SCN5A、SCN1B基因多態(tài)性與心房顫動(dòng)的關(guān)系研究

蔡春雨，何鳳珍，余電有，，何斌，權(quán)里平，言緯，張震，韋勤將，黃顯南，劉莉，

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西 百色 533000)

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)是臨床上最常見的快速心律失常之一，其特點(diǎn)是左心室或雙心室擴(kuò)張和收縮受損，是心力衰竭和心源性猝死的重要原因，其發(fā)生率和患病率均呈上升趨勢，大大增加了住院率、中風(fēng)發(fā)生率、社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)和生活質(zhì)量[1-3]。雖然目前AF有多種治療方法，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前，全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過100個(gè)與AF相關(guān)的基因位點(diǎn)，其中大多數(shù)位點(diǎn)指向離子通道、獨(dú)特的心臟富集轉(zhuǎn)錄因子以及其他調(diào)控基因[4-5]。心臟動(dòng)作電位是通過多種離子通道的協(xié)同活動(dòng)產(chǎn)生和傳播的，Nav1.5與肌細(xì)胞膜內(nèi)的Navβ亞基和其他調(diào)控蛋白形成大分子復(fù)合物，其中主要的心臟亞型Nav1.5由SCN5A編碼，β1和β1b由SCN1B編碼，以維持正常的心臟功能，Nav復(fù)合體紊亂可表現(xiàn)為致死性心律失常[6]。目前，關(guān)于心臟鈉通道基因(SCN5A)、鈉離子通道β1亞基(SCN1B)在人類AF中的作用有部分相關(guān)報(bào)道，但在廣西少數(shù)民族地區(qū)分布特征少有報(bào)道，因此本研究旨在探討SCN5A、SCN1B基因SNPs位點(diǎn)與房顫間的關(guān)聯(lián)性，及與不同地區(qū)種族人群相比較，以期呈現(xiàn)AF遺傳學(xué)的現(xiàn)狀及其可能潛在的臨床應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 收集所有入組患者一般臨床指標(biāo)，并詳細(xì)詢問其家族史、高血壓史、糖尿病史、心臟病等病史并記錄，通過24 h動(dòng)態(tài)心電圖或12導(dǎo)聯(lián)心電圖檢測確定診斷為AF的患者，同時(shí)通過心電圖或超聲心動(dòng)圖明確診斷，排除有嚴(yán)重器質(zhì)性心臟病和有心臟病家族史等。 此外，對其禁食12 h后用EDTA采集外周靜脈血5 mL，提取DNA，測定生化指標(biāo)。

1.2 SCN5A、SCN1B SNPs檢測 DNA提取步驟由華大公司提供的QIAamp DNA Micro提取試劑盒，嚴(yán)格依照說明書操作。將所有提取得到的DNA送到武漢華大公司完成DNA測序，測序得到病例組中SCN5A、SCN1B的特異的核苷酸變異(SNV)，分別在NCBI、Ensembl、千人基因組數(shù)據(jù)庫等中進(jìn)行序列比對，篩選出新突變位點(diǎn)，采用PCR擴(kuò)增，首先在PubMed查詢SCN5A、SCN1B的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)各位點(diǎn)引物，委托華大基因科技有限公司合成，并建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SNPs基因分型，提純后的產(chǎn)物再使用Sanger測序方法對相應(yīng)樣本的突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)Chromas軟件處理后獲得對比后的測序峰圖，最后將不同突變位點(diǎn)與不同數(shù)據(jù)庫對比，分析基因型及等位基因發(fā)生頻率以及可能致病風(fēng)險(xiǎn)評估。

2 結(jié)果

2.1 AF組和對照組一般資料比較 本研究選取廣西地區(qū)105例AF樣本[平均年齡(67.25±11.96)歲，男性62.86%]，通過24 h動(dòng)態(tài)心電圖或12導(dǎo)聯(lián)心電圖檢測確定診斷，同時(shí)納入同一地區(qū)105例健康人樣本為對照組[平均年齡(58.42±12.04)，男性56.19%]，同樣有嚴(yán)重器質(zhì)性心臟病和有心臟病家族史的樣本均排除在外。其中，年齡在AF組高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。本研究方案和外周靜脈血的收集均經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會和右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)[倫研批第(YYFY-LL-2016-001)號]，受試者或其家屬均簽署知情同意書。

2.2 樣本SNP位點(diǎn)確認(rèn)及核苷酸序列分析 通過對SCN5A、SCNB基因測序及篩選發(fā)現(xiàn)SCN5A基因上3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別是rs1805124(H558R)、rs1805125(P1090L)、rs41261344(R1193Q)；發(fā)現(xiàn)SCN1B基因3個(gè)位點(diǎn)分別是rs55742440(L210P)、rs67701503(S248R)、rs67486287(R250T)。本課題組提取了攜帶以上位點(diǎn)樣本的基因組DNA，進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證，設(shè)計(jì)引物，見表2。其中SCN1B 基因rs55742440、rs67701503、rs67486287的3個(gè)位點(diǎn)距離相近，因此設(shè)計(jì)共同的上下游引物(F4：5′-CATTGAGGTAGTGGACAAAG-3′，R4:5′- GAGAAACACATCGGATTATTATC-3′)。測序結(jié)果以上6個(gè)位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測序峰圖，見圖1。

表1 AF組與對照組一般資料比較

表2 SCN5A各個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)所用引物

A1～A3分別為SCN5A基因rs1805124、rs180512、rs41261344位點(diǎn)基因型驗(yàn)證分析； B1～B3分別為SCN1B基因rs55742440、rs67701503、rs67486287位點(diǎn)基因型驗(yàn)證。圖1 SCN5A和SCN1B基因SNPs位點(diǎn)的Sanger測序圖譜

2.3 SCN5A、SCN1B基因的SNPs在AF組和對照組中的分布 SCN5A基因rs1805124、rs1805125、rs41261344位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡。rs1805124位點(diǎn)存在3種基因型：TT、TC、CC；與攜帶TT基因型的研究對象相比，CC 基因型患AF風(fēng)險(xiǎn)OR值為1.283(95%CI：0.084～19.595)，TC基因的OR值為4.147(95%CI：0.303～56.800)，相對于T等位基因，C等位基因的增加AF罹患風(fēng)險(xiǎn)OR值為0.302(95%CI：0.127～0.717，P=0.007)。rs1805125存在3種基因型：GG、GA、AA，該位點(diǎn)為罕見突變體，其GG、GA、AA基因型在兩組分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，等位基因G、A分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。rs1805124、rs41261344位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在AF組和對照組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。SCN1B基因rs55742440、rs7701503、rs6748-6287位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡，同時(shí)以上3個(gè)位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在AF組和對照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表3 SCN5A基因SNP在AF組和對照組的分布

表4 SCN1B基因SNP在病例組和對照組的分布

2.4 本地區(qū)AF組和其他地區(qū)人群SCN5A、SCN1B基因SNPS多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較 SCN5A基因rs1805124、rs41261344的基因型及等位基因頻率在少數(shù)民族地區(qū)人群AF組和其他地區(qū)人群中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rs1805125位點(diǎn)各個(gè)基因型、等位基因在少數(shù)民族地區(qū)AF組與東亞地區(qū)AF組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而等位基因頻率在少數(shù)民族地區(qū) AF 組與全球、非洲、歐洲、南亞、美洲AF組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5～表7。SCN1B基因rs55742440、rs67701503、rs67486287位點(diǎn)基因型、等位基因在少數(shù)民族地區(qū)AF組與東亞地區(qū)AF組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與全球、非洲、歐洲、南亞、美洲AF組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表8～表10。

表5 本地區(qū)AF人群SCN5A基因rs1805124與其他地區(qū)人群分布比較

表6 本地區(qū)AF人群SCN5A基因rs1805125與其他地區(qū)人群分布比較

表7 本地區(qū)AF人群SCN5A基因rs41261344與其他地區(qū)人群分布比較

表8 本地區(qū)AF人群SCN1B基因rs55742440與其他地區(qū)人群分布比較

表9 本地區(qū)AF人群SCN1B基因rs67701503與其他地區(qū)人群分布比較

表10 本地區(qū)AF人群SCN1B基因rs67486287與其他地區(qū)人群分布比較

3 討論

心臟動(dòng)作電位是由多個(gè)離子通道協(xié)同激活形成的，其中鈉離子通道成孔的α亞基與調(diào)節(jié)其表達(dá)和功能的β亞基相結(jié)合[7-8]。最早OLSON T M等[9]發(fā)現(xiàn)遺傳性SCN5A錯(cuò)義突變與早發(fā)性擴(kuò)張型心臟病和AF易感性相關(guān)。隨后OLESEN M S等[10]在192例早發(fā)性單純性AF患者中發(fā)現(xiàn)SCN5A的8個(gè)突變和2個(gè)罕見變異，經(jīng)電生理研究發(fā)現(xiàn)這些突變表現(xiàn)出重疊的功能效應(yīng)，導(dǎo)致瞬時(shí)峰值電流減弱和持續(xù)電流增加，表明心臟INa電流增加或功能喪失改變都構(gòu)成了早發(fā)性房顫的底物，提示SCN5A是構(gòu)成早發(fā)性房顫的可能基質(zhì)。同樣，WILDE A A M等[11]發(fā)現(xiàn)SCN5A基因突變改變了鈉通道功能，導(dǎo)致鈉內(nèi)流進(jìn)一步減少，動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間縮短，進(jìn)而導(dǎo)致心律失常。綜上所述，INa電流受損不僅促進(jìn)AF，還會引起其他一些心律失常，如病態(tài)竇房結(jié)綜合征(SSS)、長QT綜合征(LQT)、早期復(fù)極綜合征(ERS)、Brugada綜合征(BrS)[12]。

NaV β亞基有5種亞型(β1～β4和β1b)，Navβ1～β4是跨膜蛋白，而Navβ 1b是一種發(fā)育調(diào)節(jié)的分泌蛋白，分別由SCN1B-SCN4B編碼，在人心臟中最豐富的亞型是NaV1.5和β1亞基[12-13]。研究表明[14]Navβ亞基早期被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)Nav通道復(fù)合物的細(xì)胞表面表達(dá)，導(dǎo)致電流密度的增加。而與BrS相關(guān)的SCN1B突變是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的與心臟相關(guān)的，該突變具有引起心室纖顫(ventricular fibrillation，VF)心臟性猝死的高風(fēng)險(xiǎn)[15]。隨后，WATANABE H等[16]在AF患者中發(fā)現(xiàn)了SCN1B β亞基基因非同義突變(R85H、D153N)，與野生型-亞基共表達(dá)相比，突變體降低了鈉電流峰值幅值，對SCN5A介導(dǎo)的電流產(chǎn)生功能喪失的影響，這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了Na電流降低增強(qiáng)AF易感性的假說。最近研究表明，Navβ1和Navβ3變異通過調(diào)節(jié)Nav1.5的表達(dá)和門控特性來促進(jìn)AF和BrS的發(fā)生，但二者機(jī)制不同[6]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)AF組平均年齡高于對照組，提示年齡是AF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。通過基因測序發(fā)現(xiàn)了SCN5A基因rs1805124、rs1805125、rs41261344 3個(gè)位點(diǎn)的基因型，并且AF組基因型和等位基因分布與對照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，最早研究發(fā)現(xiàn)，SCN5A基因rs1805124多態(tài)性與美國孤立性房顫相關(guān)[17]。同樣，單麗沈等[18]于2012年研究發(fā)現(xiàn)SCN5A基因rs1805124與高海拔藏漢民族房顫的發(fā)生有關(guān)。隨后又被報(bào)道該位點(diǎn)在新疆漢族和維吾爾族房顫患者中存在民族差異，G等位基因是AF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19-20]。而本研究結(jié)果也顯示TC和CC基因型是AF最常見的基因型，C等位基因是AF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與其他研究結(jié)果不一致，提示C等位基因可能是另一易患基因。BrS是一種主要由SCN5A變異引起的遺傳性心臟性猝死疾病，在亞洲人群中更為普遍.其中SCN5A 基因rs1805125、rs41261344位點(diǎn)常見于長QT綜合征和Brugada綜合征患者[21]。研究表明[22]，P1090L變體可能會對Nav1.5產(chǎn)生功能性影響，但可能不會導(dǎo)致二次結(jié)構(gòu)變化，其功能效應(yīng)取決于與Q1077剪接變異體的相互作用，R1193Q變異可能影響Nav1.5的二級結(jié)構(gòu)，并增加BrS中致命性心律失常的易感性。然而，對于R1193Q位點(diǎn)與心律失常的聯(lián)系仍在爭論中，ABE M等[23]研究表明R1193Q不會調(diào)節(jié)NaV1.5通道以響應(yīng)體溫變化，其可能不是觸發(fā)心律失常的單基因因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCN5A基因rs1805125位點(diǎn)在AF組等位基因分布與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且該位點(diǎn)在東亞AF患者中無差異。rs41261344在AF組中CT基因型及T等位基因頻率高于對照組，表明T等位基因可能是AF的易患基因。

既往研究已證明，SCN1B可以增強(qiáng)SCN5A通道(a亞單位)傳導(dǎo)的鈉通道電流[24]。HU D等[25]首次證明Navβ1B亞基與Nav1.5和Kv4.3在結(jié)構(gòu)和功能上存在關(guān)聯(lián)，并且該亞基的罕見R214Q位點(diǎn)遺傳變異通過同時(shí)減少內(nèi)向電流(INa)和增加外向電流(Ito)，從而調(diào)節(jié)負(fù)責(zé)BrS和心源性猝死的致心律失常底物。而具有相同SCN5A突變的患者的表型是可變的，因?yàn)楦鞣N修飾物可能會對其進(jìn)行調(diào)節(jié)。AOKI H等[26]在攜帶相同SCN5A突變的家族成員中發(fā)現(xiàn)了不同表型，并在先證者、其母親和妹妹體內(nèi)檢測到SCN1B-L210P，考慮其可能作為影響表型的遺傳修飾物。SCN1B的變異也與AF和心臟傳導(dǎo)功能障礙有關(guān)[16]。YAO H等[27]在4個(gè)早期復(fù)極綜合征家族中發(fā)現(xiàn)SCN1Bβ基因的S248R和R250T突變，其與Kv4.3相關(guān)，導(dǎo)致Ito增加，考慮可能作為ERS調(diào)控基因之一。由于本研究rs55742440、rs7701503、rs67486287位點(diǎn)的高等位基因頻率和在人群中攜帶該變體的高純合子數(shù)，并且在對比東亞AF人群基因型和等位基因頻率人群分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故考慮其為良性變異且無有害性。綜上，疾病的表型受到突變、遺傳背景和環(huán)境之間的相互作用，是一個(gè)互相影響的復(fù)雜過程。

AF復(fù)雜遺傳學(xué)的揭示最終可能使心律失常的離散臨床亞型和機(jī)制的識別成為可能。隨著對AF相關(guān)遺傳危險(xiǎn)因素理解的迅速擴(kuò)展，有望識別其發(fā)病機(jī)制中涉及的新途徑、新藥物靶點(diǎn)，以及特定臨床結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)患者。本研究有一定的局限性，因樣本量及入組來源較小，相關(guān)結(jié)果具有一定的局限性，因此，今后應(yīng)開展更全面、樣本量更大的研究，同時(shí)未來研究這些多態(tài)性位點(diǎn)與SCN5A、SCN1B在核酸、蛋白水平以及組織特異性之間的相關(guān)性的工作，有望闡明這些SNPs與AF的關(guān)聯(lián)機(jī)制。