特色芋艿病毒病檢測及組培體系優(yōu)化研究

馬燕欣，郎淑平，袁曄，陳婕

(嘉興市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 嘉興 314016)

芋為天南星科芋屬植物，是嘉興市重要水生蔬菜種類之一[1]。生產(chǎn)上芋主要通過無性繁殖留種，長期的無性繁殖會使植株中病毒數(shù)量不斷積累，造成病害嚴重、種性退化、品質(zhì)變劣，從而使一些地方特色芋種質(zhì)資源面臨滅絕風險[2]。國內(nèi)報道的侵染芋的病毒主要是芋花葉病毒(Dasheenmosaicvirus,DsMV)和黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)，其中DsMV分布最廣，為害最大[3-4]。

組織培養(yǎng)技術已經(jīng)廣泛應用于芋的脫毒和提純復壯[5]，組織培養(yǎng)過程中低污染率和高芋芽增殖系數(shù)是提高組培效率的關鍵。為了實現(xiàn)低污染率，除了優(yōu)化外植體滅菌方法，還可以在培養(yǎng)基中針對性的加入抑菌劑，減少或防止真菌和細菌污染[6-7]。激素種類和使用濃度是影響組培苗增殖系數(shù)的主要因素，已有的研究認為，在芋莖尖組織培養(yǎng)過程中，一定濃度的TDZ可以增強外植體的活力，使側(cè)芽增殖速率提高很多倍，且TDZ還存在誘導側(cè)芽扁化等效應[2]。

本文以嘉興地方特色紅芽多子芋W1紅為研究對象，調(diào)查檢測田間植株DsMV發(fā)病情況，研究外植體消毒劑種類和消毒時間對芋莖尖初代培養(yǎng)的影響、抑菌劑種類和使用濃度對芋莖尖初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)的影響，并比較TDZ和6-BA對芋組織培養(yǎng)的影響，構(gòu)建了嘉興特色紅芽多子芋的組培體系。

1 材料與方法

1.1 材料

嘉興地方特色紅芽多子芋W1紅，DsMV病毒檢測的引物參照王彥芬設計引物[4](上海生工生物技術有限公司合成，引物擴增片段313 bp)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司，PCR試劑盒購自日本Takara公司，苯甲酸鈉購自天津市致遠化學試劑有限公司，菌殺光購自桂林宏光生物科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 芋病毒病田間發(fā)病情況調(diào)查

2021年4月10日，將紅芽多子芋W1紅種植于嘉興市農(nóng)業(yè)科學研究院古塘基地，試驗田從未種植過芋艿；雙行種植，行距60 cm，株距45 cm，共種植110株。8月20日進行芋病毒病調(diào)查，并將有病癥的葉片取回進行RT-PCR檢測?？俁NA提取和RT-PCR方法參照王彥芬的方法[4]。

1.2.2 培養(yǎng)基配制

配制MS培養(yǎng)基。選擇食品用防腐劑苯甲酸鈉和混合抑菌劑菌殺光作為抑菌劑在芋莖尖培養(yǎng)中使用，將相應濃度的抑菌劑直接加入配好的培養(yǎng)基中混合均勻后分裝，用瓶蓋封口，調(diào)節(jié)pH值至5.8，121 ℃ 高壓滅菌15 min。

1.2.3 外植體不同消毒方式對芋莖尖培養(yǎng)的影響

選取芽長3 cm左右的W1紅芋頭，流水沖洗2 h；剜割芋芽，流水沖洗20 min；剝?nèi)デo尖外表層2～3層，轉(zhuǎn)移到超凈工作臺上用75%乙醇浸泡30 s，進行不同滅菌處理，后用無菌水漂洗5次；剝?nèi)?～5 mm莖尖組織接入1號培養(yǎng)基中，每瓶接種2個芋芽，每個處理接種10瓶。接種后7 d統(tǒng)計受污染芋莖尖數(shù)目和轉(zhuǎn)綠數(shù)目，30 d統(tǒng)計莖尖周圍萌發(fā)的側(cè)芽數(shù)。試驗重復3次。轉(zhuǎn)綠率=未污染莖尖轉(zhuǎn)綠數(shù)/未污染莖尖數(shù)；側(cè)芽萌發(fā)系數(shù)=莖尖周圍萌發(fā)側(cè)芽總數(shù)/未污染莖尖轉(zhuǎn)綠數(shù)。

1.2.4 不同激素或生長調(diào)節(jié)劑處理對芋莖尖組織培養(yǎng)的影響

將剝?nèi)〉挠笄o尖組織接種到4種培養(yǎng)基中(表3)，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種2個芋莖尖。分別于接種后45 d統(tǒng)計莖尖周圍萌發(fā)的側(cè)芽數(shù)和側(cè)芽平均高度，試驗重復3次，各重復間隔1周。

1.2.5 抑菌劑處理對芋組織培養(yǎng)的影響

將剝?nèi)〉挠笄o尖組織接種到添加不同抑菌劑的培養(yǎng)基中，接種后7、20、30 d分別統(tǒng)計材料轉(zhuǎn)綠情況、污染情況和外植體生長情況。試驗重復3次，各重復間隔1周。

1.2.6 組培條件

溫度25 ℃，光照每天12 h，光強1 500 lx。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel表格和DPS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Duncan’s新復極差法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DsMV田間調(diào)查結(jié)果及RT-PCR結(jié)果

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，芋花葉病毒發(fā)病普遍(圖1)。將有病毒病癥狀的葉片進行RT-PCR(圖2)。

A、B—葉片葉脈間發(fā)黃、花葉；C、D—葉片葉脈間褪綠、皺縮。圖1 不同癥狀芋葉片

M—marker；1—CK；2～4—葉片具有皺縮褪綠癥狀的W1紅植株。圖2 芋花葉病毒RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

表1表明，葉脈間褪綠、皺縮癥狀葉片的DsMV帶毒率為100%，葉脈間發(fā)黃癥狀葉片的DsMV帶毒率僅為8.51%。結(jié)果表明，葉脈間褪綠及皺縮癥狀為DsMV的典型癥狀，而葉脈間發(fā)黃的癥狀可能是由于缺乏營養(yǎng)素、蟲害或者其他種類病害等造成。

表1 芋病毒病田間調(diào)查和RT-PCR結(jié)果

2.2 外植體不同消毒方式對芋莖尖初代培養(yǎng)的影響

對不同滅菌處理的芋莖尖組織培養(yǎng)過程中的污染率、轉(zhuǎn)綠率和側(cè)芽萌發(fā)系數(shù)等進行統(tǒng)計。表2表明，用有效氯含量為5%的次氯酸鈉作為滅菌劑，滅菌25 min時，芋莖尖組織初代培養(yǎng)過程中污染率最低。

表2 不同消毒方式下芋莖尖組培轉(zhuǎn)化增殖結(jié)果

用0.1%氯化汞作為滅菌劑，滅菌時長10 min，接種7 d污染率70.0%，隨著滅菌時間增加，污染率降低，滅菌25 min污染率最低為6.67%，接種7 d后外植體轉(zhuǎn)綠率顯著降低。

2.3 不同激素處理對芋莖尖初代培養(yǎng)的影響

從表3、圖3可以看出，使用不同激素對芋莖尖進行初代培養(yǎng)，不同處理側(cè)芽萌發(fā)系數(shù)不同，培養(yǎng)基中添加0.01 mg·L-1TDZ的芋芽側(cè)芽萌發(fā)系數(shù)最高，添加5.0 mg·L-16-BA的側(cè)芽萌發(fā)系數(shù)最低；不同處理組培苗植株高度差異也大，培養(yǎng)基中添加2.0 mg·L-16-BA的組培苗平均株高最高，添加5.0 mg·L-16-BA的株高最矮，兩者間差異極顯著。添加TDZ激素的處理芋莖尖側(cè)芽萌發(fā)系數(shù)高于6-BA；對于同種激素而言，使用濃度較低時更有利于莖尖組織擴增，且組培苗的生長更為健康。

表3 添加不同激素時芋莖尖組織培養(yǎng)結(jié)果

左中右分別為0.1 g·L-1苯甲酸鈉、2.0 mg·mL-1 6-BA、0.01 mg·mL-1 TDZ。圖3 芋莖尖組織接入不同培養(yǎng)基50 d的組培苗生長情況

2.4 不同抑菌劑對芋組織培養(yǎng)的影響

將滅菌處理的外植體接種于添加了抑菌劑的培養(yǎng)基中，試驗結(jié)果見表4。在芋初代培養(yǎng)中，苯甲酸鈉的抑菌效果最好，但添加苯甲酸鈉的外植體不能正常轉(zhuǎn)綠，說明苯甲酸鈉不適合在芋初代培養(yǎng)中使用(圖3中A)。2種濃度菌殺光處理抑菌效果與對照差異不大，轉(zhuǎn)綠莖尖組織生長速度和萌發(fā)芋芽數(shù)顯著低于對照。說明苯甲酸鈉和菌殺光都不適合在芋初代培養(yǎng)中使用。

3 小結(jié)與討論

長期無性繁殖使芋種帶毒嚴重，對芋產(chǎn)量和品質(zhì)都造成嚴重影響。調(diào)查清楚地方特色芋W1紅病毒病發(fā)生情況，優(yōu)化芋莖尖組培體系，為當?shù)靥厣蠓N質(zhì)資源創(chuàng)新利用提供技術支撐。

表4 添加不同抑菌劑時芋莖尖組織培養(yǎng)結(jié)果

本研究調(diào)查了W1紅田間病毒病發(fā)生情況，并用DsMV特異性分子標記引物對有病癥的植株進行RT-PCR檢測。結(jié)果表明，葉脈中間褪綠、皺縮可為DsMV特異性病癥，葉脈中間發(fā)黃和芋病毒病之間的關系還需進一步研究。比較外植體不同消毒處理的污染率、轉(zhuǎn)綠率和側(cè)芽萌發(fā)系數(shù)，用有效氯含量5%的次氯酸鈉消毒25 min，組培效率最高。比較6-BA和TDZ在芋莖尖組織培養(yǎng)過程中側(cè)芽萌發(fā)系數(shù)和組培苗生長狀況認為，相比TDZ，濃度為2.0 mg·L-1的6-BA更適合在紅芽多子芋中使用；在芋莖尖組培過程中，培養(yǎng)基中激素濃度高時，在莖尖基部形成大量愈傷組織，只有很少的愈傷組織能分化成苗，且這些苗多具有叢生、扁平、葉片細小、表面粗糙等特點；適合在芋莖尖組織培養(yǎng)過程中使用的抑菌劑種類、使用濃度以及使用時期等內(nèi)容還需進一步研究。

在試驗過程中還觀察到，不同季節(jié)進行芋莖尖組織培養(yǎng)操作時，莖尖組織側(cè)芽萌發(fā)系數(shù)和生長狀態(tài)存在差異，這可能與不同季節(jié)芋本身含有的激素物質(zhì)有關，具體原因還需進一步分析。本文只統(tǒng)計分析了各處理條件下芋莖尖的污染率、轉(zhuǎn)綠率、側(cè)芽萌發(fā)系數(shù)和芋苗株高等數(shù)據(jù)，對芋苗鮮重、根系活力、移栽成活率和移栽后種球大小等數(shù)據(jù)沒有進行研究，需要在后續(xù)研究中繼續(xù)進行。