甘蔗黃葉病毒基因型研究進展

張榮躍，王曉燕，單紅麗，李文鳳，黃應昆

（云南省農(nóng)科院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，開遠 661600）

甘蔗黃葉病又稱甘蔗黃葉綜合癥（Sugarcane yellow leaf syndrome，SYLS），是一種嚴重危害甘蔗的疾病，于1990年在夏威夷首次被發(fā)現(xiàn)[1]。該病由甘蔗黃葉病毒（Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV）引起，2006年Abu Ahmad等首次對ScYLV進行了基因型的分型[2]，之后陸續(xù)有新的基因型被發(fā)現(xiàn)，到目前ScYLV可分為7種基因型。ScYLV基因型的研究是目前甘蔗黃葉病毒研究的熱點，不同基因型的ScYLV具有地域分布的差異，對甘蔗的致病性也有不同，因此，了解ScYLV的基因型對甘蔗黃葉病的診斷、防治和抗病育種具有重要意義。本文將對ScYLV的基因組結構、基因型的確立和發(fā)展、基因型的流行學分布、基因型分型方法和基因型與病害等方面的研究進展進行簡單的闡述。

1 甘蔗黃葉病毒的基因組結構

甘蔗黃葉病毒（Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV）為正單鏈RNA病毒，全基因組由5895～5899個核苷酸組成。病毒基因組編碼至少6個開放讀碼框（ORFs 0-5）和3個非編碼區(qū)UTR，為典型的黃癥病毒科的基因組。其它黃癥病毒科病毒的研究結果表明，ORF0編碼的蛋白可能與癥狀表達相關，最近研究表明ORF0還可能編碼病毒的一個RNA沉默抑制子[3]。ORF1和ORF2一起翻譯分別編碼一個多功能肽和RNA依賴的RNA聚合酶。ORF1編碼的多肽序列包括一種絲氨酸蛋白酶和病毒基因組結合蛋白（VPg）。ORF3和ORF4分別編碼外殼蛋白和移動蛋白，ORF5不單獨表達，而是通過核糖體通讀機制與ORF3形成通讀蛋白，與蚜蟲傳播病毒有關[4]。ORF1、ORF2與馬鈴薯卷葉病毒屬 （Polerovirus）非常相似，ORF3、ORF4與黃癥病毒屬（Luterovirus）非常相似，而ORF5與耳突花葉病毒屬（Enamovirus）非常相似，核苷酸序列對比表明ScYLV基因組在進化過程中至少發(fā)生了兩次獨立的重組，ScYLV被認為是一個由黃癥病毒科3個不同屬 （大麥黃矮病毒屬、馬鈴薯卷葉病毒屬和耳突花葉病毒屬）的病毒重組后形成的病毒[5－6]。

2 基因型的確立和發(fā)展

2006年Abu Ahmad等通過對ScYLV基因序列的比較分析，建議將ScYLV分為3種不同的基因型，并以樣品來源地進行了命名，即 BRA 基因型（Brazil），PER 基因型（peru）和 REU 基因型（Réunion Island）。 另外，古巴的一個分離物的ORF1核苷酸部分序列只有77%～80%與BRA基因型、PER基因型和REU基因型相同，這表明古巴的這個分離物代表了另外的一個基因型，即CUB基因型，或者甚至可以歸為一個新的病毒種類[2]。然而，在這4種基因型中，BRA基因型和PER基因型非常接近，不能用特異性引物把它們區(qū)分開，因此Abu Ahmad等把這兩個基因型合并為BRA-PER基因型進行研究[7]。2008年Viswanathan等從印度分離到的一個病毒的基因序列與已知的基因類型比較差異很大，部分ORF1和ORF2核苷酸序列與已報道的4種基因型相似性只有75.9%～88.0%，并提出這個分離物可以代表一個新的基因型，即IND基因型[8]。2010年Wang等對中國分離到的一個病毒進行測序，序列比較和系統(tǒng)進化分析結果表明這個分離物代表了一個新的基因型，并命名為CHN1基因型[9]。2011年ElSayed等分離到的夏威夷株系與PER基因親緣關系較近，而與BRA和REU比較遠，他們建議考慮夏威夷ScYLV為一個獨立的組，與PER基因型一起為HAW-PER基因型[10]。近幾年來，對ScYLV基因型的研究增多，目前已知的ScYLV有以上提到的7種基因型，但隨著ScYLV基因型研究的開展，新的基因型可能會逐漸被發(fā)現(xiàn)。

3 基因型的流行學分布

2006年Abu Ahmad等利用3種不同基因型的特異性引物對采自18個國家或地區(qū)的245份甘蔗黃葉病樣品進行了基因型鑒定，結果表明BRA-PER基因型在這18個地區(qū)都被檢測到，CUB基因型在巴西、哥倫比亞、古巴、瓜德羅普島的樣品中被發(fā)現(xiàn)，REU基因型存在于巴西、瓜德羅普島、毛里求斯和留尼汪島的樣品中[7]。2008年Viswanathan等對印度ScYLV的序列研究表明印度ScYLV基因組與世界上已知的ScYLV基因型有很大差異，進一步比較ORF1和ORF2的序列表明印度的甘蔗黃葉病至少由3種基因型引起，CUB，IND和BRA-PER，其中以CUB基因型為主，其次為IND和BRA-PER基因型[8]。2010年Joomun使用不同基因型的特異性引物對毛里求斯黃葉病樣品進行RT-PCR檢測，表明毛里求斯甘蔗黃葉病毒包含3種基因型，即BRA-PER基因型、CUB基因型和REU基因型[11]。2011年Singh等采集了印度6個甘蔗種植州的13個黃葉病樣品，比較了病毒外殼蛋白序列，表明所有印度ScYLV分離物可聚為兩個主要的組，這表明ScYLV兩個株系影響印度甘蔗。然而，所有13個分離物被發(fā)現(xiàn)與古巴分離物相關，屬于CUB基因型，得到印度甘蔗黃葉病是由CUB和IND兩種基因型引起，而不是先前認為的3種基因型[12]。在我國，2012年Wang等對我國6個省份采集的129份甘蔗黃葉病樣品進行RT-PCR-RFLP分析和序列測定，結果表明廣東省采集的63個樣品中包含5種基因型，分別為BRA，CHN1，CUB，PER和CHN2，其中43個樣品為BRA基因型，占所有樣品的68.3%，其它省份的66個樣品均為BRA基因型[13]。2012年Gao等根據(jù)研究結果推測在中國至少存在4種基因型，即BRA、PER、CHN1和CUB[14]。以上研究結果表明，ScYLV基因型的分布有一定的區(qū)域性，BRA-PER基因型為主要基因型，在全世界均有分布，CUB基因型和REU基因主要分布于古巴和南美洲一些地方，而IND基因型、CHN基因型和HAW基因型僅分別分布于印度、中國和夏威夷。

4 基因型分型方法

目前ScYLV基因型的分型研究中主要使用以下3種方法：（1）ScYLV基因組測序，根據(jù)ScYLV核苷酸序列差異進行分型。該方法直接、可靠，但繁瑣、費時、費用高，不適宜廣泛開展；（2）反轉錄聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析（RT-PCR-RFLP），以RT-PCR擴增ScYLV，再以一組能區(qū)分ScYLV基因型的限制性內(nèi)切酶消化擴增產(chǎn)物，電泳后，根據(jù)酶切圖譜進行分型。與其他分型方法相比，RFLP是目前常用的ScYLV分型方法，其方法簡單且易于操作，但步驟較繁雜、易受污染、酶切位點易受基因變異的影響導致分型錯誤甚至無法確定。（3）特異性引物PCR，根據(jù)不同基因型ScYLV的特點，設計特異性引物進行PCR擴增，從而確定不同的基因型。該方法操作較簡單準確，可用于ScYLV的分子診斷和大范圍的調(diào)查。

5 基因型與病害

2003—2005年Abu Ahmad等對來自不同地區(qū)的自然感染了不同基因型ScYLV的兩個甘蔗品種R570和SP71-6163進行了連續(xù)3年的發(fā)病情況觀察，結果表明來自不同地區(qū)感染了不同基因型ScYLV的SP71-6163病害嚴重程度有差異，來自瓜德羅普島的甘蔗病情嚴重程度總是高于來自巴西的甘蔗，這表明不同基因型的ScYLV之間存在致病性的差異。來自哥倫比亞感染了BRA-PER基因型的SP71-6163病害嚴重程度要高于來自巴西同樣感染了BRA-PER基因型的SP71-6163，表明BRA-PER基因型之間也存在著致病性的差異。在大多數(shù)情況下，來自瓜德羅普島同時感染了BRA-PER基因型和REU基因型的SP71-6163病害嚴重程度要高于來自巴西感染了BRA-PER基因型的SP71-6163，這表明BRA-PER基因型和REU基因型聯(lián)合侵染對甘蔗更為致病[15]。2007年Abu Ahmad等在具有不同抗性的健康甘蔗上接種不同基因型的ScYLV，結果表明BRA-PER基因型和REU基因型對甘蔗的侵染能力和毒力有差異，在瓜德羅普島和留尼汪島，BRA-PER基因型比REU基因型更具侵染性，這也從另外一個方面證明了BRA-PER基因型和REU基因型為兩個不同的病毒株系。然而，來自瓜德羅普島的REU基因型ScYLV可以侵染甘蔗品種R570，但是來自留尼汪島的REU基因型ScYLV卻不能侵染，這也表明了在REU基因型之間也存在致病性的差異[16]。目前對于基因型與病害的研究較少，只有針對BRA-PER基因型和REU基因型的少量研究，不同基因型ScYLV對于甘蔗的致病性差異還需進一步深入研究。

[1]Schenck S.Yellow leaf syndrome-a new sugarcane disease[R].Hawaiian Sugar Planters Association:Annual Report,1990,38-39.

[2]Abu Ahmad Y,Rassaby L,Royer M,Borg Z,Braithwaite K S,Mirkov T E,Irey M S,Perrier X,Smith G R,and Rott P.Yellow leaf of sugarcane is caused by at least three different genotypes of sugarcane yellow leaf virus,one of which predominates on the Island of Réunion[J].Archives of Virology,2006,151:1355-1371.

[3]Mangwende T,Wang M L,Borth W,Hu J,Moore P H,Mirkov T E and Albert H H.The P0 gene of Sugarcane yellow leaf virus encodes an RNA silencing suppressor with unique activities[J].Virology,2009,384:38-50.

[4]Ziegler-Graff V,Brault V,Mutterer J D,Simonis M T,Herrbach E,Guilley H,Richards K E and Jonard G.The coat protein of beet western yellows luteovirus is essential for systemic infection but the viral gene products P29 and P19 are dispensable for systemic infection and aphid transmission[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,1996,9:501-510.

[5]Moonan F,Molina J and Mirkov T E.Sugarcane yellow leaf virus:an emerging virus that has evolved by recombination between luteoviral and poleroviral ancestors[J].Virology,2000,269:156-171.

[6]Smith G R,Borg Z,Lockhart B E L,Braithwaite K S and Gibbs M.Sugarcane yellow leaf virus:a novel member of the Luteoviridae that probably arose by inter-species recombination[J].Journal of General Virology,2000,81:1865-1869.

[7]Abu Ahmad Y,Royer M,Daugrois J H,Costet L,Lett J M,Victoria J I,Girard J C and Rott P.Geographical distribution of four Sugarcane yellow leaf virus genotypes[J].Plant Disease,2006,90:1156-1160.

[8]Viswanathan R,Balamuralikrishnan M and Karuppaiah R.Identification of three genotypes of sugarcane yellow leaf virus causing yellow leaf disease from India and their molecular characterization[J].Virus Genes,2008,37:368-379.

[9]Wang M Q,Zhou G H.A near-complete genome sequence of a distinct isolate of Sugarcane yellow leaf virus from China,representing a sixth new genotype[J].Virus Genes,2010,41:268-272.

[10]ElSayed A I,Weig A R and Komor E.Molecular characterization of Hawaiian Sugarcane yellow leaf virus genotypes and their phylogenetic relationship to strains from other sugarcane-growing countries[J].European Journal of Plant Pathology,2011,129:399-412.

[11]Joomun N,Dookun-Saumtally A.Occurrence of three genotypes of sugarcane yellow leaf virus in a variety collection in Mauritius[J].Sugar technology,2010,12（3-4）:312-316.

[12]Singh D,Rao G.P.Molecular detection of two strains of Sugarcane yellow leaf virus in India and their secondary spread in nature through Aphids[J].Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica,2011,46（1）:17-26.

[13]Wang M Q,Xu D L,Li R and Zhou G H.Genotype identification and genetic diversity of Sugarcane yellow leaf virus in China.Plant Pathology[J],2012,61（5）:986-993.

[14]Gao S J,Lin Y H,Pan Y B,Damaj M B,Wang Q N,Mirkov T E and Chen R K.Molecular characterization and phylogenetic analysis of Sugarcane yellow leaf virus isolates from China[J].Virus Genes,2012,45 （2）:340-349.

[15]Abu Ahmad Y,Girard J C,Fernandez E,Pauquet J,Lockhart B E L,Letourmy P,and Rott P.Variation in virus populations and growth characteristics of two sugarcane cultivars naturally infected by Sugarcane yellow leaf virus in different geographical locations[J].Plant Pathology,2007,56:743-754.

[16]Abu Ahmad Y,Costet L,Daugrois J H,Nibouche S,Letourmy P,Girard J C,and Rott P.Variation in infection capacity and in virulence exists between genotypes of Sugarcane yellow leaf virus[J].Plant Disease,2007,91:253-259.