十棗湯凝膠膏劑HPLC法含量測(cè)定研究

黃 群，林 珊，陳 丹

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

十棗湯由芫花（Genkwa Flos）、大戟（Euphorbiae Pekinensis Radix）、甘遂（Kansui Radix）和大棗（Ju?jubae Fructus）組成，是治療懸飲證的經(jīng)典名方。其中芫花、大戟、甘遂為君藥［1］，具有攻逐臟腑胸脅之積水的功效，大棗為佐藥，能夠緩解藥力和毒性［2］，臨床上主要用于治療胸膜炎、惡性腫瘤、肺結(jié)核等各種病證引起的胸腔積液、肝硬化腹水等［3-6］。中醫(yī)臨床也有將甘遂、大戟、芫花三藥粉末等量用醋調(diào)后外涂肚臍、膻中穴，治療中晚期腫瘤患者惡性胸腹水，達(dá)到瀉水逐飲、消除胸腹水的效果，但需要在臨用前調(diào)制生藥，不僅黏著性差、污染衣物，還易感染。因此，為改善臨床患者用藥的依從性，增加載藥量，提高本方的治療作用，課題組將十棗湯方改劑研制成凝膠膏劑，并針對(duì)方中君藥的指標(biāo)性成分芫花素和大戟二烯醇［7］，采用高效液相色譜法，建立十棗湯凝膠膏劑中芫花素和大戟二烯醇的含量測(cè)定法，為十棗湯凝膠膏劑質(zhì)量控制以及后續(xù)的體外釋放及透皮吸收特性等研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT液相色譜儀、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、CTO-20A柱溫箱均購自日本島津公司；FA2004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥 十棗湯凝膠膏劑（實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20220322、20220323、20220325）；大戟二烯醇對(duì)照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)：PS010984，純度＞98%）；芫花素對(duì)照品（批號(hào)：R13A8F33981，純度＞98%）、卡波姆940（批號(hào)：Y10M9S55485）、無水檸檬酸（批號(hào)：S23A11H111907）均購自上海源葉生物科技有限公司；聚丙烯酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10849764）；甘羥鋁（宿遷華夏生化科技有限公司，批號(hào)：20180116）；高嶺土（批號(hào)：20191119）、甲醇（色譜純，批號(hào)：20200217）、乙腈（色譜純，批號(hào)：20200303）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸（色譜純，上海麥克林生化有限公司，批號(hào)：64-18-6）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 十棗湯凝膠膏劑的制備 稱取處方量的芫花、甘遂和大戟，加入6倍量85%乙醇，浸泡，回流提取，合并濾液，濃縮，制得十棗湯浸膏。分別稱取適量卡波姆940、三乙醇胺溶液，攪拌，調(diào)pH為6～7，呈透明凝膠狀，作為A相；分別稱取聚丙烯酸鈉、甘油、高嶺土和十棗湯浸膏，攪拌，混合均勻，作為B相；分別稱取甘羥鋁、檸檬酸、蒸餾水，使分散均勻，作為C相。C相加B相再加A相，攪拌成黏稠的半固體狀，均勻涂布于無紡布上，膏體重量約為14～16 g/片，厚度約為1 mm，即得十棗湯凝膠膏劑。

2.2 色譜條件

2.2.1 芫花素測(cè)定 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.8%冰醋酸（65∶35），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 大戟二烯醇測(cè)定 Neptune C8色譜柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸（86∶14），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.3 溶液制備及測(cè)定

2.3.1 芫花素對(duì)照品溶液 取芫花素對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇制成每1 mL含芫花素0.09 mg的芫花素對(duì)照品溶液，即得。

2.3.2 大戟二烯醇對(duì)照品溶液 取大戟二烯醇對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇制成每1mL含大戟二烯醇0.20 mg的大戟二烯醇對(duì)照品溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液 取十棗湯凝膠膏劑3片，揭去聚乙烯薄膜，剪碎，混勻，精密稱取約5 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱定重量，浸泡40 min，超聲處理30 min，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，即得。

2.3.4 芫花素陰性對(duì)照溶液 制備缺芫花的十棗湯凝膠膏劑，按“2.3.3”項(xiàng)下同法操作，即得。

2.3.5 大戟二烯醇陰性對(duì)照溶液 制備缺甘遂和京大戟的凝膠膏劑，按“2.3.3”項(xiàng)下同法操作，即得。

2.3.6 測(cè)定法 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.4 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取芫花素對(duì)照品溶液、供試品溶液和芫花素陰性對(duì)照溶液各10 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定；分別精密吸取大戟二烯醇對(duì)照品溶液、供試品溶液和大戟二烯醇陰性對(duì)照溶液各10 μL，按照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明陰性對(duì)照無干擾，提示方法專屬性良好。結(jié)果見圖1～圖2。

圖1 十棗湯凝膠膏劑中芫花素的高效液相色譜圖

圖2 十棗湯凝膠膏劑中大戟二烯醇的高效液相色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性關(guān)系考察 分別精密吸取芫花素系列對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定，以芫花素色譜峰的峰面積（Y1）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X1）為橫坐標(biāo)，線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y1＝6.221×106X1＋2.118×104（r＝0.999 8），表明芫花素在0.09～1.35 μg范圍呈良好的線性關(guān)系。分別精密吸取大戟二烯醇系列對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定，以大戟二烯醇色譜峰的峰面積（Y2）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X2）為橫坐標(biāo)，線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y2＝9.932×105X2＋6.760×104（r＝0.999 9），表明大戟二烯醇在0.20～4.00 μg范圍呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取芫花素對(duì)照品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果芫花素色譜峰面積的RSD值為0.92%。精密吸取大戟二烯醇對(duì)照品溶液，照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果大戟二烯醇色譜峰面積的RSD值為1.29%，說明儀器精密度良好。結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取十棗湯凝膠膏劑（批號(hào)：20220322），分別平行制備6份供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算芫花素含量和RSD；照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算大戟二烯醇含量和RSD。結(jié)果芫花素的平均含量為0.069 4 mg/g，RSD值為1.67%；大戟二烯醇的平均含量為0.126 2 mg/g，RSD值為1.99%。提示方法重復(fù)性良好，結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取十棗湯凝膠膏劑供試品溶液，于第0、2、4、6、8、10、12 h，分別按照“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄芫花素和大戟二烯醇色譜峰的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果表明：芫花素色譜峰峰面積RSD值為1.59%；大戟二烯醇色譜峰的峰面積RSD值為1.62%。提示供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的十棗湯凝膠膏劑（批號(hào)：20220322）約2.5 g，共12份。其中6份精密加入芫花素對(duì)照品，制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算芫花素的平均回收率和RSD；另6份精密加入大戟二烯醇對(duì)照品，制備供試品溶液，按照“2.2.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算大戟二烯醇平均回收率和RSD。結(jié)果表明：芫花素的平均回收率為96.28%，RSD值為0.92%；大戟二烯醇平均回收率為97.69%，RSD值為2.37%。提示該方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品含量測(cè)定 分別取3批凝膠膏劑，按“2.3.3”項(xiàng)下同法操作制備供試品溶液，每批3份，分別按“2.2.1”“2.2.2”和“2.3.6”項(xiàng)下色譜條件及測(cè)定法，測(cè)定制劑中芫花素和大戟二烯醇的含量。結(jié)果表明：制備的十棗湯凝膠膏劑中芫花素及大戟二烯醇的平均含量穩(wěn)定，該法可用于凝膠膏劑的質(zhì)量控制。結(jié)果見表5。

表5 十棗湯凝膠膏劑含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 代表性成分的選擇 十棗湯凝膠膏劑是課題組改劑研制的中藥經(jīng)皮給藥制劑，成分復(fù)雜，因此建立合理的含量測(cè)定方法，是定量控制十棗湯凝膠膏劑質(zhì)量的基本保障。十棗湯方中大戟、芫花、甘遂均為君藥，能攻逐全身各部水飲內(nèi)結(jié)實(shí)證，制成凝膠膏劑等外用后，已避免了胃腸道不適等不良反應(yīng)，故處方中減去了大棗。由于芫花主要含有芫花素等黃酮類藥效成分［5-7］；大戟起利尿和瀉下作用的主要藥效成分是三萜類成分，其中大戟二烯醇的含量較高［5，8］；甘遂主要有效成分屬于二萜類和三萜類成分，其中大戟二烯醇的含量較高［5，8］，且2020年版《中華人民共和國藥典（一部）》［9］芫花項(xiàng)下測(cè)定的指標(biāo)成分為芫花素，大戟和甘遂均以大戟二烯醇含量作為測(cè)定指標(biāo)。故實(shí)驗(yàn)選擇十棗湯凝膠膏劑的主要藥效成分芫花素和大戟二烯醇作為指標(biāo)性成分代表，通過HPLC法建立含量測(cè)定法，有效控制十棗湯凝膠膏劑質(zhì)量。

3.2 供試品溶液的制備 十棗湯凝膠膏劑中藥效成分的水溶性較差，但在甲醇中溶解度較好，故實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為供試品溶液制備的提取溶劑；預(yù)實(shí)驗(yàn)曾比較了凝膠膏劑剪碎后是否預(yù)先浸泡后提取及浸泡時(shí)間，結(jié)果表明甲醇浸泡40 min后再提取，藥效成分含量測(cè)定結(jié)果較高且穩(wěn)定；供試品溶液的提取法曾比較了回流提取法4 h與超聲處理法30 min，結(jié)果表明指標(biāo)性成分芫花素及大戟二烯醇的含量差異不大，考慮到含量測(cè)定的時(shí)間效率，故選擇超聲處理法；比較15、30、45 min超聲提取時(shí)間，結(jié)果表明30 min提取的指標(biāo)性成分含量與45 min相當(dāng)，基本提取完全。故供試品溶液制備最終確定以甲醇為溶劑，浸泡40 min后，超聲提取30 min的方法。

3.3 色譜條件的優(yōu)化 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：芫花素在338 nm波長(zhǎng)處、大戟二烯醇在210 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收，可作為檢測(cè)波長(zhǎng)。參照2020年版《中華人民共和國藥典（一部）》［9］，凝膠膏劑中芫花素含量測(cè)定，以十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）為固定相，甲醇-0.8%冰醋酸（65∶35）為流動(dòng)相；曾考察了以C18為固定相分離凝膠膏劑中大戟二烯醇，但其色譜峰與相鄰峰的分離度偏低，峰形不佳，經(jīng)優(yōu)化篩選，需采用辛烷基硅烷鍵合硅膠（C8）為固定相，并在流動(dòng)相中加入少量的磷酸、甲酸等改善峰形和分離情況，最終確定以乙腈-0.1%甲酸（86∶14）為流動(dòng)相測(cè)定大戟二烯醇含量；當(dāng)設(shè)定柱溫30 ℃時(shí)色譜分析結(jié)果更為穩(wěn)定。方法學(xué)考察結(jié)果表明：所建立的十棗湯凝膠膏劑中芫花素和大戟二烯醇HPLC含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度、精密度等均符合定量分析的要求，適用于十棗湯凝膠膏劑的質(zhì)量控制，同時(shí)也為凝膠膏劑后續(xù)的透皮吸收行為的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。