新型三氟甲基查耳酮類衍生物的設(shè)計(jì)、合成及體外抗宮頸癌活性

玉蘇普瓦吉木·阿力木江，艾孜提艾力·艾海提，木合布力·阿布力孜，楊 爭(zhēng)，賽力克阿拉·阿里汗，劉正葉

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011）

宮頸癌是一種全球性婦科腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中均居于第4 位［1-2］。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國(guó)每年新增宮頸癌患者達(dá)13萬(wàn)，嚴(yán)重威脅女性健康和生命安全［3-4］。目前對(duì)于宮頸癌的治療主要以放療、化療和手術(shù)為主［5］。宮頸癌的化療中，由于化療藥物的選擇性差，全身性不良反應(yīng)較嚴(yán)重，并容易產(chǎn)生耐藥，成為導(dǎo)致療效不理想、影響患者5年生存率的主要原因［6］。以腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路中的潛在治療靶點(diǎn)為干預(yù)目標(biāo)，用天然先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化途徑，研究發(fā)現(xiàn)新型有效低毒的抗腫瘤藥物是當(dāng)前新藥研究的一個(gè)熱點(diǎn)［7］。

轉(zhuǎn)錄因子p53是重要的促凋亡蛋白，參與包括細(xì)胞生長(zhǎng)、周期阻滯、衰老或凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤基質(zhì)以及抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)過程［8-9］。鼠雙微粒體2（MDM2）作為p53 的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，可以直接與p53 結(jié)合，從而降低p53 的穩(wěn)定性，并使其降解［10-12］，因此MDM2 被視為通過綁架p53 來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的致癌因子，受到關(guān)注。若能通過抑制劑來(lái)阻斷MDM2-p53蛋白之間的相互作用，下調(diào)MDM2 的表達(dá)，取消MDM2 對(duì)促凋亡蛋白p53 的綁架作用，則可以使p53 從MDM2 上游離出來(lái)，恢復(fù)和激活p53 的抑癌功能，這是通過干預(yù)Akt-MDM2-p53 通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)增強(qiáng)抗腫瘤作用的重要途徑［13-14］。

查耳酮類化合物是存在于甘草、明日葉等植物中的多酚類黃酮物質(zhì)，具有1，3-二苯基丙烯酮結(jié)構(gòu)骨架［15］，分子具有較好的可塑性，并有一定的抗腫瘤活性［16-18］。近期研究顯示，有些查耳酮類衍生物對(duì)p53 和MDM2 介導(dǎo)的信號(hào)通路或靶點(diǎn)能產(chǎn)生影響［19-20］。本課題組由此得到啟發(fā)，在天然查耳酮類的抗腫瘤活性篩選中發(fā)現(xiàn)，甘草特殊品種脹果甘草中的查耳酮成分甘草查耳酮B 對(duì)MDM2 蛋白表達(dá)產(chǎn)生較明顯的下調(diào)作用，具有可深入研究的潛力［21］。查耳酮結(jié)構(gòu)骨架和甘草查耳酮B 的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

Figure 1 Chemical structures of chalcone and licochalcone B

含氟官能團(tuán)在藥物結(jié)構(gòu)修飾中的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越得到關(guān)注。三氟甲基作為一種含氟官能團(tuán)，因其電負(fù)性較高，能增加分子的親脂性，提高與靶點(diǎn)的親和力，提高代謝穩(wěn)定性，增強(qiáng)藥物的生物利用度，從而得到重視［22-23］。

本課題組在前期研究中，對(duì)查耳酮骨架通過氯代、甲氧基化、α-甲基化修飾等途徑得到抗宮頸癌活性較高的抗腫瘤化合物［24］。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以甘草查耳酮B 為先導(dǎo)化合物骨架結(jié)構(gòu)，經(jīng)在其B 環(huán)上引入三氟甲基、α-位甲基，A 環(huán)上引入甲氧基等途徑，設(shè)計(jì)并合成了15 個(gè)全新三氟甲基查耳酮類衍生物，經(jīng)對(duì)多種宮頸癌細(xì)胞的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有顯著的增殖抑制、促進(jìn)凋亡、抗癌遷移侵襲特點(diǎn)的候選藥物，并通過對(duì)正常細(xì)胞的毒性初步評(píng)估安其全性；與此同時(shí)，通過計(jì)算機(jī)輔助的分子對(duì)接技術(shù)，研究候選藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞Akt-MDM2-p53 通路中的MDM2蛋白靶點(diǎn)的親和力特征，探討初步可能的作用機(jī)制，為新型查耳酮類抗宮頸癌候選藥物篩選奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

順鉑對(duì)照品（美國(guó)AbMole 公司）；MDM2 拮抗劑Nutlin-3a（上海MCE 公司）；其余試劑和溶劑均購(gòu)自商業(yè)來(lái)源，無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用；胎牛血清（美國(guó)Sigma 公司）；青霉素/鏈霉素溶液、胰酶、DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）。

1.2 儀 器

WRX-4 顯微熔點(diǎn)儀（寧波科誠(chéng)儀器有限公司）；LTQ-Orbitrap XL 賽默飛組合式高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；ZF-7 型暗箱三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；SOPTOP 型倒置顯微鏡（寧波舜宇儀器公司）；Victor nivo 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)珀金埃爾默有限公司）；BD 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；人宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa、C-33A、人宮頸上皮永生化細(xì)胞H8，人類永生化表皮細(xì)胞HaCaT 均由新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

2 目標(biāo)化合物的合成

將化合物1（5 mmol）和化合物2（5 mmol）在無(wú)水乙醇（12.5 mL）中溶解，緩慢滴加氫氧化鉀溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%）2.5 mL，反應(yīng)液于室溫條件下攪拌反應(yīng)，TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完成后用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至1.0 ~ 2.0，過濾，用冷無(wú)水乙醇多次沖洗純化，粗產(chǎn)物干燥后，加入少量無(wú)水乙醇加熱溶解，進(jìn)行重結(jié)晶，或者用硅膠柱色譜進(jìn)行分離（流動(dòng)相為乙酸乙酯-石油醚）得到目標(biāo)化合物3a ~ 3o。目標(biāo)化合物的合成路線如圖2所示。

Figure 2 Synthetic route of compounds 3a-3o

2.1 目標(biāo)化合物的抗腫瘤活性

2.1.1 抗細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn) 以查耳酮、順鉑和Nutlin-3a 作為陽(yáng)性對(duì)照，采用MTT 法測(cè)定目標(biāo)化合物3a ~ 3o 對(duì)HeLa、SiHa、C-33A、H8 以及HaCaT細(xì)胞的增殖抑制活性。分別將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔5 000 ~ 8 000 個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板上。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，棄去培養(yǎng)基，將不同濃度（0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L）的化合物加入96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。藥物作用48 h 后，每孔加5 mg/mL MTT 溶液20 μL，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，移除培養(yǎng)基和MTT，每孔加入DMSO 150 μL 以溶解甲臜，振蕩均勻。使用多功能酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸收度。通過吸收度計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率?；衔锘钚砸园霐?shù)抑制濃度IC50來(lái)表達(dá)。

2.1.2 細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用Transwell 小室實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，制成每毫升2 × 105個(gè)細(xì)胞的懸液，分別給予0（空白對(duì)照組）、6.25、12.5 μmol/L 的化合物3n 刺激，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)平行組。分別取上述給藥后的細(xì)胞懸液200 μL加入到Transwell小室上層，下層中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL。將細(xì)胞侵襲小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，上室用PBS 洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，1%結(jié)晶紫染色30 min，晾干，于倒置顯微鏡下觀察穿過基底膜的侵襲細(xì)胞。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取平均值作為檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell 上室先用基質(zhì)膠（基質(zhì)膠與PBS 體積比為1∶8）50 μL 鋪膠，將細(xì)胞侵襲小室置于培養(yǎng)箱中，將Matrigel 烘干。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同“細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)”。

2.1.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa 細(xì)胞，常規(guī)制備細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞以每孔2 × 105個(gè)的密度接種于6 孔板中，并用不同濃度的化合物3n處理24 h 后，收集、洗滌細(xì)胞，先后加入Annexin Ⅴ-FITC、PI 試劑各5 μL，混勻，于室溫下避光孵育15 min 后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并通過Flow Jo 10 軟件分析各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.1.4 細(xì)胞周期阻滯實(shí)驗(yàn) 采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa 細(xì)胞，常規(guī)制備細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞以每孔1 × 106個(gè)的密度接種于6 孔板中，并用不同濃度的化合物3n 處理24 h 后，收集、洗滌細(xì)胞，在4 ℃下用70%乙醇固定24 h。用預(yù)冷的PBS 洗細(xì)胞3 遍，除去殘留的乙醇，加入PI/RNase A 染色液500 μL，室溫下避光孵育30 min進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣本的DNA 含量，并通過Flow Jo 10 軟件分析細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

為了預(yù)測(cè)化合物與MDM2 蛋白可能的結(jié)合模式，本研究將一種表現(xiàn)良好且有選擇性的化合物3n 用于分子對(duì)接研究。采用Chem Bio3D Ultra 14.0 繪制目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)并進(jìn)行能量最小化，保存為mol2 格式。將優(yōu)化的目標(biāo)化合物導(dǎo)入 AutodockTools 1.5.6 進(jìn)行加氫、計(jì)算并分配電荷、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為“pdbqt”格式。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載MDM2 蛋白（PDB ID：5TRF），使用PyMoL（2.3.0）去除水分子，將蛋白導(dǎo)入AutoDocktools 1.5.6 進(jìn)行加氫、計(jì)算并分配電荷、指定原子類型并保存為“pdbqt”格式。采用AutodockVina 1.1.2進(jìn) 行 對(duì) 接，利 用PyMOL 2.3.0、Discovery Studio2016對(duì)結(jié)果進(jìn)行相互作用分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 目標(biāo)化合物的合成

本研究以甘草查耳酮B 為先導(dǎo)化合物，設(shè)計(jì)15 種氟代查耳酮衍生物的結(jié)構(gòu)，并通過類似的合成路線制備各衍生物，即在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，以無(wú)水乙醇為溶劑，氫氧化鉀為催化劑的條件下，對(duì)三氟甲基苯丙酮和甲氧基取代苯甲醛類化合物通過Claisen-Schmidt 縮合反應(yīng)得到目標(biāo)化合物3a ~ 3o，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR 和HRMS（ESI）表征。

3.2 譜圖解析

α-甲基-2＇-三氟甲基-2，3-二甲氧基查耳酮（3a）白色結(jié)晶，收 率72.1%。 mp：126.3 ~ 126.7 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 0（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.90（d，J= 7.8 Hz，1H，C3‘-H），7.86 ~ 7.71（m，2H，C4‘-H，C5‘-H），7.59（d，J= 7.5 Hz，1H，C6‘-H），7.22 ~ 7.08（m，4H，C4-H，C5-H，C6-H，β-H），3.81（s，3H，C2-OCH3），3.52（s，3H，C3-OCH3），2.14（d，J= 1.4 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ： 197.83，152.93，147.60，141.27，138.80，137.95，132.60，130.44，129.22，128.76（2C），126.98，126.93，124.56，121.71，114.68，60.82，56.17，13.04。

α-甲基-3＇-三氟甲基-2，3-二甲氧基查耳酮（3b）白色結(jié)晶，收 率56.2%。mp：123.7 ~ 125.1 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 1（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.07 ~ 7.98（m，3H，C2‘-H，C4‘H，C5‘-H），7.81（t，J= 7.9 Hz，1H，C6‘-H），7.28（s，1H，β-H），7.22 ~ 7.07（m，3H，C4-H，C5-H，C6-H），3.84（s，3H，C2-OCH3），3.66（s，3H，C3-OCH3），2.13（t，J= 1.1 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ：197.40，152.90，147.48，139.43，138.58，136.84，133.22，130.18，129.48，128.68，128.65，125.99，125.95，124.42，121.75，114.33，60.71，56.18，14.32。

α-甲基-4＇-三氟甲基-2，3-二甲氧基查耳酮（3c）白色固體，收 率42.7%。mp：124.9 ~ 125.7 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 1（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.92（s，4H，C2‘-H，C3‘-H，C5‘-H，C6‘-H），7.31（d，J= 1.7 Hz，1H，β-H），7.23 ~ 7.06（m，3H，C4-H，C5-H，C6-H），3.84（s，3H，C2-OCH3），3.66（s，3H，C3-OCH3），2.14（d，J= 1.4 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ： 197.79，152.92，147.50，142.39，139.13，136.90，130.17（2C），129.49，125.75（2C），125.71（2C），124.41，121.78，114.34，60.84，56.16，14.17。

α-甲基-2＇-三氟甲基-2，4-二甲氧基查耳酮（3d）黃色結(jié)晶，收率78.1%。mp：115.4~115.9 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 1（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.89 ~ 7.82（m，1H，C3‘-H），7.82 ~ 7.68（m，2H，C4‘-H，C5‘-H），7.48（dd，J= 17.3，8.0 Hz，2H，C6‘-H，C6-H），7.17（d，J= 1.6 Hz，1H，β-H），6.63（dd，J= 8.6，2.4 Hz，1H，C5-H），6.58（d，J= 2.4 Hz，1H，C3-H），3.81（s，3H，C2-OCH3），3.67（s，3H，C4-OCH3），2.11（d，J= 1.4 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ： 197.68，162.59，159.36，141.22，139.29，134.74，132.59，131.49，130.28，128.83（2C），126.94，126.90，116.45，105.78，98.77，56.25，55.88，13.31。

α-甲基-3＇-三氟甲基-2，4-二甲氧基查耳酮（3e）黃色結(jié)晶，收 率69.8%。mp：114.3 ~ 125.7 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 2（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.01（s，1H，C2‘-H），7.97（dd，J= 7.0，2.2 Hz，2H，C4‘-H，C5‘-H），7.89 ~ 7.73（m，1H，C6‘-H），7.47（dd，J= 8.5，2.2 Hz，1H，C6-H），7.32（d，J= 2.1 Hz，1H，β-H），6.75 ~ 6.60（m，2H，C3-H，C5-H），3.84（s，3H，C2-OCH3），3.74（s，3H，C4-OCH3），2.14（q，J= 1.4 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ：197.28，162.28，159.27，139.92，139.16，133.75，133.41，131.27，130.05，128.31，128.27，126.03，125.99，116.66，105.57，98.67，56.03，55.80，14.24。

α-甲基-4＇-三氟甲基-2，4-二甲氧基查耳酮（3f）黃色結(jié)晶，收 率75.9%。 mp：112.7 ~ 112.9 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 0（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.92 ~ 7.80（m，4H，C2‘-H，C3‘-H-，C5‘-H，C6‘-H），7.48（d，J= 8.5 Hz，1H，C6-H），7.30（d，J= 1.7 Hz，1H，β-H），6.69 ~ 6.59（m，2H，C3-H，C5-H），3.83（s，3H，C2-OCH3），3.74（s，3H，C4-OCH3），2.13（d，J= 1.4 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ：197.71，162.34，159.25，143.04，139.64，133.96，131.46，130.11（2C），125.72（2C），125.68（2C），116.65，105.63，98.71，56.18，55.86，14.25。

α-甲基-2＇-三氟甲基-2，5-二甲氧基查耳酮（3g） 淡黃色結(jié)晶，收率47.5%。mp：111.2 ~ 112.6 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 1（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.88（d，J= 7.7 Hz，1H，C3‘-H），7.83 ~ 7.69（m，2H，C4‘-H，C5‘-H），7.54（d，J= 7.4 Hz，1H，C6‘-H），7.14（d，J= 1.7 Hz，1H，β-H），6.98（dd，J= 5.1，2.3 Hz，3H，C3-H，C4-H，C6-H），3.75（s，3H，C2-OCH3），3.63（s，3H，C5-OCH3），2.12（d，J= 1.5 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ：197.79，153.12，151.91，141.24，138.84，137.26，132.65，130.50，128.88（2C），127.02，126.98，124.38，116.47，115.66，112.86，56.54，55.98，13.25。

α-甲基-3＇-三氟甲基-2，5-二甲氧基查耳酮（3h） 淡黃色結(jié)晶，收率54.1%。mp：111.3 ~ 112.3 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 1（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.05 ~ 7.97（m，3H，C2‘-H，C4‘-H，C5‘-H），7.79（t，J= 7.9 Hz，1H，C6‘-H），7.24（d，J= 1.7 Hz，1H，β-H），7.06 ~ 6.94（m，3H，C3-H，C4-H，C6-H），3.76（s，3H，C2-OCH3），3.71（s，3H，C5-OCH3），2.13（d，J= 1.4 Hz，2H，α-OCH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ：197.33，153.11，151.85，139.41，138.75，136.13，133.60，130.21，128.73，128.69，126.21，126.17，124.67，115.85，115.83，112.54，56.33，55.97，14.32。

α-甲基-4＇-三氟甲基-2，5-二甲氧基查耳酮（3i） 淡黃 色結(jié) 晶，收率72.1%。mp：113.8 ~ 113.7 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 1（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.90（s，4H，C2‘-H，C3‘-H，C5‘-H，C6‘-H），7.25（d，J= 1.7 Hz，1H，β-H），7.05（d，J= 2.3 Hz，1H，C6-H），6.99（d，J= 2.5 Hz，2H，C3-H，C4-H），3.77（s，3H，C2-OCH3），3.71（s，3H，C5-OCH3），2.13（d，J= 1.4 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ：197.70，153.11，151.80，142.44，139.31，136.32，130.28（2C），125.80（2C），125.76（2C），124.65，115.94，115.90，112.58，56.39，55.97，14.26。

α-甲基-2＇-三氟甲基-2，6-二甲氧基查耳酮（3j） 白 色 粉 末，收 率82.4%。 mp：117.3 ~ 117.8 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 0（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ： 7.87（d，J= 7.8 Hz，1H，C3‘-H），7.83 ~ 7.68（m，2H，C4‘-H，C5‘-H），7.51（d，J= 7.5 Hz，1H，C6‘-H），7.34（t，J= 8.3 Hz，1H，C4-H），6.84（s，1H，β-H），6.69（dd，J= 8.5，1.1 Hz，2H，C3-H，C5-H），3.75（d，J= 1.1 Hz，6H，C2-OCH3，C6-OCH3），1.78（t，J= 1.3 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ：197.53，157.56（2C），139.94，139.38，138.95，132.56，131.46，130.40，128.78（2C），127.03，126.98，112.27，104.40（2C），56.13（2C），14.34。

α-甲基-3＇-三氟甲基-2，6-二甲氧基查耳酮（3k） 白 色 結(jié) 晶，收 率78.1%。mp：115.7 ~ 116.8 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 0（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.08 ~ 7.97（m，3H，C2‘-H，C4‘-H，C5‘-H），7.81（t，J= 7.7 Hz，1H，C6‘-H），7.36（t，J= 8.4 Hz，1H，C4-H），6.98 ~ 6.93（m，1H，β-H），6.74（d，J= 8.4 Hz，2H，C3-H，C5-H），3.81（s，6H，C2-OCH3，C6-OCH3），1.82 ~ 1.78（m，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ： 197.09，157.56（2C），139.30，137.93，136.86，133.56，131.11，130.29，128.85，128.81，126.26，126.22，112.42，104.41（2C），56.10（2C），15.37。

α-甲基-4＇-三氟甲基-2，6-二甲氧基查耳酮

（3l） 白 色 結(jié) 晶，收 率85.4%。 mp：117.5 ~ 118.2 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 1（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.91（d，J= 2.3 Hz，4H，C2‘-H，C3‘-H，C5‘-H，C6‘-H），7.37（t，J= 8.4 Hz，1H，C4-H），6.98（s，1H，β-H），6.73（d，J= 8.4 Hz，2H，C3-H，C5-H），3.81（s，6H，C2-OCH3，C6-OCH3），1.81（s，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ： 197.39，157.56（2C），142.34，138.05，137.65，131.18，130.29（2C），125.83（2C），125.79（2C），112.43，104.38（2C），56.14（2C），15.16。

α-甲基-2＇-三氟甲基-3，4-二甲氧基查耳酮（3m） 白色塊狀固體，收率54.8%。mp：116.3 ~ 116.9 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 2（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.88（d，J= 7.8 Hz，1H，C3‘-H），7.77（dt，J= 25.2，7.5 Hz，2H，C4‘-H，C5‘-H），7.56（d，J= 7.5 Hz，1H，C6‘-H），7.14 ~ 7.06（m，2H，C2-H，C6-H），7.06 ~ 6.99（m，2H，C5-H，β-H），3.81（d，J= 13.2 Hz，6H，C3-OCH3，C4-OCH3），2.27（d，J= 1.3 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ：197.66，150.54，149.03，146.15，139.11，135.10，132.64，130.26，128.86（2C），127.88，126.98，126.93，124.28，113.94，111.89，55.90，55.88，13.21。

α-甲基-3＇-三氟甲基-3，4-二甲氧基查耳酮（3n） 白色塊狀固體，收率48.9%。mp：115.0 ~ 115.9 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 1（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.01 ~ 7.92（m，3H，C2‘-H，C4‘-H，C5‘-H），7.77（t，J= 7.7 Hz，1H，C6‘-H），7.21 ~ 7.10（m，3H，C2-H，C6-H，β-H），7.05（d，J= 8.3 Hz，1H，C5-H），3.79（d，J= 14.8 Hz，6H，C3-OCH3，C4-OCH3），2.24（d，J= 1.3 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ： 197.58，150.21，148.96，143.94，140.08，134.26，133.46，130.06，128.37，128.34，128.19，125.80，125.76，124.00，114.09，112.01，56.02，55.97，14.54。

α-甲基-4＇-三氟甲基-3，4-二甲氧基查耳酮（3o） 白色塊狀固體，收率58.2%。mp：115.5 ~ 116.2 ℃；HRMS（ESI）m/z：C19H17F3O3Na+［M+Na］+373.102 2（Calcd.），373.102 1（Found）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.87（q，J= 8.3 Hz，4H，C2‘-H，C3‘-H，C5‘-H，C6‘-H），7.20 ~ 7.10（m，3H，C2-H，C6-H，β-H），7.04（d，J= 8.4 Hz，1H，C5-H），3.79（d，J= 15.0 Hz，6H，C3-OCH3，C4-OCH3），2.23（d，J= 1.3 Hz，3H，α-CH3）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ：197.91，150.24，148.95，144.45，142.99，134.24，130.10（2C），128.17，125.82（2C），125.78（2C），124.03，114.20，111.97，56.01，55.99，14.38。

3.3 目標(biāo)化合物的抗腫瘤活性

3.3.1 細(xì)胞增殖抑制活性實(shí)驗(yàn) 以3種宮頸癌細(xì)胞（HeLa，SiHa，C-33A）和兩 種正 常 細(xì) 胞（H8，HaCaT）為受試細(xì)胞，查耳酮、順鉑、Nutlin-3a 作為陽(yáng)性對(duì)照，通過MTT 法進(jìn)行了體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，結(jié)果如表1。結(jié)果顯示，目標(biāo)化合物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出不同程度的抑制活性。其中化合物3n對(duì)HeLa細(xì)胞的抗腫瘤活性最強(qiáng)，其對(duì)HeLa細(xì)胞的IC50為（11.69 ± 2.05）μmol/L，優(yōu)于對(duì)照藥物，與查耳酮母核相比活性提高了5倍左右。隨后，測(cè)試了目標(biāo)化合物對(duì)H8 細(xì)胞和HaCaT 細(xì)胞的毒性，以此來(lái)評(píng)價(jià)目標(biāo)化合物的安全性?；衔?n對(duì)正常細(xì)胞的毒性均低于陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑，表明這些化合物對(duì)正常細(xì)胞具有較好的安全性，顯示出較強(qiáng)的體外抗宮頸癌細(xì)胞增殖的能力以及較強(qiáng)的選擇性?；衔?n作為一個(gè)有潛力的抗宮頸癌候選化合物值得進(jìn)一步的深入研究。

Table 1 Anti-tumor activity of compounds 3a-3o (± s, n = 3)

Table 1 Anti-tumor activity of compounds 3a-3o (± s, n = 3)

Compd.3a 3b 3c 3d 3e 3f 3g 3h 3i 3j 3k 3l 3m 3n 3o Chalcone Licochalcone B Cisplatin Nutlin-3a IC50/（μmol/L）HeLa 73.36 ± 7.43 49.30 ± 2.31 75.79 ± 1.00 59.42 ± 0.91 45.05 ± 0.98 68.74 ± 1.07 46.38 ± 1.56 52.97 ± 1.31＞ 100＞ 100＞ 100 30.67 ± 2.41 56.33 ± 4.00 11.69 ± 2.05 45.64 ± 2.83 66.54 ± 1.56 54.03 ± 2.48 29.79 ± 0.82 66.05 ± 1.05 SiHa 68.67 ± 4.58 88.05 ± 5.93＞ 100 66.98 ± 4.23 74.39 ± 1.13 92.34 ± 2.08 82.12 ± 3.57 88.37 ± 5.31 81.52 ± 0.68 33.49 ± 1.75 39.48 ± 2.89 82.69 ± 3.47 69.42 ± 0.18 20.53 ± 1.21 57.55 ± 5.46 55.60 ± 2.43 44.92 ± 4.40 28.77 ± 2.05 42.44 ± 0.83 C-33A 71.87 ± 6.30 64.58 ± 1.74 65.58 ± 2.31 43.25 ± 2.56 37.41 ± 1.51 50.77 ± 0.96 39.82 ± 2.77＞ 100 76.17 ± 6.23＞ 100＞ 100 78.92 ± 4.73 62.78 ± 0.53 19.52 ± 2.69 47.78 ± 3.02 44.45 ± 4.07 19.57 ± 1.55 15.03 ± 2.58 43.24 ± 0.54 H8＞ 100 94.73 ± 4.59＞ 100＞ 100 91.49 ± 0.24 74.96 ± 2.15＞ 100＞ 100＞ 100＞ 100 74.52 ± 4.15＞ 100＞ 100 62.05 ± 3.86＞ 100 57.99 ± 2.44 48.23 ± 2.89 67.62 ± 3.74 30.35 ± 0.47 HaCaT 79.37 ± 4.30＞ 100＞ 100 62.68 ± 2.39 61.72 ± 3.27 43.10 ± 1.48 74.09 ± 5.22＞ 100＞ 100＞ 100 41.96 ± 3.27＞ 100 86.77 ± 1.77 44.87 ± 5.58 76.72 ± 4.19 44.85 ± 5.56 29.01 ± 3.56 10.2 ± 1.26＞ 100

3.3.2 構(gòu)效關(guān)系研究 通過對(duì)甘草查耳酮骨架的結(jié)構(gòu)修飾研究中發(fā)現(xiàn)，分子中A、B 環(huán)上取代基的種類特征對(duì)化合物的抗腫瘤活性影響較大。

（1）B 環(huán)不同部位有三氟甲基取代，對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制活性從強(qiáng)到弱依次為3‘-CF3、2‘-CF3、4‘-CF3，即B 環(huán)C3‘-位引入CF3的衍生物的抗腫瘤活性均較顯著。3‘-CF3查耳酮類衍生物有化合物3b、3e、3h、3k和3n等5個(gè)化合物。

（2）化合物均為A 環(huán)上有雙甲氧基的衍生物，通過雙甲氧基的位置對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖的抑制活性比較中發(fā)現(xiàn)如下特點(diǎn)：3，4-二OCH3＞ 2，4-二OCH3＞ 2，3-二OCH3＞ 2，5-二OCH3＞ 2，6-二OCH3），即兩個(gè)甲氧基在A 環(huán)的3，4 位上時(shí)，活性較高。

另外，所有合成衍生物均為α，β-不飽和羰基共軛系統(tǒng)中的α-碳上引入甲基的化合物（根據(jù)前期構(gòu)效關(guān)系研究經(jīng)驗(yàn)而修飾得到，先導(dǎo)化合物L(fēng)icoB 無(wú)此特征）。因此，總結(jié)以上特點(diǎn)，可將構(gòu)效關(guān)系規(guī)律歸納如下：甘草查耳酮分子中，A 環(huán)的3，4位引入兩個(gè)甲氧基、α，β-不飽和羰基的α-位上引入甲基，并在B 環(huán)3‘-位上引入強(qiáng)吸電子基團(tuán)三氟甲基時(shí)，化合物的抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)（例如，化合物3n，IC50為11.69 μmol/L，為15 個(gè)衍生物中活性最強(qiáng)的化合物）。

3.3.3 細(xì)胞侵襲遷移實(shí)驗(yàn) 本研究通過Transwell 實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定化合物3n 對(duì)HeLa 細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果表明，化合物3n對(duì)HeLa細(xì)胞遷移和侵襲有顯著的抑制作用，與空白組相比，化合物3n 處理后的HeLa 細(xì)胞穿過小室膜的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，圖3 和圖4），并且隨著藥物濃度的增加，穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量越少。說(shuō)明化合物3n通過抑制HeLa細(xì)胞遷移和侵襲，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.3.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 使用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了雙參數(shù)細(xì)胞熒光分析。結(jié)果顯示，與空白組相比，隨著化合物3n 濃度的增加，細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)的比例顯著性增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01，圖5）。0、6.25、12.5、25 μmol/L 各給藥組細(xì)胞發(fā)生凋亡的比率分別為（6.15 ± 0.92）%、（8.00 ± 0.42）%、（11.17 ± 0.06）%和（20.65 ± 0.64）%，結(jié)果說(shuō)明化合物3n 通過促進(jìn)HeLa 細(xì)胞凋亡反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.3.5 細(xì)胞周期阻滯實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞周期的有序發(fā)展是細(xì)胞增殖的決定性因素。選擇目標(biāo)化合物3h進(jìn)一步評(píng)價(jià)其對(duì)HeLa 細(xì)胞的周期阻滯的影響?；衔?n 對(duì)HeLa 細(xì)胞作用24 h 檢測(cè)對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示（圖6），化合物3n 對(duì)HeLa 細(xì)胞周期變化有明顯影響，隨著藥物濃度變化，G2/M 期細(xì)胞逐漸增多，分別為（15.36 ± 2.54）%、（15.55 ± 2.06）%、（15.89 ± 3.00）%和（25.20 ± 3.70）%。這些結(jié)果提示，化合物3n能夠?qū)eLa細(xì)胞阻滯于G2/M期，延長(zhǎng)細(xì)胞周期，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

Figure 3 Effect of compound 3n on migration(×400) ability of HeLa cells (± s, n = 3)

Figure 4 Effect of compound 3n on invasion ( × 400) ability of HeLa cells (± s, n = 3)

3.4 分子對(duì)接研究

通過Nutlin-3a、查耳酮母核、化合物3n 與MDM2 蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對(duì)接（圖7）。打分最高的構(gòu)象顯示Nutlin-3a、查耳酮母核、甘草查耳酮B、化合物3n 和MDM2 蛋白結(jié)合的最低能量分別為-36.4、-33.9、-37.6 和-38.1 kJ/mol（表2）。從二維示意圖中可以直觀地看出化合物3n能較好地結(jié)合于MDM2 蛋白的活性口袋內(nèi)，與活性位點(diǎn)的結(jié)合以疏水相互作用為主?；衔?n的三氟甲基、甲氧基，苯環(huán)及α-甲基位于由MDM2 蛋白氨基酸殘基ARG-105（B）、THR-101（A）、TYR-104（A）、ARG-105（A）、LEU-107（A）、VAI-109（A）、LYS-98（B）、GLU-95（B）所形成的疏水性口袋內(nèi)，形成強(qiáng)烈的疏水性相互作用。此外化合物3n中的氟原子與MDM2 蛋白B 鏈上的第105 位精氨酸（ARG）形成一個(gè)氫鍵，此氫鍵作用有助于化合物3n 與MDM2蛋白的穩(wěn)定結(jié)合。

Figure 5 Effect of compound 3n on HeLa cell apotosis rate (± s, n = 3)

Figure 6 Effect of compound 3n on HeLa cell cycle arresting rate (± s, n = 3)

Table 2 Basic protein information and minimum binding energy for docking prediction

Figure 7 Docking results of Compound 3n and MDM2(A); Chalcone and MDM2(B); Licochalcone B and MDM2(C); Nutlin-3a and MDM2 (D)

4 結(jié) 論

宮頸癌的化療中，化療毒性一直是臨床治療的重要問題［25］。以腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路中的潛在治療靶點(diǎn)為干預(yù)目標(biāo)，用天然先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化途徑，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的并有效低毒的抗腫瘤候選藥物，是當(dāng)前新藥篩選中的一個(gè)重要途徑［26］。

鼠雙微粒體2（MDM2）作為一種泛素酶，通過跟促凋亡蛋白p53 形成MDM2-p53 復(fù)合物，綁架p53 并使其降解，從而降低癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程［27］。MDM2 的過度表達(dá)被認(rèn)為是通過Akt-MDM2-p53信號(hào)通路中促癌的一種途徑，因此MDM2 蛋白被認(rèn)為潛在的新型抗腫瘤藥物靶點(diǎn)。

本研究中，以甘草查耳酮B 位先導(dǎo)化合物，利用前期研究經(jīng)驗(yàn)，將分子進(jìn)行三氟甲基化、α-甲基化、甲氧基化等修飾，得到15種全新的氟代查耳酮衍生物。通過1H NMR、13C NMR 以及HRMS 方法鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)。采用MTT 法檢測(cè)了各化合物對(duì)HeLa、SiHa、C-33A 等3 種HPV 陽(yáng)性和陰性宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制活性；同時(shí)利用H8 和HaCaT 正常細(xì)胞評(píng)估化合物對(duì)正常細(xì)胞的初步毒性特征。通過簡(jiǎn)易的構(gòu)效關(guān)系研究，篩選出化合物3n，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)3 種宮頸癌細(xì)胞的抗增殖活性顯著優(yōu)于先導(dǎo)化合物查耳酮B、其他查耳酮類衍生物、陽(yáng)性組順鉑及Nutlin-3a?；衔?n 對(duì)HeLa 細(xì)胞的活性最強(qiáng)（IC50=11.69 μmol/L），并對(duì)兩種正常細(xì)胞的毒性較低，表現(xiàn)出較好的研究潛力。進(jìn)一步的研究顯

示，化合物3n 能夠以濃度依賴的方式有效抑制HeLa 細(xì)胞的遷移侵襲，顯著誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡，并將HeLa 細(xì)胞阻滯在G2/M 期，顯示一定的濃度依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物3n 產(chǎn)生抗腫瘤作用的初步機(jī)制是通過抑制細(xì)胞活力、抑制增殖能力、抑制癌的遷移和侵襲、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡等途徑，并顯示周期特異性抗腫瘤作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示，化合物3n能與MDM2蛋白有效結(jié)合（結(jié)合能為-38.1 kJ/mol），具有抑制MDM2 蛋白作用，值得深入研究。本研究為新型有效低毒的查耳酮類抗腫瘤候選藥物篩選提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。