定各染料的最大吸收波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)。

2.2 熒光染料YQN-3等活體神經(jīng)顯像和毒性研究

2.2.2 YQN-3 在術(shù)中喉返神經(jīng)熒光成像 上述研究結(jié)果表明，YQN-3 具有最好的神經(jīng)組織靶向能力，組織背景信號(hào)最低，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用于手術(shù)過(guò)程中神經(jīng)組織熒光成像，有效避免神經(jīng)損傷而導(dǎo)致功能性損傷。

Figure 4 1H NMR spectra of YQN-4

Figure 5 Mass spectra of YQN-5

在大鼠甲狀腺手術(shù)切除過(guò)程中，YQN-3 按1.54 mg/kg 劑量給藥4 h 后，對(duì)大鼠甲狀腺附近的脂肪、肌肉組織進(jìn)行剝離，暴露出甲狀腺和喉返神經(jīng)，在大鼠甲狀腺手術(shù)切除過(guò)程中，YQN-3 能有效地顯示喉返神經(jīng)，對(duì)其神經(jīng)組織完整性進(jìn)行檢視，后續(xù)對(duì)熒光部位進(jìn)行切除經(jīng)組織病理HE染色。

Figure 6 1H NMR spectra of YQN-5

Figure 7 Mass spectra of YQN-6

3 結(jié)果與討論

3.1 YQN-3等設(shè)計(jì)思路與結(jié)構(gòu)確證

利用生物電子等排體在熒光染料嗪4 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾得到的，即以環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷和環(huán)己烷對(duì)乙基進(jìn)行替換得到化合物YQN-3、YQN-4、YQN-5、YQN-6。在不改變嗪母環(huán)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行官能團(tuán)替換，旨在提高染料對(duì)神經(jīng)組織的靶向能力，制備得到的YQN-3等化合物都經(jīng)質(zhì)譜、核磁氫譜確證結(jié)構(gòu)（如圖1 ~ 圖8所示）。

3.2 YQN-3等的光譜性質(zhì)

在乙腈中測(cè)定YQN-3 等的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。YQN-3 等的最大吸收波長(zhǎng)在630 nm左右，如圖9 所示；最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)在645 nm 左右，如圖10所示。因此，YQN-3等具有較長(zhǎng)的發(fā)射波長(zhǎng)，適合用于活體顯像。

3.3 YQN-3等在體神經(jīng)顯像

如圖11所示，在嗪4、YQN-3、YQN-4、YQN-5和YQN-6 的大鼠臂叢神經(jīng)和坐骨神經(jīng)顯像中，YQN-3 表現(xiàn)出最強(qiáng)的神經(jīng)特異性，具有最強(qiáng)的神經(jīng)熒光信號(hào)和最低的背景吸收（脂肪和肌肉組織），隨著取代環(huán)烷基環(huán)的增大，神經(jīng)靶向能力減弱，肌肉和脂肪分布增加。因此，選YQN-3 作為候選化合物做進(jìn)一步研究。

Figure 8 1H NMR spectra of YQN-6

Figure 9 Absorption spectra of fluorescent dyes YQN-3-YQN-6

Figure 10 Emission spectra of fluorescent dyes YQN-3-YQN-6

3.4 YQN-3在甲狀腺再次手術(shù)中的成像

YQN-3 具有良好的神經(jīng)靶向能力，能很好地顯示神經(jīng)組織，可用于術(shù)中神經(jīng)造影和檢視。在甲狀腺切除手術(shù)過(guò)程中，甲狀腺切除前后，可以利用YQN-3 對(duì)喉返神經(jīng)進(jìn)行檢視，能有效避免手術(shù)過(guò)程對(duì)神經(jīng)造成損傷，同時(shí)還能在術(shù)后對(duì)神經(jīng)進(jìn)行檢視，進(jìn)行有效預(yù)后。最后，將術(shù)后熒光信號(hào)部位進(jìn)行切除，經(jīng)病理組織HE 染色分析，結(jié)果顯示為神經(jīng)組織。結(jié)果如圖12所示。

Figure 11 In vivo nerve imaging of oxazine 4, YQN-3, YQN-4, YQN-5 and YQN-6 (scale: 5 mm)

Figure 12 Imaging of YQN-3 in thyroid operation

3.5 YQN-3體外毒性研究

以嗪4為陽(yáng)性對(duì)照，在0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，在低于0.2 mg/mL 質(zhì)量濃度的YQN-3和嗪4幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性（細(xì)胞存活率均高于75%），結(jié)果如圖13 所示，因此，YQN-3 具有良好的安全性，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用于臨床神經(jīng)顯像。

4 結(jié)論與展望

本文設(shè)計(jì)并合成了4個(gè)嗪類熒光染料YQN-3 ~ YQN-6，其結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜、核磁氫譜確證；YQN-3等在630 nm 左右有著最大吸收，在645 nm 左右有最大發(fā)射波長(zhǎng)。進(jìn)一步在臂叢神經(jīng)和坐骨神經(jīng)顯像中，YQN-3 表現(xiàn)出最強(qiáng)的神經(jīng)靶向能力和最低的背景吸收，還能用于甲狀腺手術(shù)切除過(guò)程中，對(duì)神經(jīng)組織進(jìn)行有效檢視和保護(hù)，同時(shí)具有良好的安全性，具有潛在的臨床神經(jīng)顯像應(yīng)用前景。

本研究工作仍有需要進(jìn)一步研究加以改善的地方：（1）YQN-3 神經(jīng)染料的發(fā)射波長(zhǎng)較短，穿透深度有限。手術(shù)過(guò)程中先將神經(jīng)解剖后才能有效成像，具有較大的局限性，無(wú)法契合臨床需求，需提高神經(jīng)染料的發(fā)射波長(zhǎng)；（2）熒光探針的給藥途徑應(yīng)根據(jù)探針的光學(xué)特性、成像系統(tǒng)的性能以及手術(shù)期間的實(shí)際情況仔細(xì)考慮。例如，在頭頸部腫瘤切除過(guò)程中，需要突出顯示所有神經(jīng)，以避免任何神經(jīng)損傷。但是，在某些情況下，如根治性前列腺切除術(shù)，不可能保留所有周圍的神經(jīng)組織；由于前列腺內(nèi)廣泛的神經(jīng)熒光，全身系統(tǒng)性使用探針可能會(huì)降低最重要海綿體神經(jīng)的信噪比。因此，在手術(shù)前需要合理評(píng)估選擇最適合的給藥途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)想要的識(shí)別和保留神經(jīng)的效果。

Figure 13 Cytotoxicity test of YQN-3 and oxazine 4 on U87 cells