丹皮酚納米乳的制備及血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取的考察

汪巳卜，陳 英，丁 楊，2，肖 婷，劉 文，沈祥春，陶 玲*，羅興洪，3**

（1貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州省天然藥物資源高效利用工程中心(天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），貴陽 550025；2中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；3江蘇先聲藥業(yè)有限公司，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)與創(chuàng)新藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210042）

心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVDs）是心臟、血管等循環(huán)系統(tǒng)疾病的統(tǒng)稱，包括動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病、高血壓等［1］，發(fā)病率高、致殘率和死亡率居高不下［2］。血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascularendothelial cell，VEC）是覆蓋在血管內(nèi)腔表面的連續(xù)單層扁平細(xì)胞［3］，其功能障礙是多種心血管疾病的早期致病因素，并貫穿始終，在心血管疾病的臨床早期預(yù)測及早期干預(yù)等方面具有重要的意義［4］。

丹皮酚（paeonol，Pae），也稱牡丹酚，是從芍藥、紅景天等植物中提取的生物活性酚［5-6］。藥理作用廣泛，在心血管方面具有抑制氧化應(yīng)激［7］、抗衰老、抑制凋亡［8］和減輕炎癥［9］等藥理作用。但由于Pae 具有水溶性差、穩(wěn)定性差［10］等缺點(diǎn)，目前上市的劑型如軟膏劑、片劑等存在生物利用度低、給藥半衰期短，體內(nèi)消除迅速，患者順應(yīng)性較差及靶向性能不顯著等局限，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。

納米乳（nanoemulsion，NE）是一種平均粒徑低于100 nm，外觀透明或半透明的均一分散體系［11］，可以改善脂溶性藥物溶解度及穩(wěn)定性，增加細(xì)胞攝取率和組織滲透性［12］，并具有緩釋和靶向作用，可提高藥物療效及患者順應(yīng)性。納米乳屬于熱力學(xué)穩(wěn)定系統(tǒng)，大多數(shù)耐熱壓滅菌和高速離心，不需特殊設(shè)備和制備工藝。本研究根據(jù)Pae脂溶性強(qiáng)，在油相中溶解度高的特點(diǎn)，進(jìn)行了丹皮酚納米乳（paeonol-nanoemulsion，Pae-NE）制備研究，并進(jìn)行人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的毒性及攝取效率考察，為Pae 的劑型選擇和血管內(nèi)皮損傷部位的有效遞送提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

丹皮酚（批號CHB201230，純度≥ 98%，成都克洛瑪生物科技有限公司）；甲醇（色譜醇，美國天地公司）；長鏈甘油三酯（LCT，浙江田雨山藥用油有限公司）；中鏈甘油三酯（MCT，西安天正藥用輔料有限公司）；15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯（HS15，上海協(xié)泰化工有限公司）；大豆磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司）；聚乙二醇400（PEG400，西隴科學(xué)股份有限公司）；1，2-丙二醇（中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站經(jīng)銷）；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 儀 器

U3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo 公司）；ME104/02 型分析電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；85-2B 型恒溫加熱磁力攪拌器（金壇市科析儀器有限公司）；HT7700 型透射電子顯微鏡（日本日立株式會社）；Nano-ZA 型馬爾文Zeta 電位計(jì)粒徑測定儀（美國布魯克海文儀器公司）；熒光顯微鏡（成都錦世昌祥科技有限公司）；SHZ-88 型NovoCyte 流式細(xì)胞儀（艾森生物杭州有限公司）；XDS-2B 型倒置顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 細(xì) 胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVECs，CRL-1730）來自于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法的建立及考察

Ultimate LP-C18色 譜 柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（59∶41）；檢測波長為275 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。方法學(xué)考察結(jié)果表明，Pae-NE 供試品、Pae對照品約6 min 時(shí)出峰，陰性樣品在相應(yīng)時(shí)間處無干擾，專屬性良好；以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性方程擬合，得回歸方程為Y= 0.787 5X- 0.322 3，R2= 0.999 9（n= 6），結(jié)果表明，Pae 在4 ~ 132 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD 為0.12%，表明儀器精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果RSD 分別為0.83%、0.33%和0.18%，表明該方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，12 h 取樣檢測結(jié)果RSD 為0.15%，表明Pae-NE供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 單因素法考察Pae-NE的處方

通過實(shí)驗(yàn)室的前期考察［13］，采用相轉(zhuǎn)變法制備Pae-NE。固定總質(zhì)量為1 g，Pae 為20 mg，分別稱取比例按1∶3 混合的LCT 和MCT 為油相、乳化劑和助乳化劑置于西林瓶中，室溫下適當(dāng)攪拌使完全溶解并混勻，緩慢滴加超純水，直至形成澄清、透明或半透明、黏度小的無色或藍(lán)色判定為形成納米乳，記錄所使用的水量。再分別以油相、水相、混合乳化劑為偽三元相圖的3 個(gè)頂點(diǎn)，使用Origin 8.0軟件進(jìn)行偽三元相圖繪制。以乳化區(qū)域面積大小為考察指標(biāo)，單因素法篩選乳化劑、助乳化劑、乳化劑與助乳化劑的比值（Km）。

結(jié)果表明，固定助乳化劑為1，2-丙二醇，當(dāng)乳化劑與助乳化劑比值（Km）為1∶1，乳化劑大豆磷脂與1，2-丙二醇加水之后凝固，不能成乳；HS15 與1，2-丙二醇加水之后能形成淡藍(lán)色乳液，因此選擇HS15 為乳化劑。助乳化劑分別為1，2-丙二醇、無水乙醇、PEG400 進(jìn)行Pae-NE 制備時(shí)，相比于無水乙醇和PEG400，1，2-丙二醇的偽三元相圖乳化面積最大，因此選擇1，2丙二醇為助乳化劑。

當(dāng)Km分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1 的考察結(jié)果表明，當(dāng)Km為3∶1 時(shí)乳化面積最大，因此選擇Km為3∶1。在確定上述處方參數(shù)后，進(jìn)行油相與Km不同質(zhì)量比考察，結(jié)果表明，當(dāng)靜置一段時(shí)間后，油相與Km比例為3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 的乳液均出現(xiàn)分層；1∶9、2∶8 的未分層，且呈淡藍(lán)色光?？紤]到1∶9 中乳化劑用量過大會產(chǎn)生較大毒性，因此選擇油相與Km為2∶8進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 Pae-NE處方優(yōu)化

2.3.1 CCD 星點(diǎn)效應(yīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 經(jīng)預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)可知，處方中混合油相比例、Km以及油相加入量3個(gè)因素是影響納米乳形成、粒徑大小的主要因素。故選擇處方中混合油相比例（A，%）、Km（B）、油相加入量（C，mg）為自變量，粒徑大?。╕1，nm）、Y2（PDI）為評價(jià)指標(biāo)量，用Design Expert 8.0軟件按照CCD 設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)3 因素5 水平試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

Table 1 CCD-RSM experiment design and response values

2.3.2 模型擬合及方差分析 采用Design Expert 8.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分別以Y1、Y2對A、B、C進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸方程擬合，得到的多元二次多項(xiàng)式的回歸方程如下：

本次實(shí)驗(yàn)的擬合回歸方程達(dá)到了顯著性，粒徑 與PDI 的P值 分別 為0.001、0.000 3，均 小 于0.05，表明對該模型顯著；R2約接近于1，表示模型越接近真實(shí)值。結(jié)果表明，多元相關(guān)系數(shù)R2分別為0.991 5 和0.987 2，模型顯著，能夠由實(shí)驗(yàn)因素預(yù)測響應(yīng)值變化。

響應(yīng)面法條件優(yōu)化得到最佳處方為：當(dāng)固定Pae 為20 mg，LCT 為55.1 mg、MCT 為144.9 mg、HS15 為600 mg、1，2 丙 二 醇 為200 mg，粒 徑 為28.12 nm，PDI為0.170。

2.3.3 最佳處方的驗(yàn)證 按照“2.3.2”項(xiàng)下所得最佳處方，同法制備了3 份Pae-NE 對模型進(jìn)行驗(yàn)證，粒徑實(shí)測值分別為26.64、27.28、27.55 nm，與預(yù)測值的偏差為0.96 nm，PDI 實(shí)測值分別為0.200、0.188、0.202，與預(yù)測值的偏差為0.027，得到粒徑的實(shí)測值與預(yù)測值的偏差為0.96 nm，PDI實(shí)測值與預(yù)測值的偏差為0.027，實(shí)測值與預(yù)測值接近，表明其與最佳條件下的結(jié)果基本一致。

2.3.4 外觀形態(tài)考察 取Pae-NE 適量置于銅網(wǎng)上，濾紙吸去多余的液體，再用2%的磷鎢酸溶液負(fù)染1 min，自然晾干后置于透射電鏡下觀察其形態(tài)。結(jié)果表明，制備得到的Pae-NE外觀澄清、透明呈淡藍(lán)色狀態(tài)，大小較均勻，形態(tài)呈類球形，結(jié)果見圖1。

Figure 1 Appearance diagram and TEM of paeonol-nanoemulsion (Pae-NE)

2.3.5 粒徑及Zeta 電位測定 取Pae-NE 適量，稀釋至適宜濃度，均勻分散后，采用馬爾文激光粒徑分析儀測定納米乳的粒徑和Zeta 電位。結(jié)果表明，制備所得的Pea-NE 平均粒徑大小為（25.69 ± 0.03） nm、PDI 為0.182 ± 0.09，Zeta 電位為-（4.01 ± 0.3） mV。

2.3.6 儲存穩(wěn)定性考察 將制備好的Pea-NE 置于（20 ± 5）℃室溫放置，分別于第1、3、7、10、15、30天時(shí)觀察納米乳的顏色、分層等情況，同時(shí)測量其粒徑和PDI。結(jié)果表明，在第1、3、5、7、10、15、30天的平均粒徑分別為27.51、26.24、26.83、26.53、26.15、25.45、25.13 nm，PDI 分別為0.159、0.171、0.170、0.182、0.171、0.192、0.126。結(jié)果表明，Pae-NE的粒徑、PDI及外觀形態(tài)在30 d內(nèi)幾乎沒有改變，說明Pae-NE在30 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 稀釋穩(wěn)定性的考察 于（20 ± 5）℃室溫下，分別將Pae-NE 稀釋5、20、50、100 倍，考察稀釋倍數(shù)是否對粒徑有影響。結(jié)果表明，稀釋5、20、50、100 倍后，其粒徑分別為23.96、23.54、22.75、23.32 nm。說明稀釋100 倍以內(nèi)對Pae-NE 的穩(wěn)定性影響較小。

2.3.8 Pae-NE 載藥量的測定 取Pae-NE 供試品溶液、Pae 對照品溶液適量，采用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下方法測定Pae 峰面積，根據(jù)公式計(jì)算得 Pae-NE 的含量。測得3 批次Pae-NE 的載藥量分別為1.949、1.999、1.953 mg/mL，平 均 值 為（1.967 ± 0.28） mg/mL，RSD 為0.014%。

2.3.9 Pae-NE 包封率的測定 取Pae-NE 乳液0.25 mL 置10 mL 量瓶中，無水乙醇溶解并定容，按“2.1”項(xiàng)下方法測定，根據(jù)峰面積計(jì)算Pae 含量（Wtotal）；另取Pae-NE 乳液2 mL 于截留分子量50 000 超濾管上 腔中，3 500 r/min 離心30 min，取超濾液0.25 mL 置于10 mL 量瓶中，無水乙醇稀釋并定容，按“2.1”項(xiàng)下方法測定，記錄峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算游離Pae 的含量（Wfree），計(jì)算得3 批次Pae-NE 包封率為分別為99.27%、99.34% 和99.46%，平均值為（99.36 ± 0.1） %。2.4 體外釋放及釋放機(jī)制的研究

采用動態(tài)透析法考察Pae-NE的釋藥性［14］。采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）為釋放介質(zhì)，在處理后的透析袋中分別加入Pae-NE 溶液1 mL 和相當(dāng)量的Pae 原料藥，兩端用細(xì)繩密封，將袋子放入裝有釋放介質(zhì)99 mL 的圓底燒瓶中，置（37 ± 0.5） ℃恒溫水浴搖床上以100 r/min 的速度振蕩。分別在0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 h取出溶液1 mL，同時(shí)加入相同溫度和體積的新鮮透析液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定并記錄峰面積。計(jì)算其累積釋放率（%），以時(shí)間t為橫坐標(biāo)，累積釋放率為縱坐標(biāo)繪制曲線圖，擬合釋放曲線，結(jié)果見圖2。為初步研究Pae-NE 的釋藥機(jī)制，根據(jù)體外累積釋放量（Qn）進(jìn)行各釋放方程擬合及相關(guān)系數(shù)的比較，結(jié)果見表2。

Figure 2 Cummulative release profiles of Pae-NE in vitro（± s, n = 3）

結(jié)果表明，Pae-NE 在12 h前釋放的速率較Pae更快，累積釋放率達(dá)到了81.77%，而在12 ~ 24 h后釋放速率變化不大。分別使用Weibull 模型、Ritger-pappas 模型、一級釋放模型、零級釋放模型、Higuchi 模型進(jìn)行擬合，結(jié)果說明Pae-NE 釋放模式可能符合Weibull 模型，表明體外釋放的過程是連續(xù)和動態(tài)的。

2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%血清、1%雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基將細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80% ~ 90%時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5.2 MTT 法檢測安全濃度范圍 以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔板中，每孔加入完全培養(yǎng)基200 μL，并設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，最外圈加入PBS 溶液200 μL，24 h 細(xì)胞貼壁后，吸出舊的培養(yǎng)基，在不同的96孔板中分別加入相應(yīng)濃度的Pae、Pae-NE和納米乳空白載體組（B-NE），以未處理的細(xì)胞作為正常對照組（Control）。24 h 后加入5 mg/mL 的MTT 20 μL，輕輕搖勻，避免液體流出，孵育4 h 后吸出上清液，加入DMSO 150 μL，振搖10 min，至藍(lán)紫色結(jié)晶溶解，采用酶標(biāo)儀在490 nm 波長下測吸收度（A），按公式（細(xì)胞存活率 =Atest/Acontrol× 100%）計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，與正常組比較，當(dāng)與Pae 質(zhì)量濃度 10-1~ 10-3μg/mL 相當(dāng)時(shí)，Pae-NE、B-NE 對HUVECs的生長無顯著影響。

Table 2 Fitting results of the Pae-NE in vitro release model

Figure 3 Cell viability of Pae (A), Pae-NE (B), and B-NE (C) (± s, n = 3)

2.5.3 熒光顯微鏡考察HUVECs 細(xì)胞定性攝取 將適量綠色熒光探針香豆素6（C6）加入油相，按“2.3.3”項(xiàng)下最佳處方制備Pae-NE，得含C6 的Pae-NE 樣品；將C6 和Pae 一起加入到適量DMSO中充分溶解，得含C6 的Pae 樣品；以C6 溶液為空白對照組。取對數(shù)生長期的HUVECs 細(xì)胞株以每孔1 mL，每孔50 000 個(gè)細(xì)胞的密度接種于12 孔板中，培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)基，分別加入含C6 質(zhì)量濃度為100 ng/mL 的C6、Pae 以及Pae-NE 樣品液，孵育4 h。用預(yù)冷的PBS 洗3 次，加入0.5%多聚甲醛固定液500 μL，避光10 min，棄固定液，PBS 洗2遍，每次洗3 min，棄去PBS，加入DAPI（10 μg/mL）染色液300 μL，染色8 min，去染色液，PBS 洗2 遍，每次3 min，倒置熒光顯微鏡觀察并拍攝圖像，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，C6 和Pae 組中沒有明顯的綠色熒光，而Pae-NE組中綠色熒光較強(qiáng)，說明NE作為載體能夠增強(qiáng)細(xì)胞對Pae的攝取。

Figure 4 Qualitative analysis of cell uptake of C6 （A）, Pae （B） and Pae-NE （C）

2.5.4 流式細(xì)胞儀考察HUVECs 細(xì)胞定量攝取 將細(xì)胞密度調(diào)整為每孔80 000 個(gè)，接種于12 孔板中，培養(yǎng)24 h 貼壁后，吸出培養(yǎng)基，用PBS 洗兩次，分別加入含C6 質(zhì)量濃度為100 ng/mL 的Pae 以及Pae-NE樣品液1 mL，以只加入相同濃度的C6 溶液組作為對照組孵育4 h，用PBS 清洗3 次，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，加入PBS 1 mL重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖5。流式定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果與熒光顯微鏡結(jié)果一致，Pae-NE 組的熒光攝取均比C6、Pae組高（P＜ 0.001）。

3 結(jié)論與討論

血流是藥物遞送系統(tǒng)從給藥部位到預(yù)定作用部位的主要運(yùn)輸途徑。血管內(nèi)皮具有代表了血液可獲得的一個(gè)巨大的表面積［15］。在許多情況下，血管系統(tǒng)的組成部分代表治療靶點(diǎn)。內(nèi)皮細(xì)胞排列在血管系統(tǒng)的管腔表面，扮演著血流中納米藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)［3］。在心血管疾病的進(jìn)程中，血管內(nèi)皮通透性增加，這為納米藥物輸送系統(tǒng)提供一種將藥物從管腔側(cè)運(yùn)輸?shù)絻?nèi)部的捷徑［16］。

文獻(xiàn)報(bào)道和實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，采用單獨(dú)的LCT 或MCT 均對人體產(chǎn)生不利影響，混合油相有利于降低單一油相脂質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，并提高穩(wěn)定性［13-14］。故本課題以脂溶性藥物Pae 為模型藥物，以MCT 與LCT 比3∶1 為混合油相，采用低能乳化法中的相轉(zhuǎn)變法進(jìn)行Pae-NE制備考察。此法可以降低制備過程對藥物的物理破壞，適合于Pae這類熔點(diǎn)低、不耐熱的物質(zhì)。同時(shí)因其制作方法簡單、成本低、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)［17］，是制備納米乳常用的方法。

體外釋放結(jié)果表明，Pae-NE 中存在的油相與乳化劑等可以提高Pae 的溶解度［18］，Pae 可能以更好的分子狀態(tài)分散于納米乳中，改善釋放度，使得納米乳表面及其附近的區(qū)域所吸附或乳液中藥物快速進(jìn)入釋放介質(zhì)中，從而有利于難溶性藥物的釋放，并在早期以較為恒定的速度緩慢釋放；吸附形式的Pae 釋放完畢后以及親脂性藥物Pae 與NE內(nèi)部的脂質(zhì)基質(zhì)之間的強(qiáng)親和作用，更多的藥物被包埋在納米乳的油核中，后期釋放較難。但整個(gè)體外釋放的過程是連續(xù)和動態(tài)的。

Pae-NE 對HUVECs 的安全濃度范圍考察結(jié)果表明，Pae-NE 中含Pae 為10-1時(shí)，對HUVECs 的生長無顯著抑制作用，說明所制備的Pae-NE 可能具有較大的安全濃度范圍，然而當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 μg/mL 時(shí)，HUVECs 的損傷較大，可能是混合乳化劑用量過大，透過性增強(qiáng)或進(jìn)入細(xì)胞的劑量過大或兩者加和原因所致。另外，本研究得到的Pae-NE 顯著提高了Pae 在HUVECs 中的攝取效率，可能是由于納米乳具有粒徑小、乳劑油相與細(xì)胞膜性質(zhì)相似等特點(diǎn)，增強(qiáng)了HUVECs 對Pae 的攝取，為Pae和血管損傷相關(guān)遞送系統(tǒng)研究提供了參考。

Figure 5 Quantitative analysis of cell uptake of C6, Pae and Pae-NE