基于推土距離（EMD）算法的群體生物等效性統(tǒng)計方法評價眼用乳劑粒徑分布的一致性

徐千姿，梁月茹，趙忠衛(wèi)，沈 雁**

（1中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，南京 210009；2深圳奧祺生物醫(yī)藥有限公司，深圳 518057）

近年來，隨著人們生活水平的提高，健康意識的不斷增強，藥品需求隨之越來越大。仿制藥是醫(yī)療保障系統(tǒng)中的重要組成部分，其價格相對低廉，擁有良好的經(jīng)濟效益和社會效益［1］。生物等效性（bioequivalence，BE）評價是批準(zhǔn)仿制藥的重要步驟之一［2］。體外生物等效性研究是BE研究的重要組成部分，它通常有兩種統(tǒng)計分析方法，平均生物等效性（average bioequivalence，ABE）和群體生物等效性（population bioequivalence，PBE）［3］。PBE計算方法最早由安德森和霍克提出［4］，是對ABE方法的補充，這是由于在實際中有許多藥物可能存在方差非齊性，相比于ABE 檢測只比較藥代動力學(xué)參數(shù)的平均水平，PBE統(tǒng)計方法還考慮了參比制劑和受試制劑樣本間、樣本內(nèi)所有變異，計算更加嚴(yán)謹(jǐn)［5］。

粒徑分布（PSD）通常用直方圖表示，通過粒子大小和范圍的信息可用于描述一些物質(zhì)物理和化學(xué)特性。PSD 的分析在建立復(fù)雜藥品的BE 方面已引起了廣泛的關(guān)注。在FDA 官方指南中已建議使用PBE 方法對多種納米制劑的粒徑開展體外生物等效性研究，如氫氧化鐵蔗糖復(fù)合物注射液［6］、二氟潑尼松眼用制劑［7］、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射劑［8］、妥布霉素/地塞米松眼用懸浮液［9］。對于這些制劑，PBE 考察主要參數(shù)為D50、Span 或多分散系數(shù)，其中D50 指有一半的粒徑直徑分布小于該值，Span 用來描述分布的區(qū)間，但這些參數(shù)只局限于粒徑分布是單一峰的情況［10］，當(dāng)PSD圖形是復(fù)雜的（即非單峰），D50/SPAN 將不足以進行分析。例如，對于存在雙峰的PSD 圖形，D50 可能位于兩個峰之間的谷從而導(dǎo)致誤差。針對這一問 題，F(xiàn)DA 在《Draft Guidance on Cyclosporine》［11］中提出了一種度量方法，稱為推土距離（Earth Mover‘s Distance，EMD）算法。目前在計算機領(lǐng)域，已有不少研究將EMD 算法應(yīng)用于圖像檢索、分析和模式識別等［12-13］。EMD 定義兩個直方圖之間的距離為一個運輸問題，可用于度量兩個相似分布間的差異［14］，因此可將EMD 應(yīng)用于PSD 圖形相似度比較，為進一步評價粒徑生物等效性提供數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)。

環(huán)孢素眼用乳劑（商品名：Restasis）于2002年被FDA 批準(zhǔn)在美國上市用于干眼癥的治療［15］，獲得了良好的療效，但市場上很少有其仿制制劑，其中一個關(guān)鍵問題是生物等效性研究［16］。本研究以Restasis 作為研究對象，應(yīng)用基于EMD 算法的PBE統(tǒng)計計算軟件，檢驗開發(fā)的軟件是否能通過參比制劑自身等效，并評價不同工藝下受試制劑粒徑分布與參比制劑是否具有等效性，本研究不僅解決環(huán)孢素眼用乳劑控制體外生物等效性關(guān)鍵問題，同時也為其他乳劑、膠束、脂質(zhì)體、納米粒、微球、納米囊等復(fù)雜仿制制劑的PSD 及PBE 評價提供參考。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

環(huán)孢素眼用乳劑參比制劑（商品名Restasis，規(guī)格0.4 mL∶0.2 mg，美國Allergan 公司）；甘油（南京化學(xué)試劑股份有限公司）；蓖麻油［羅輔醫(yī)藥科技（上海）有限公司］；聚山梨酯80（南京威爾藥業(yè)股份有限公司）；卡波姆共聚物A 型（美國Lubrizol 公司）；氫氧化鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）；環(huán)孢素（浙江瑞邦藥業(yè)股份有限公司）。

1.2 儀 器

電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；pH計（瑞士Mettler toledo公司）；恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；Malvern nano ZSE 動態(tài)光散射儀（英國馬爾文儀器有限公司）；Wiggens高速剪切機［維根技術(shù)（北京）有限公司］。

2 方 法

2.1 EMD算法

EMD 算法［10］起源于經(jīng)典的貨物搬運問題。對于兩個離散分布P和Q，如果把這兩個分布看作是總量為1 的一堆“土”的形狀，那么EMD 算法反映的就是在一定限制條件下把這堆“土”從P狀態(tài)搬運到Q狀態(tài)所做的最小工作量。已知原始位置（xi）有“土”（pi），目標(biāo)位置（yj）需求“土”（qj），則表 示 從pi運 往qj的“土”的數(shù)量；dij表示pi與qj兩地的距離）。一旦找到最優(yōu)解

2.2 群體生物等效性

體外群體生物等效性統(tǒng)計分析的研究方法是基于比較準(zhǔn)則，計算其95%的置信區(qū)間的上限值θ，如果θ小于或等于預(yù)設(shè)的界限值θp，則表示受試制劑與參比制劑具有生物等效性。FDA 提出混合標(biāo)度法［17］作為體外群體生物等效性比較的準(zhǔn)則（population bioequivalence criterion，PBC）。

將式（1）轉(zhuǎn)化為線性形式：

當(dāng)σR＞σT0時選用參比標(biāo)準(zhǔn)，即η1；當(dāng)σR≤σT0時，選用常數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，即η2

為使受試產(chǎn)品通過PBE 試驗，線性化標(biāo)準(zhǔn)（η1或η2）的95%置信上限（Hη1或Hη2）不得大于0。

2.3 環(huán)孢素眼用乳劑的制備

2.3.1 處方 參考原研制劑處方組成，制備3 批處方量為100 g 的0.05%環(huán)孢素眼用乳劑，根據(jù)前期實驗結(jié)果，改變蓖麻油、吐溫用量及制備工藝參數(shù)，以獲得不同粒徑大小及分布的制劑。

2.3.2 制備工藝 按照表1 中處方組成及用量，用20%注射用水分散卡波姆共聚物A 型作為水相1；另取70%注射用水作為水相2；將蓖麻油、聚山梨酯80、甘油、環(huán)孢素攪拌溶解均勻后作為油相；油相與水相2混合，在45 ℃條件下按表2工藝參數(shù)以高速剪切制備初乳，而后加入水相1，調(diào)節(jié)溶液pH至6.0 ~ 8.0，加注射用水至終重后即得終乳。

Table 1 Prescription composition and dosage of cyclosporin ophthalmic emulsion

Table 2 Technological parameters of cyclosporin ophthalmic emulsion

2.4 EMD-PBE統(tǒng)計方法

對給定的參比制劑和受試制劑PSD 數(shù)據(jù)集，首先對所有參比樣本PSD 求取平均值從而得到平均參比樣本PSD，作為參比中心。然后應(yīng)用EMD計算單個參比樣本的PSD 到參比中心的距離，如［dR1，1，1，.....，dRi，j，k，.....］，表示單個參比樣本與參比中心之間的偏差。同樣地，利用EMD 計算每個受試樣本到參比中心之間的距離，如［dT1，1，1，.......，dTi，j，k，......］，表示單個受試樣本與參考中心之間的偏差（其中i、j、k分別表示批次、樣本數(shù)、重復(fù)測量次數(shù)）。隨后，利用PBE 對兩組EMD 進行統(tǒng)計檢驗，以建立受試制劑和參比制劑之間的BE（圖1）。利用PBE 處理一個多層次的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)（即，批次 × 樣本 × 重復(fù)測量次數(shù)）。相比于直接比較兩組PSD 曲線，本文中所使用的方法通過計算EMD 降低數(shù)據(jù)的維度，由此繞過多變量比較，并且比較了受試和參比之間的差異與參比內(nèi)部的差異，所得粒徑等效性結(jié)果具有真實性。

在此項研究中，采用動態(tài)光散射儀，以25 ℃測量角度173 ℃條件測定制劑粒徑；所有樣品均用超純水稀釋10倍后置于DTS0012樣品池中。每批參比制劑取3 個樣本，每個樣本重復(fù)測定5 次。按照以下流程進行粒徑PBE計算。

Figure 1 Schematic diagram of the proposed equivalence approach

3 結(jié) 果

3.1 參比制劑內(nèi)部等效性結(jié)果

在本節(jié)中，在4 批參比粒徑數(shù)據(jù)集中任選2 批作為R（R：參比樣本），其余2 批作為T（T：受試樣本），檢查所提出的方法接受等效產(chǎn)品的能力（例如，參比制劑本身）。圖2-A 顯示了將參比制劑與自身進行比較的測試結(jié)果?？梢钥闯?，兩個粒徑分布圖是重合的，有一些局部的變化，這表明即使參比制劑本身也存在一定程度的變化。然后將所提出的方法應(yīng)用于選定的兩組數(shù)據(jù)。圖2-B 顯示了參比樣本粒徑分布圖（橙色）和受試樣本粒徑分布圖（青色）到參比中心（即參考樣本的平均值）計算的EMD距離?？梢钥吹絻山M距離具有相似的范圍（即低于0.28）。最后，將PBE 應(yīng)用于兩組EMD距離，根據(jù)判別標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)σR＜ 0.1 時，選用常數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，即Hη2= -0.019 12 ＜ 0。參比制劑自身通過生物等效性驗證，由此說明本研究應(yīng)用的開發(fā)軟件是可靠。

Figure 2 Comparison between two sets of the reference samples (two lots) by treating one of them as Test

3.2 受試制劑等效性結(jié)果

Figure 3 Comparison between the reference samples and test samples (F1-F3)

實驗中，制備了不同處方用量和工藝參數(shù)的受試制劑，按照上述參數(shù)測定粒徑，獲得3 個受試制劑數(shù)據(jù)集，同時以4 批參比粒徑數(shù)據(jù)參比數(shù)據(jù)集，分別應(yīng)用EMD-PBE 統(tǒng)計軟件進行分析。圖3中A ~ C 分別表示處方F1 ~ F3 與參比制劑的PSD分布圖；D ~ F 表示處方F1 ~ F3 與參比制劑EMD計算結(jié)果，可以看出，處方F1 和F2 與參比制劑的PSD 是不同的并且兩者EMD 的范圍也有很大的差異，同時計算結(jié)果顯示兩者均滿足σR＜ 0.1，Hη2分別為0.005 102和0.035 99，均大于0，故未通過BE測試，由此也說明該方法具有良好的拒絕不等效產(chǎn)品的能力。處方F3 通過BE 測試，滿足σR＜ 0.1，Hη2= -0.010 20 ＜ 0。受試制劑F1 ~ F3處方用量及工藝參數(shù)的改變對粒徑大小及粒徑等效性均產(chǎn)生影響，借助EMD-PBE 統(tǒng)計分析方法，為仿制藥開發(fā)中處方和工藝篩選提供一定的幫助。

Table 3 Calculation results of equivalence parameters of test and reference preparations

4 討 論

EMD 是衡量圖像之間相似性的有效方法，雖廣泛應(yīng)用于計算機視覺應(yīng)用，但使用EMD 來比較PSD 等效性未見文獻報道。本研究應(yīng)用基于Python 語言開發(fā)的EMD-PBE 統(tǒng)計分析軟件，操作簡單快捷，從上述結(jié)果可知該分析方法可有效通過粒徑等效產(chǎn)品，拒絕不等效產(chǎn)品，為仿制制劑處方及工藝開發(fā)提供依據(jù)。

基于EMD的體外群體生物等效性的統(tǒng)計分析中，還有一部分內(nèi)容可進一步深入研究：一是研究對象的選擇，二是樣本量的確定。本研究對象環(huán)孢素眼用乳劑粒徑范圍廣泛［18］（從幾納米到幾十微米不等），導(dǎo)致其PSD 非完全單峰，故應(yīng)用該統(tǒng)計方法分析PSD 是準(zhǔn)確且可信的。在后續(xù)研究中，可選擇更多其他呈現(xiàn)復(fù)雜粒徑分布的納米制劑進行評價。FDA 在布地奈德吸入劑草案（draft）中指出樣本數(shù)量應(yīng)選擇不少于受試制劑和參比制劑各3 個批次，每個批次10 個樣品數(shù)（即≥30 個樣品）進行統(tǒng)計分析，并且每個樣本進行3個階段（包括制劑壽命初期、中期和末期）的研究，但是Chow等［19］認為 30 個樣品數(shù)并不足以達到期望功效（80%），提高功效的方法有增加樣品量或?qū)τ诿總€樣品重復(fù)測量，目前對于樣品量的計算暫無特定的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，由于參比制劑數(shù)量受限，故對每批參比制劑的每個樣本重復(fù)測定5 次以提高功效，此外結(jié)合Hu 等［10］的計算，筆者認為這里的生命周期可以理解為重復(fù)測定次數(shù)。