N6-甲基腺嘌呤去甲基化酶抑制劑研究進展

高 靜，米 雪，周 琦，周 君

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 211198）

RNA 修飾在生命活動和疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。目前，已鑒定的RNA 修飾達(dá)150余種，這些修飾廣泛分布于信使RNA（messenger RNA，mRNA）、核糖 體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA）、核內(nèi)小RNA（small nuclear RNA，snRNA）和核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）等各種RNA 上。RNA 修飾的種類繁多，不同類型的RNA 修飾的含量和功能存在較大差異［1］。其中RNA 甲基化修飾約占RNA 修飾的60%以上，是RNA 修飾的主要形式之一。甲基化修飾發(fā)生在RNA 上的位置主要是堿基的氮原子（N）、嘌呤和嘧啶的碳原子（C）、2'-OH 的氧原子（O）上。常見的RNA 甲基化修飾類型有N6-甲基腺嘌呤（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）、1-甲基腺嘌呤（m1A）、5-羥甲基胞嘧啶（hm5C）、假尿嘧啶（Ψ）等，它們在胞內(nèi)行使不同的生物學(xué)功能。而m6A修飾作為其中具有代表性的修飾之一，也是目前研究最為透徹的一種RNA修飾類型［2］。

深入研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾及其效應(yīng)蛋白與多種生理和病理過程密切相關(guān)［3］。例如，m6A 去甲基化酶FTO 的高表達(dá)與急性髓系白血病［4］、肺癌［5-6］等癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其另一去甲基化酶ALKBH5 也可通過影響m6A 修飾水平從而促進包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［7］和胃癌［8］在內(nèi)的多種腫瘤進展，因此通過小分子靶向干預(yù)m6A 效應(yīng)蛋白可作為抗腫瘤的新策略。

本文總結(jié)了有關(guān)m6A修飾的研究成果，闡述了其效應(yīng)蛋白的類型、作用方式、生物學(xué)功能以及m6A 去甲基化酶FTO 和ALKBH5 抑制劑的開發(fā)進展，為全面了解m6A去甲基化酶作為疾病診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物提供了理論基礎(chǔ)。

1 m6A甲基化修飾

1974年，Desrosiers 等［2］在 哺 乳 動 物 細(xì) 胞 的mRNA 中發(fā)現(xiàn)了m6A 的存在，即腺嘌呤第6 位氮原子上發(fā)生的單甲基化。但由于缺乏穩(wěn)定的分析方法，m6A 的分布、功能以及作用機制研究很長時間處于停滯不前的狀態(tài)。直到2011年，芝加哥大學(xué)何川教授團隊報道了第1 個m6A 去甲基化酶——FTO［9］，它可以去除mRNA 內(nèi)部的m6A 修飾，揭示m6A是一種可逆化修飾，由此開創(chuàng)并引發(fā)表觀轉(zhuǎn)錄組 學(xué) 的 研 究 熱 潮。2012年，Dominissini 等［10］和Meyer 等［11］獨立報道了全轉(zhuǎn)錄組水平m6A 的高通量測序方法（m6A-seq 或MeRIP-seq），為人們進一步研究m6A 奠定了非常堅實的基礎(chǔ)。高通量測序研究結(jié)果表明，m6A 修飾是真核生物mRNA 中豐度最高的甲基化修飾形式，它廣泛存在于病毒RNA、酵母、果蠅、植物及哺乳動物等真核生物中，并且m6A修飾位點附近的序列具有高度保守性，傾向于發(fā)生在RRACH（R=G/A，H=A/C/U）序列的腺嘌呤上，這些位點主要分布在RNA 的3'UTR、終止密碼子或者長外顯子附近，且該分布特征在人類及小鼠中是高度保守的［12］。

研究表明，m6A修飾是一種動態(tài)可逆的調(diào)節(jié)方式，它受m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶（m6A writers）和去甲基化酶（m6A erasers）的共同調(diào)控，能夠被m6A 識別蛋白（m6A readers）選擇性的識別結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，進而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能［3］。目前已發(fā)現(xiàn)的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的主要成分包括

METTL3、METTL14［13］、WTAP［14］、KIAA1429（VIRMA）［15］、RBM15［16］、HAKAI［17］、ZC3H13（KIAA0853）［18］和METTL16［19］等，它們能夠催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）的甲基轉(zhuǎn)移到腺嘌呤的第6 位氮原子上。而FTO［9］和ALKBH5［20］作為去甲基化酶能動態(tài)可逆地去除靶RNA的m6A 甲基化修飾。m6A 修飾的生物學(xué)功能主要是通過m6A識別蛋白發(fā)揮調(diào)控作用的，目前已知的識別蛋白主要有YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白（YTHDF1［21］、YTHDF2［22］、YTHDF3［23］、YTHDC1 和YTHDC2）、核不均一核糖核蛋白HNRNP 家族蛋白（HNRNPA2B1［24］、HNRNPC 和HNRNPG）和胰島素樣生長因 子2 mRNA 結(jié) 合 蛋 白IGF2BP 家 族 蛋 白［25］（IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3）。通過m6A 識別蛋白的結(jié)合，不僅可以影響mRNA 的穩(wěn)定性、促進蛋白翻譯效率、調(diào)控mRNA 與miRNA 的剪接和促進mRNA 出 核［26］。m6A 也 可以干 擾底物RNA 的結(jié)構(gòu)，作為“結(jié)構(gòu)開關(guān)”調(diào)控HNRNPC 與RNA 的結(jié)合［27］。此外，m6A 參與了多種生物學(xué)過程［28］，如干細(xì)胞分化、細(xì)胞分裂、配子發(fā)生和生物節(jié)律等，以及多種疾病的發(fā)生［29］，包括腫瘤、肥胖、神經(jīng)性疾病和不育等，在個體發(fā)育及生理病理調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。

2 m6A去甲基化酶

AlkB家族作為鐵（Ⅱ）和酮戊二酸（2-OG）依賴性加氧酶是一種重要的核酸脫甲基酶，圖1展示了9 個AlkB 人類同源蛋白的基因結(jié)構(gòu)，通過保守性分析發(fā)現(xiàn)它們都擁有“HXD…H”（X 表示任何氨基酸）和“R…R”兩個基序，已知這兩個基序分別在鐵（Ⅱ）結(jié)合以及酮戊二酸結(jié)合過程中起到重要作用。其中FTO 和ALKBH5 是值得關(guān)注的兩個m6A去甲基化酶。

圖1 人類AlkB家族的基因結(jié)構(gòu)圖以及保守性分析

2.1 FTO去甲基化酶

早在2007年就有文獻報道過FTO 的氧化去甲基化作用［30］，后續(xù)又證明甲基化的RNA 是FTO 的首選底物［31］。而2011年發(fā)表在Nature Chemical Biology雜志上的研究工作揭示了FTO 在體外針對RNA 中豐富的m6A 殘基具有高效的氧化去甲基化活性，證實核RNA 中的m6A 是FTO 的主要生理底物［9］。

如圖2 所示，F(xiàn)TO 在不用物種中的代表性轉(zhuǎn)錄本含有代表鐵（Ⅱ）結(jié)合的“HXD…H”基序和代表酮戊二酸結(jié)合的“R…R”基序。

圖2 不同物種中脂肪含量與肥胖相關(guān)蛋白(FTO)的的基因結(jié)構(gòu)圖以及保守性分析

有實驗發(fā)現(xiàn)，在脂肪形成過程中FTO 表達(dá)和m6A 水平呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)TO 消耗會阻礙分化，只有催化活性的FTO 才能恢復(fù)脂肪生成［32］。FTO 能夠一定程度上促進急性髓系白血?。?］、非小細(xì)胞肺癌［5］、人乳腺癌［33］和膀胱癌［34］等的發(fā)展。另外，F(xiàn)TO 抑制與抗PD-1阻斷相結(jié)合可能會降低黑色素瘤免疫治療的耐藥［35］。與相鄰的正常組織相比，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中FTO 能調(diào)節(jié)β-catenin 的表達(dá)，在體外和體內(nèi)增強化療-放療的抗性［36］。

2.2 ALKBH5去甲基化酶

ALKBH5 是在2013年被發(fā)現(xiàn)的第2 個m6A 去甲基化酶［37］。該研究證實其是另一種哺乳動物去甲基化酶，可在體外和體內(nèi)去除核RNA（主要是mRNA）上的m6A修飾［37］。

類似于FTO，ALKBH5轉(zhuǎn)錄本在不同物種中的代表性轉(zhuǎn)錄本（圖3）也含有代表鐵（Ⅱ）結(jié)合的“HXD…H”基序和代表酮戊二酸結(jié)合的“R…R”基序。

圖3 不同物種中AlkB同源蛋白5（ALKBH5）的基因結(jié)構(gòu)圖和保守性分析

ALKBH5 在組織中廣譜表達(dá)。其在睪丸中特別豐富，能夠影響小鼠精子發(fā)生和生育能力［38］。抑制ALKBH5 能減少自噬通量并促進缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）處理的心肌細(xì)胞的凋亡［39］。此外，ALKBH5 能夠抑制胃癌細(xì)胞［40］、肺腺癌細(xì)胞［41］和上皮性卵巢癌細(xì)胞［42］等多種細(xì)胞的生長。另有報道稱ALKBH5 的缺失使黑色素瘤對其的免疫治療增敏［43］，有助于免疫治療的療效，可作為一個潛在的治療靶點。

3 m6A去甲基化酶抑制劑的開發(fā)

3.1 FTO去甲基化酶抑制劑

FTO 是全基因組關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)的第一個肥胖風(fēng)險基因，此外，它還是第1 個被發(fā)現(xiàn)的可逆的m6A 去甲基化酶。作為非血紅素雙加氧酶超家族中的成員之一，F(xiàn)TO 能夠催化鐵（Ⅱ）和α-酮戊二酸（2-OG）依賴的底物氧化去甲基化過程，因此，從作用機制上來說，F(xiàn)TO抑制劑可分為金屬離子螯合劑、2-OG類似物和底物競爭性抑制劑3類。

通用型抑制劑N-草酰甘氨酸（N-oxalylglycine，NOG）與2-OG 有類似結(jié)構(gòu)，可以競爭性抑制FTO與下游底物的結(jié)合［44］。研究表明，環(huán)狀和非環(huán)狀2-OG 類似物都具有抑制FTO 的作用。然而由于它們較低的特異性和選擇性，難以在某些因FTO高表達(dá)導(dǎo)致疾病進展的腫瘤中作為靶向治療藥物。因此研發(fā)出高選擇性和特異性的FTO 抑制劑成為此后的研究重點。目前，已有研究報道了一些FTO 抑制劑（表1），其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

圖4 m6A去甲基化酶FTO抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

表1 已開發(fā)的N6-甲基腺嘌呤(m6A)去甲基化酶FTO抑制劑

3.1.1 大黃酸(rhein) 2012年，上海藥物研究所通過高通量虛擬篩選和生化分析等方法，將天然產(chǎn)物大黃酸（rhein，化合物1）確定為第1 個特異性較高的FTO 抑制劑［45］。根據(jù)生物物理實驗分析以及動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸既不是2-OG 結(jié)構(gòu)類似物，也不是結(jié)合2-OG 輔助因子的金屬離子螯合劑，而是通過與FTO 底物競爭，特異地結(jié)合其催化結(jié)構(gòu)域，從而抑制FTO去甲基化酶功能。

首先，限制性核酸內(nèi)切酶消化、等溫滴定量熱法、熒光偏振法和液相色譜分析等體外實驗驗證了大黃酸的抑制活性。其次，在細(xì)胞實驗中，大黃酸也被證明能夠提高人神經(jīng)瘤細(xì)胞系BE（2）-C 中總mRNA的m6A修飾水平，并且大黃酸對BE（2）-C細(xì)胞并未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，這為日后大黃酸在細(xì)胞實驗研究和臨床應(yīng)用中增加了更多的可能性。然而大黃酸對AlkB 亞家族的選擇性很?。?6］。

3.1.2 甲氯芬那酸(MA)和（(2E)-4-[N‘-（4-芐基吡啶-3-羰基）-肼基]-4-氧代丁-2-烯酸） 為了篩選FTO 的選擇性抑制劑，上海藥物所研究團隊于2015年通過高通量熒光偏振（FP）方法比較了各種藥物化合物存在下m6A-ssDNA 結(jié)合FTO 和AlkBH5 的差異［47］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)非甾體抗炎藥甲氯芬那酸（MA，化合物2）以劑量依賴的方式抑制含有m6A 的ssDNA 或ssRNA 的FTO 去甲基化，卻不能與ALKBH5 蛋白結(jié)合，也不競爭ALKBH5 與ssDNA 的結(jié)合。進一步的抑制機制研究顯示，MA既不是2-OG 的化學(xué)模擬物，也不是鐵的螯合劑，它與FTO 結(jié)合形成一個發(fā)夾基序。該基序作為核酸識別蓋（nucleotide recognition lid，NRL）的一部分，可用于提供MA 和FTO 之間額外的相互作用，而ALKBH5 恰好缺乏NRL 部分的發(fā)夾基序。因此MA 是體外FTO 去甲基化的高選擇性抑制劑，并且針對MA/FTO 結(jié)構(gòu)化合物可進行強效FTO 抑制劑的結(jié)構(gòu)引導(dǎo)設(shè)計。

同年，新加坡國立大學(xué)的TOH 研究團隊［48］基于AlkB酶的核苷酸結(jié)合位點的固有結(jié)構(gòu)差異的原理，設(shè)計合成小分子化合物來更有效地選擇性抑制AlkB 酶。在篩選的數(shù)十種化合物中，（（2E）-4-［N'-（4-芐基吡啶-3-羰基）-肼基］-4-氧代丁-2-烯酸）（化合物3）被確定為一種有效的FTO 選擇性抑制劑。它對FTO 的選擇性是其他AlkB 亞家族的30~130 倍。晶體學(xué)分析顯示，（（2E）-4-［N'-（4-芐基吡啶-3-羰基）-肼基］-4-氧代丁-2-烯酸）同時占據(jù)FTO蛋白中核苷酸與2-OG的結(jié)合位點。細(xì)胞實驗進一步表明，它的乙酯衍生物能夠抑制細(xì)胞中m6A去甲基化酶的活性。這是首次報道的一種對特定的AlkB 亞家族成員具有選擇性的抑制劑，這種選擇性為其作為功能探針和治療先導(dǎo)物提供了新思路。

3.1.3 N-CDPCB 和CHTB N-CDPCB（1a，化合物4）是由鄭州大學(xué)的?？?biāo)研究團隊于2015年設(shè)計得到的新型FTO 小分子抑制劑［49］。通過鑒定人FTO 與N-CDPCB 的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其與報道的FTO 特異性抑制劑MA 的結(jié)構(gòu)有部分重疊，并且發(fā)現(xiàn)N-CDPCB與FTO蛋白的相互作用主要是通過范德華力、疏水作用力和氫鍵來實現(xiàn)的，揭示了FTO抑制劑的一個新的結(jié)合位點以及它們相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2016年，利用相同的設(shè)計方法，該研究團隊又發(fā)現(xiàn)了另一種FTO 抑制劑CHTB（化合物5）［50］，它的作用方式與N-CDPCB相似，也是通過范德華力、疏水作用力和氫鍵來實現(xiàn)對FTO 蛋白的特異性識別的。結(jié)構(gòu)分析顯示CHTB 占據(jù)了FTO 蛋白活性位點的L 形空腔。新的結(jié)合位點的識別為進一步開發(fā)選擇性和強效的FTO 抑制劑提供了新的機會，這有望為治療肥胖或肥胖相關(guān)疾病的新治療靶點提供信息。

3.1.4 天然化合物根赤殼菌素(radicicol) 2018年，鄭州大學(xué)的?？?biāo)研究團隊在進一步研究該新結(jié)合位點的構(gòu)效關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，4-氯-1，3-二醇基團是N-CDPCB（1a）、CHTB 以及它們的類似物的共同結(jié)構(gòu)基序。因此，研究人員根據(jù)N-CDPCB/FTO復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)的新的結(jié)合位點，對具有4-氯-1，3-二醇基團的化合物進行了基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，同時利用相似性搜索和活性分析，進而確定了天然化合物根赤殼菌素（radicicol，化合物6）是一種有效的FTO 抑制劑［51］。實驗結(jié)果顯示，它對FTO去甲基化活性呈劑量依賴性抑制，半抑制濃度為16.04 μmol/L。并且兩者之間的相互作用主要是熵驅(qū)動的。晶體結(jié)構(gòu)分析表明，根赤殼菌素在FTO 結(jié)合位點采用L 形構(gòu)象，并與之前發(fā)現(xiàn)的FTO小分子抑制劑N-CDPCB占據(jù)相同的位置。該抑制劑的發(fā)現(xiàn)為設(shè)計更有效的化合物來抑制FTO 的活性提供了新的信息。

3.1.5 FB23 和FB23-2 繼2015年篩選出MA 抑制劑之后，上海藥物所Huang 等［52］在2019年進一步優(yōu)化合成了MA 衍生物FB23（化合物7）和FB23-2（化合物8）?；诮Y(jié)構(gòu)導(dǎo)向的合理設(shè)計開發(fā)的這兩種FTO 抑制劑，即FB23 和FB23-2，通過占據(jù)底物結(jié)合位點直接與FTO 結(jié)合，選擇性地抑制FTO的m6A去甲基化酶活性。

體外實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)B23-2 能顯著抑制人急性髓系白血?。ˋML）細(xì)胞系細(xì)胞和原代母細(xì)胞AML 細(xì)胞的增殖，促進其分化或凋亡。此外，F(xiàn)B23-2也能顯著抑制異種移植小鼠中的人AML細(xì)胞系和原代細(xì)胞的進展。這可能對通過靶向表觀轉(zhuǎn)錄組RNA 甲基化進行癌癥治療，產(chǎn)生廣泛的影響。

3.1.6 恩他卡朋(entacapone) 2019年，北京生命科學(xué)研究所的研究團隊使用了一種基于結(jié)構(gòu)的對美國食品藥品監(jiān)督管理局FDA 批準(zhǔn)的藥物進行虛擬篩選的方法，進而將兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）抑制劑恩他卡朋（化合物9）確定為一種潛在的FTO 抑制劑［53］。它最初被FDA 批準(zhǔn)是作為左旋多巴和卡比多巴聯(lián)合治療帕金森病的輔助治療。通過結(jié)構(gòu)和生化研究，發(fā)現(xiàn)恩他卡朋在體外直接結(jié)合FTO 并抑制FTO 活性。它可以降低飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的體重和空腹血糖濃度。此外，RNA-seq結(jié)果還鑒定出轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)OXO1）mRNA 是作為FTO 的直接底物，并證明了恩他卡朋在FTO-FOXO1調(diào)節(jié)軸對小鼠肝臟糖異生和小鼠脂肪組織生熱的調(diào)節(jié)作用中具有重要影響。

3.1.7 CS1(NSC337766)和CS2(NSC368390) 雖然m6A 修飾與各種類型癌癥的起始、進展、維持和耐藥性密切相關(guān)，但目前針對m6A 調(diào)節(jié)劑進行癌癥治療的有效抑制劑的開發(fā)仍處于起步階段。2020年，陳建軍教授團隊首先對來自美國國家癌癥研究所的上萬種化合物進行了基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選以及后續(xù)驗證分析，鑒定出兩種有效的小分子化合物CS1（化合物10）和CS2（化合物11）［54］，它們可通過靶向FTO 進而抑制癌癥干細(xì)胞的維持和免疫逃避。

CS1 和CS2 在抑制急性髓系白血病細(xì)胞活力和FTO 去甲基酶活性方面表現(xiàn)出強大效果，通過靶向FTO 并占據(jù)催化活性位點進而干擾FTO 與m6A 修飾RNA 的結(jié)合，有效地抑制其m6A 去甲基化酶活性。實驗結(jié)果顯示，CS1 和CS2 通過抑制FTO 活性和干擾FTO 的信號通路，比如激活凋亡信號通路和抑制MYC 通路，進而發(fā)揮抗白血病作用。與之前報道的FB23-2 等FTO 抑制劑相比，CS1 和CS2 在抑制急性髓系白血病細(xì)胞活力方面表現(xiàn)出10 ~ 30 倍的功效，表明它們的療效大大提高。

3.1.8 谷胱甘肽生物印跡納米復(fù)合材料(GNPIPP12MA) 盡管近年來一些小分子FTO 抑制劑的開發(fā)取得了很有前景的進展，但由于生物功能溫和、不良反應(yīng)和對白血病干細(xì)胞的敏感性和特異性較低，其臨床潛力仍然有限。2022年Cao等［55］研究開發(fā)了負(fù)載FTO 抑制劑的谷胱甘肽GSH生物印跡納米復(fù)合材料（GNPIPP12MA），它通過靶向FTO/m6A 通路協(xié)同GSH 消耗來增強抗白血病發(fā)生。

實驗結(jié)果顯示，GNPIPP12MA 可選擇性靶向白血病母細(xì)胞，尤其是白血病干細(xì)胞，通過破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)誘導(dǎo)鐵死亡。此外，GNPIPP12MA 增加了白血病干細(xì)胞中的m6A 修飾，降低了轉(zhuǎn)錄水平。GNPIPP12MA 通過增加細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的浸潤來增強抗白血病免疫，從而增強PD-L1 阻斷的療效。這項研究為靶向m6A 甲基化的GSH 生物印跡納米平臺提供了新的思路，該平臺可作為一種協(xié)同治療腫瘤干細(xì)胞的策略，有望應(yīng)用于臨床。

3.1.9 小分子抑制劑18097 2022年，研究人員通過虛擬篩選、結(jié)構(gòu)優(yōu)化和生物測定等方法開發(fā)出了一種新的FTO 小分子抑制劑18097（化合物12）［56］。

小分子抑制劑18097 通過與FTO 活性位點結(jié)合，進而抑制細(xì)胞周期過程和癌細(xì)胞遷移?？梢詫θ橄侔┘?xì)胞的表觀轉(zhuǎn)錄組進行重編程，尤其是P53通路相關(guān)基因的重編程。小分子抑制劑18097通過招募IGF2BP1 來增加mRNA 的穩(wěn)定性，進而激活P53信號通路。此外，它還抑制了細(xì)胞脂肪生成，通過下調(diào)PPARγ 和C/EBPα/β mRNA 的穩(wěn)定性來降低二者的表達(dá)。動物實驗證實，小分子抑制劑18097能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長和肺定植。綜上所述，F(xiàn)TO 可以作為一種潛在的藥物靶點，小分子抑制劑18097是一種特異性的、有效的FTO 抑制劑，可在體內(nèi)外抑制實體腫瘤細(xì)胞，尤其對乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移有抑制作用，因此可以作為一種潛在的抗乳腺癌藥物。

3.2 ALKBH5去甲基化酶抑制劑

與FTO 不同的是，ALKBH5 直至2013年才初次被報道具有m6A 去甲基化酶作用［37］，并且它也是Fe（Ⅱ）/2-OG依賴性雙加氧酶。而有關(guān)ALKBH5抑制劑的研究一直鮮有報道（表2），目前已開發(fā)的ALKBH5抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖5。

表2 已開發(fā)的m6A去甲基化酶ALKBH5抑制劑

圖5 m6A去甲基化酶ALKBH5抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3.2.1 檸檬酸鹽 2014年，Xu 等［57］發(fā)現(xiàn)TCA 循環(huán)中間體檸檬酸鹽可以作為ALKBH5 溫和型抑制劑，IC50約為488 μmol/L，具有較弱的抑制效應(yīng)。檸檬酸與ALKBH5 的結(jié)合方式與在FTO 中觀察到的不同。在FTO-檸檬酸復(fù)合物中，檸檬酸取代了2-OG，而金屬離子仍然完好無損。但在ALKBH5-檸檬酸復(fù)合物中，檸檬酸同時占據(jù)了金屬離子和2-OG。雖然還需要對ALKBH5復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進行進一步的研究，但通過初步分析ALKBH5 結(jié)合底物的特異性環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不僅可以為ALKBH5對ssRNA去甲基化的分子機制提供見解，確定檸檬酸鹽作為ALKBH5 的溫和型抑制劑，同時也為ALKBH5的高特異性抑制劑開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

由于該化合物對U87-MG 細(xì)胞的影響似乎并不依賴于其鈉通道阻斷能力，因此通過使用SPILLO-PBSS 軟件確定了MV1035 的替代脫靶相互作用。在MV1035排名最高的脫靶點中，重點關(guān)注的是RNA 去甲基化酶ALKBH5 酶，該酶在癌癥中發(fā)揮了關(guān)鍵的腫瘤抑制作用。體外實驗結(jié)果也表明，MV1035可以靶向m6A去甲基化酶ALKBH5，從而提高m6A 水平。此外結(jié)果還進一步表明，CD73 可能是作為下游靶蛋白參與MV1035 抑制ALKBH5，降低U87細(xì)胞系遷移和侵襲性的途徑。3.2.3 化合物20m 2022年，F(xiàn)ang 等［59］報道了一類新的含有1-芳基-1H-吡唑支架的ALKBH5 抑制劑。通過基于熒光極化的篩選、結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，化合物20m（化合物14）的熒光極化作用最強，IC50為0.021 μmol/L，且化合物20m對ALKBH5 比對FTO 以及其他AlkB 亞家族成員具有更高的選擇性。細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實驗（CETSA）結(jié)果顯示，化合物20m 可有效穩(wěn)定HepG2 細(xì)胞中的ALKBH5。斑點印跡實驗表明，化合物20m可提高完整細(xì)胞的m6A水平。綜上所述，化合物20m是一種高效選擇性的具有細(xì)胞活性的ALKBH5 抑制劑，可作為一種多功能的化學(xué)探針來探索ALKBH5 的生物學(xué)功能。

4 m6A去甲基化酶抑制劑的應(yīng)用與展望

越來越多的研究表明，m6A去甲基化酶在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其中去甲基化酶FTO 與急性髓系白血病［4］、胰腺癌［60］和肺癌［6］等癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其高表達(dá)會影響腫瘤細(xì)胞的生長和增殖、腫瘤干細(xì)胞的自我更新［61］、腫瘤轉(zhuǎn)移以及導(dǎo)致不良的腫瘤預(yù)后［35］。去甲基化酶ALKBH5 可通過影響m6A 修飾水平從而促進包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［7］和胃癌［8］在內(nèi)的多種腫瘤進展。因此，已經(jīng)有越來越多的去甲基化酶抑制劑被開發(fā)并應(yīng)用于抗腫瘤治療。FTO 是目前研究和發(fā)展最多的m6A 相關(guān)酶，而最新報道的FTO 抑制劑也達(dá)到了很高的活性和選擇性，并展現(xiàn)出一定的臨床應(yīng)用潛能。隨著各項技術(shù)的不斷突破，ALKBH5抑制劑的篩選也處于穩(wěn)步發(fā)展的過程中。

然而，大部分化合物仍處于生化或細(xì)胞實驗驗證階段，部分化合物即使經(jīng)過了小鼠體內(nèi)驗證，在人體環(huán)境中，其抑制效率和安全性維持仍未可知，并且對于抑制劑調(diào)控腫瘤的具體作用機制也未能清晰闡述，遠(yuǎn)不能滿足新藥的臨床前研究推進。因此，高效高選擇性抑制劑的開發(fā)和研究仍有待進一步深入。

對于已開發(fā)的小分子化合物，還需要進一步系統(tǒng)研究其調(diào)控腫瘤的機制，并通過進一步優(yōu)化，以提高其生物利用度、抑制效果和治療效果。同時分析此類抑制劑應(yīng)用于各種腫瘤之間的異同，對于腫瘤的診療具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。此外，通過藥物化學(xué)等手段篩選新的更高活性和選擇性的小分子抑制劑，開發(fā)高特異性抑制劑有助于腫瘤研究中甲基化修飾功能的探究。這些篩選出的藥物有望成為有用的工具分子，幫助研究人員進一步探索m6A 相關(guān)生物過程的機制，同時對于腫瘤臨床治療也有著積極意義。