Vaspin通過抑制KLK7改善敗血癥誘導的小鼠心臟損傷和心臟炎癥

程小龍，水寅萍

(皖南醫(yī)學院，安徽 蕪湖 241002)

敗血癥是一種由病原微生物侵入體內(nèi)引起的全身性炎癥綜合征[1]。敗血癥的發(fā)病率高且死亡率高，因此是臨床研究的重要疾病之一[2]。敗血癥發(fā)生的過程中往往伴隨著脂多糖(LPS)的釋放，導致多種免疫細胞的激活和多種病理反應，隨后引起組織器官的損傷和衰竭，其中心臟損傷和炎癥的發(fā)生是造成死亡的重要原因[3]。因此，尋找潛在的靶點預防敗血癥引起的心臟損傷十分必要。Vaspin是一種內(nèi)臟脂肪組織衍生的絲氨酸蛋白酶抑制劑[4]，主要來源于內(nèi)臟脂肪細胞，可在心臟、腎臟、大腦、胃腸道、胰腺等多種組織中表達[5]，炎癥、高糖等病理條件可促進vaspin的合成和分泌[6]。研究發(fā)現(xiàn)vaspin可調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的炎性因子、黏附分子及趨化因子的表達，且能對抗細胞凋亡，對血管內(nèi)皮具有保護作用[7]。激肽釋放酶可分為兩大類，分別為血漿激肽釋放酶(plasma kallikrein，PK)和組織激肽釋放酶(kallikrein related peptidase，KLK)[8]。組織激肽釋放酶中的激肽釋放酶7(KLK7)是一種具有胰凝乳蛋白酶樣特異性的蛋白酶，被確定為第一個vaspin靶蛋白酶，已有研究表明KLK7參與了機體炎癥的發(fā)生過程[9]。大量研究表明[10]，vaspin與心血管疾病之間存在關(guān)聯(lián)，冠狀動脈疾病(CAD)患者體內(nèi)的vaspin顯著增高，且與冠心病的嚴重程度呈正相關(guān)[11]。Vaspin在動脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)也增加，并通過減輕炎癥逆轉(zhuǎn)ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化過程[12]。然而，目前尚不清楚vaspin是否在膿毒癥引起的心臟損傷中起作用，本研究中使用盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)誘導的敗血癥小鼠來探究這一問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和試劑 C57野生型(WT)小鼠購自安徽醫(yī)科大學動物實驗中心(動物生產(chǎn)許可證號：2022134628)。KLK7基因敲除(KLK7-/-)小鼠購自GemPharmatech有限公司(江蘇，中國)。LPS(sigma)溶解于生理鹽水中，稀釋終濃度為10 mg/kg，保存使用；vaspin(PeproTech)先溶解于DMSO中，后使用生理鹽水溶解，終濃度為0.1 μg/kg，保存使用。

1.1.2 實驗儀器 多功能酶標儀(北京市六一儀器廠)；熒光倒置顯微鏡(卡爾·蔡司公司)；高速冷凍離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器設備有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海歐翔科學儀器公司)；電泳設備(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 構(gòu)建敗血癥模型 采用盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)和脂多糖(LPS)建立膿毒癥小鼠模型[13]。首先WT小鼠或 KLK7-/-小鼠用vaspin或PBS預處理，用2%異氟烷吸入麻醉，并平放在預熱的手術(shù)臺上，腹部的毛發(fā)用剃毛器去除，用75%的乙醇對皮膚進行消毒。然后解剖腹部皮膚以暴露腹腔，盲腸在遠端和盲腸底部之間的一半距離處被結(jié)扎，從盲腸前部的腸系膜末端穿刺一次，用26G針頭從腸系膜端向腸前方向穿刺一次。最后，縫合腹部皮膚并進行消毒，將小鼠置于28 ℃的培養(yǎng)箱中。對模型組小鼠使用LPS(10 mg/kg)預給藥6 h，刺激小鼠炎癥發(fā)生，小鼠敗血癥模型構(gòu)建完成。

1.2.2 實驗分組與給藥 WT小鼠接受假手術(shù)或使用生理鹽水作為對照(n=15)。此外，在接受CLP或假手術(shù)之前，WT小鼠用PBS或vaspin(0.1 μg/kg)預處理30 min(n=15)，LPS(10 mg/kg)預給藥6 h；造模結(jié)束后觀察小鼠1周以確定其存活率。同樣對于KLK7-/-小鼠首先接受CLP或假手術(shù)(n=15)，小鼠使用vaspin或PBS預處理30 min(n=15)，LPS(10 mg/kg)預給藥6 h；給藥和CLP后觀察小鼠1周以確定其存活率。

1.2.3 超聲檢測血流動力學指標 給藥和CLP結(jié)束后，將各組小鼠麻醉并仰臥固定于手術(shù)臺上，氣管插管，使用小動物呼吸機維持通氣，開胸，將PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)傳感器的針尖小心插入小鼠左心室內(nèi)，根據(jù)系統(tǒng)軟件檢測記錄血流動力學指標：平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP) 、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP) 、左心室等容舒張期壓力下降最大速率(maximum rate of left ventricular isovolumic diastolic pressure drop，-dp/dtmax) 和左心室等容舒張期壓力上升最大速率(maximum rate of leftventricular isovolumic diastolic pressure rise，+dp/dtmax) ，每只小鼠至少需檢測3個連續(xù)且完整的心動周期。

1.2.4 心臟損傷標志物的分析 通過小鼠眼球取血的方式采集各組小鼠血液樣本并離心以獲得血清。使用LDH檢測試劑盒和CK-MB檢測試劑盒(均購自中國Njjcbio生物技術(shù)公司)檢測乳酸脫氫酶(LDH)和心肌結(jié)合肌酸激酶(CK-MB)，用以評估心臟損傷標志物水平。

1.2.5 HE染色觀察心肌組織病理學變化 將被安樂死的小鼠解剖并分離其心肌組織，每組各取15只小鼠的心肌組織(其余心肌組織置于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)ELISA和Western Blot檢測)迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，用石蠟包埋，用切片機切成約5 mm厚的切片，參照HE染色試劑盒說明書進行染色，之后在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 蛋白免疫印跡分析 將冷凍的組織研磨，用裂解緩沖液裂解，并通過超聲波進一步裂解。通過離心獲得總蛋白質(zhì)，收集上清液。使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific，USA)檢測蛋白濃度。總蛋白使用12%的十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠，按分子量進行電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore，USA)。用3%的BSA封閉1 h后，將膜與稀釋好的vaspin、 KLK7 、Cleaved caspase3等抗體孵育過夜；PBS洗膜完成后，與二抗GAPDH室溫孵育1 h(所有單克隆抗體均購自英國Abcam公司)，最后上機顯影，并用Image J進行灰度值分析。

1.2.7 ELISA檢測心肌組織中炎癥因子水平 造模結(jié)束后取小鼠心肌組織，冰PBS漂洗后制備心肌組織勻漿，按ELISA試劑盒要求檢測心肌組織中IL-1β和TNF-α的含量。

2 實驗結(jié)果

2.1 超聲檢測各組小鼠血流動力學指標情況 MAP、LVSP、-dp/dtmax和+dp/dtmax：CLP處理組較假手術(shù)組顯著降低；vaspin預處理組較CLP處理組顯著升高；KLK7基因敲除組的小鼠CLP處理后較正常CLP處理組小鼠升高得更加顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血流動力學結(jié)果比較

2.2 各組LDH和CK-MB檢測情況 與假手術(shù)組相比，CLP組的LDH和CK-MB水平顯著升高；vaspin預處理組相較于CLP組LDH和CK-MB水平顯著降低；基因敲除組相較于CLP組LDH和CK-MB水平降低得更加顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 HE染色觀察各組心肌組織病理學變化情況 HE染色結(jié)果顯示假手術(shù)組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維橫紋清晰，無變質(zhì)、壞死等異常改變；CLP處

表2 各組小鼠血清LDH和CK-MB水平比較 單位：μg/L

理組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見心肌細胞變性、壞死，細胞核碎裂、溶解，心肌纖維斷裂，心肌橫紋模糊、消失、間質(zhì)水腫等異常變化；vaspin預處理組可見心肌損傷情況明顯好轉(zhuǎn)；而基因敲除組可見小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)趨于正常，異常變化得到改善。見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織病理學HE染色圖(×200)

2.4 蛋白免疫印跡檢測相關(guān)蛋白表達情況 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CLP處理組的vaspin、KLK7、Cleaved caspase3、TNF-α和IL-6的表達均顯著上調(diào)；而與CLP組相比，vaspin預處理的CLP組KLK7、Cleaved caspase3、TNF-α和IL-6表達顯著下調(diào)；當KLK7被敲除時，與CLP組相比，KLK7、Cleaved caspase3、TNF-α和IL-6的表達顯著下調(diào)。差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠心肌組織vaspin、KLK7和Cleaved caspase3等蛋白表達結(jié)果

2.5 ELISA檢測各組小鼠心肌組織中炎癥因子水平 ELISA檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CLP處理后小鼠體內(nèi)的TNF-α、IL-6等炎癥因子的水平上升；將vaspin預處理后再CLP處理時，與單純CLP處理組相比，小鼠體內(nèi)的TNF-α、IL-6等炎癥因子的水平下降；當敲除KLK7后，小鼠體內(nèi)的炎癥因子水平也下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

敗血癥是世界范圍內(nèi)的一個重大公共衛(wèi)生問題，是由細菌和其他致病微生物侵入體內(nèi)引起的全身性炎癥反應綜合征[14]。敗血癥在臨床上病情進展迅速、臨床救治困難，心肌損傷是敗血癥常見的早期并發(fā)癥[15]，一旦發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)心血管疾病，極大可能發(fā)生死亡，因此研究如何預防敗血癥的發(fā)生和惡化顯得尤為必要。

圖3 各組小鼠體內(nèi)TNA-α、IL-6等炎癥因子水平

在本次研究中小鼠接受了CLP誘導腹部感染，模擬臨床敗血癥，同時腹腔注射LPS，以模擬革蘭氏陰性細菌細胞壁釋放LPS的情況[16]。小鼠通過接受CLP處理并注射LPS以建立敗血癥模型。以前的研究發(fā)現(xiàn)[17]，vaspin是急性心肌梗死患者心衰的一個重要預測指標。本次研究主要探究絲氨酸蛋白酶抑制劑vaspin在敗血癥誘發(fā)的小鼠心臟損傷中的保護作用，并深入探究其保護機制。首先實驗結(jié)果顯示，當對小鼠進行vaspin預給藥時，能夠有效地保護敗血癥誘導的小鼠心功能障礙和損傷。在后續(xù)的實驗中發(fā)現(xiàn)，vaspin預給藥可以有效降低小鼠體內(nèi)的相關(guān)炎癥因子水平，抑制心肌細胞的凋亡。PAHLAVANI N等[18]在敗血癥患者和小鼠體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)了血液中的各種免疫細胞，包括白細胞、單核細胞和巨噬細胞，它們的水平都明顯增加。此外，這些免疫細胞逐漸浸潤心臟并被激活，從而釋放出多種因子，放大了心臟的炎癥反應[19]。這些發(fā)現(xiàn)表明，炎癥在敗血癥的發(fā)生過程中起著重要的作用。盡管其他病理因素包括氧化應激反應等也參與了敗血癥損傷機體的過程[20]，但敗血癥引發(fā)的炎癥極大可能是敗血癥導致心臟損傷的主要原因。那么vaspin究竟是通過什么機制發(fā)揮其保護作用的，是課題研究的主要問題。KLK7是組織激肽釋放酶中的重要一員，可以在各種組織和器官中表達。研究表明，KLK7參與了多種系統(tǒng)性疾病的發(fā)生，包括皮膚病、腫瘤和前列腺炎[21]。同時KLK7是vaspin的第一個下游信號，后續(xù)實驗結(jié)果顯示，當預給藥vaspin再進行CLP處理時，小鼠體內(nèi)的KLK7蛋白表達水平顯著降低，同時相關(guān)炎癥蛋白和凋亡蛋白的表達水平顯著升高。因此，推測vaspin是通過抑制KLK7表達發(fā)揮其保護作用的。隨后敲除了KLK7基因，實驗結(jié)果顯示CLP處理后小鼠體內(nèi)的炎癥因子水平并沒有升高，凋亡蛋白的表達也沒有明顯上調(diào)。同時當KLK7被敲除后，CLP小鼠的心功能障礙得到一個明顯的保護。

本研究證實vaspin通過抑制KLK7的表達來減輕敗血癥誘導的小鼠心臟損傷和心臟炎癥，并且能夠緩解敗血癥引起心臟功能障礙。因此vaspin和KLK7可能是預防和治療臨床敗血癥中心臟損傷的重要治療靶點。