果蔬及其制品中真菌毒素污染和管控策略研究

鄧濤，楊華，方曉斌，肖英平，汪雯，呂文濤，吳振，吉小鳳*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021；2.寧波大學 食品與藥學學院，浙江 寧波 315211；3.杭州牡丹面粉有限公司,浙江 杭州 310021)

果蔬及其制品富含維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，是我國居民膳食結(jié)構(gòu)中的重要組成部分。果蔬及其制品在采摘、加工、貯藏、運輸?shù)冗^程中，極易發(fā)生真菌性病害而引起腐爛或腐敗，部分真菌還可能產(chǎn)生真菌毒素。真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，可污染糧食、水果、蔬菜、食品、飼料、中草藥等多種農(nóng)產(chǎn)品，嚴重威脅食品安全、危害人畜健康。相關(guān)文獻報道，受地理條件和經(jīng)濟因素的制約，每年因病害的原因會造成果蔬總量35%～55%的損失[1]。這些腐敗變質(zhì)的果蔬不僅帶來了巨大的經(jīng)濟損失，而且多數(shù)真菌毒素性質(zhì)穩(wěn)定，難以通過貯藏、加工等條件徹底清除，對人體健康也存在著激素紊亂、致癌、致畸變等潛在的危害。本文對果蔬及其制品中真菌毒素污染所涉及的毒素種類進行分析和總結(jié)，探討果蔬及其制品中真菌毒素污染防控措施，以期為我國食品安全預(yù)警和真菌毒素污染防控研究提供一定的參考。

1 果蔬及其制品中常見的真菌毒素

1.1 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)是主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的帶有二呋喃環(huán)和香豆素結(jié)構(gòu)的次級代謝物。目前發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素的類型有20余種，在食品中檢出較多的有黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素M1(AFM1)和黃曲霉毒素M2(AFM2)等[2-3]。其中AFB1的毒性最強，對人和動物的危害最大，在1993年被國際癌癥研究機構(gòu)劃為Ⅰ類致癌物。GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》對熟制堅果及籽類(不含花生及其制品)中AFB1的限量標準為5 μg·kg-1；歐盟對直接食用的果仁、加工干果制品中AFB1的限量標準為2 μg·kg-1[2]。

黃曲霉毒素的生成與溫度、水分活度等因素密切相關(guān)，如李璇[4]研究發(fā)現(xiàn)，在28 ℃和30 ℃時可以促進黃曲霉菌生成黃曲霉毒素，在37 ℃和40 ℃時抑制黃曲霉菌生成黃曲霉毒素。王龑等[5]發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素生成時的水分活度受溫度影響，不同溫度條件下，適合產(chǎn)生黃曲霉毒素的水分活度不同。黃曲霉毒素在堅果和干果中污染嚴重，也存在于其他果蔬及其制品中但檢出率和檢出濃度較低，如Naeem等[6]對巴基斯坦的60批次果干樣品中黃曲霉毒素進行了篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFB1檢出率為86.7%，最大濃度為9.99 μg·kg-1；AFG1檢出率為81.7%，最大濃度為5.63 μg·kg-1；AFG2檢出率為60%，最大濃度為4.63 μg·kg-1；AFB1檢出率為58.3%，最大濃度為4.85 μg·kg-1。范楷等[7]對番茄和桃各150批次樣品中的黃曲霉毒素進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，番茄中AFB2的檢出率為1.3%，檢出濃度均值為0.1 μg·kg-1，AFB1、AFG1和AFG2未檢出；桃中AFB1的檢出率為0.7%，檢出濃度均值為0.1 μg·kg-1，AFB2、AFG1和AFG2未檢出。

1.2 鏈格孢霉毒素

鏈格孢霉毒素(alternaria toxins，ATs)是鏈格孢霉菌在適宜條件下產(chǎn)生的次級代謝物。鏈格孢霉菌能夠在低溫、潮濕環(huán)境下生長繁殖，也是果蔬及其制品在冷藏條件下發(fā)生腐敗變質(zhì)的重要因素[8-11]。目前在食品中發(fā)現(xiàn)的鏈格孢霉毒素達70余種，研究較多的有交鏈孢酚(alternaiol，AOH)、交鏈孢酚單甲醚(alternariol monomethyl ether，AME)、交鏈孢烯(altenuene，ALT)、交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid，TeA)、交鏈孢毒素Ⅰ(altertoxinⅠ，ATX-Ⅰ)和騰毒素(tentoxin，TEN)等。鏈格孢霉毒素具有細胞毒性、遺傳毒性、致癌性等危害，鏈格孢霉毒素與人類食管癌的發(fā)生密切相關(guān)[8,10,12]。目前除巴伐利亞對以高粱和小米為原料的嬰幼兒食品中TeA限量規(guī)定為500 μg·kg-1以外，無其他鏈格孢霉毒素相關(guān)的規(guī)定與標準[13]。

鏈格孢霉毒素在果蔬及其制品中較為常見的原因是鏈格孢霉菌不僅能在果蔬正常生長期間通過自然孔進入，還能在果蔬采摘后通過損傷部位或正常果蔬與損傷果蔬接觸進入果蔬內(nèi)部從而發(fā)生腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象[14-15]。溫度、水分、pH值和碳氮比等因素對鏈格孢霉菌產(chǎn)生鏈格孢霉毒素具有重要的影響，如Brzonkalik等[16]在生物反應(yīng)器培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)pH值在4.0～4.5，碳氮比為72時，AME、AOH和TeA的濃度最高；當pH值為5.5時，鏈格孢霉毒素的濃度顯著降低；pH值為8.0時，鏈格孢霉毒素的產(chǎn)生被完全抑制；同時鏈格孢霉毒素的濃度還隨著碳氮比的增加而提高，但碳氮比大于72后不能進一步促進鏈格孢霉毒素的產(chǎn)生。Pose等[17]研究了番茄果實中水分活度和溫度對鏈格孢霉毒素濃度的影響，發(fā)現(xiàn)在35 ℃和水分活度為95.4%時AME的濃度最高，21 ℃和水分活度為98.2%時TeA的濃度最高，21 ℃和水分活度為95.4%時AOH的濃度最高，在6 ℃及以下貯藏番茄和高水分的番茄制品較為安全。

鏈格孢霉毒素在果蔬及其制品中的檢出率和檢出濃度較高，如Puntscher等[18]從奧地利的番茄醬中檢出了AOH、AME、TeA和TEN，濃度分別為20 μg·kg-1、4 μg·kg-1、322 μg·kg-1和0.6 μg·kg-1。Fan等[19]對新疆采集的104批次新鮮水果中6種鏈格孢霉毒素進行了篩查，發(fā)現(xiàn)AME的檢出率最高為69.23%，檢出濃度為0～473.32 μg·kg-1；TEN檢出率為40.38%，檢出濃度為0～113.34 μg·kg-1；TeA檢出率為24.04%，檢出濃度為0～7 830.19 μg·kg-1；AOH檢出率為13.46%，檢出濃度為0～574.51 μg·kg-1；ATX-1檢出率為7.69%，檢出濃度為0～145.6 μg·kg-1；ALT檢出率為3.85%，檢出濃度為0～116.2 μg·kg-1。

1.3 赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素是由曲霉屬、青霉屬等真菌產(chǎn)生的多酮類次級代謝物，其中赭曲霉毒素A (ochratoxin A，OTA)分布范圍廣，對人體造成免疫毒性、致癌性、腎毒性、肝毒性和致畸性等危害，被國際癌癥研究機構(gòu)歸類為2B類致癌物質(zhì)[20]。GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》對葡萄酒中赭曲霉毒素A的限量標準為2.0 μg·kg-1；歐盟對葡萄干、葡萄酒和葡萄汁中赭曲霉毒素A的限量標準分別為10.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1[21]。

赭曲霉毒素A在果蔬及其相關(guān)制品中較為常見，這可能與果蔬在采摘后易損傷，且含有高水分、高糖分適宜病原菌的生長有關(guān)。Schmidt-Heydt等[22]研究了溫度、濕度和pH值對OTA產(chǎn)生菌Penicilliumverrucosum的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在溫度為25～30 ℃，濕度為98%，pH值為6～8時OTA的濃度最高。赭曲霉毒素A 在葡萄及其相關(guān)制品中檢出率居高不下，如Serra等[23]對葡萄牙的11批次葡萄樣品進行了篩查，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)OTA的檢出率為27.3%，檢出濃度為0.035～0.061 μg·kg-1。Wang等[24]對中國采集的30批次葡萄干樣品進行了篩查，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)OTA的檢出率為6.7%，檢出濃度為4.55～7.42 μg·kg-1。Yusefi等[25]對伊朗的70批次葡萄汁樣品進行了篩查，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OTA的檢出率為55.7%，檢出濃度為0.125～2.6 μg·kg-1。

1.4 展青霉素

展青霉素(patulin，PAT)是由棒曲霉、擴展青霉和曲青霉等真菌產(chǎn)生的次級代謝物。展青霉素可以影響細胞膜的通透性對人體產(chǎn)生生理異常的現(xiàn)象，如嘔吐等，還具有神經(jīng)毒性、免疫毒性等危害，被國際癌癥研究機構(gòu)歸為第三類可疑致癌物質(zhì)[26]。GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》對水果及其制品、果蔬汁和酒類(僅限蘋果和山楂)中PAT的限量標準為50.0 μg·kg-1；歐盟規(guī)定果汁類產(chǎn)品中PAT的限量標準為50.0 μg·kg-1，兒童和嬰兒食品中PAT的限量標準為10.0 μg·kg-1[27]。

展青霉素的病原菌主要是在果蔬貯藏和運輸過程中通過損傷部位和自然孔侵入，其中擴展青霉是引起果蔬及其制品腐敗變質(zhì)的主要菌種[28]，如蘋果的青霉病和軟腐病等。在外界因素方面，Zong等[29]研究了不同pH值、碳源和氮源對擴展青霉菌體生物量和展青霉素濃度的影響，結(jié)果表明，在pH值為4～5，碳源為麥芽糖、蔗糖和葡萄糖，氮源為蛋白胨、谷氨酸和酵母提取物時，擴展青霉的數(shù)量最多，展青霉素的濃度最高。展青霉素在水果及其液體制品中污染情況較為嚴重[30]，如Lee等[31]對馬來西亞的56批次果汁進行了篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAT檢出率為5.4%，檢出濃度為13.1～33.7 μg·kg-1。Zaied等[32]對突尼斯的85批次蘋果產(chǎn)品進行了篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAT的檢出率為35%。Ji等[33]對中國市場銷售的137批次水果產(chǎn)品進行了篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAT檢出率為30.7%，檢出濃度為10.0～276.9 μg·kg-1。

1.5 單端孢霉烯族毒素

單端孢霉烯族毒素(trichothecene toxins，TCs)主要是由鐮刀菌、木霉和單端孢霉等病原菌產(chǎn)生的次級代謝物[34]。單端孢霉烯族毒素中因毒性大、檢出率高而備受關(guān)注的毒素主要有T-2毒素、HT-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)及其衍生物、雪腐鐮刀菌醇(nivalenol，NIV)、新茄病鐮刀菌烯醇毒素、白僵菌素和恩鐮孢菌素等。這些單端孢霉烯族毒素具有免疫抑制、致癌性、致畸變和細胞毒性等危害[34-35]。

多數(shù)單端孢霉烯族毒素的病原菌在采摘前后通過自然孔和損傷部位進入果蔬內(nèi)部，而且在室溫、潮濕的酸性環(huán)境下生長迅速[28]。Merhej等[36]研究了溫度、濕度和pH值對T-2毒素和HT-2毒素濃度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在20 ℃，高水分含量的酸性環(huán)境下T-2毒素和HT-2毒素的濃度更高。單端孢霉烯族毒素在果蔬及其制品中的污染范圍較廣，尤其是近年來發(fā)現(xiàn)的新型真菌毒素，如白僵菌素和恩鐮孢菌素檢出率一直居高不下，Tolosa等[35]對74批次堅果、果干和紅棗中的白僵菌素和恩鐮孢菌素進行了篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堅果、果皮、果干和紅棗的檢出率分別為50.0%、80.0%、35.7%和83.3%，堅果中恩鐮孢菌素A的檢出率最高(45.2%)，棗中恩鐮孢菌素B的檢出率最高(58.3%)，果皮具有一定的保護作用，防止真菌毒素的污染。Tang等[37]對由Trichotheciumroseum引起的心腐病蘋果中檢測出T-2毒素的濃度為7.1～128.4 μg·kg-1；新茄病鐮刀菌烯醇毒素的濃度為14.7 μg·kg-1。

2 果蔬及其制品的管控策略

2.1 采收前管控

控制果蔬中真菌毒素在田間產(chǎn)生大量的積累，減少霉菌的產(chǎn)生，而采取一定的生產(chǎn)措施是必不可少的。如對蔬菜及部分水果種植的土地采取定期輪作，由于果蔬的秸稈能為病原菌的生長提供營養(yǎng)條件，在采摘結(jié)束后，通過深耕的方式消滅雜草和果蔬的秸稈，減少土壤中的霉菌數(shù)量，為下次果蔬種植提供良好的環(huán)境。果蔬在生長過程中極易受到病蟲的啃食，霉菌可以通過損傷部分大批量的進入果蔬內(nèi)部，在種植時選擇具有毒素抗性的植株，并通過藥劑拌種、黑光燈誘殺以及噴灑農(nóng)藥等方式，減少病蟲的危害。此外，還得注意采摘時的天氣情況，潮濕的環(huán)境中更容易滋生霉菌[17,22]。

2.2 采收后管控

果蔬在采摘后首先通過人工、機械等方式進行分類，剔除腐敗變質(zhì)的果蔬，是減少果蔬及其制品中真菌毒素污染的有效方法。此外，熱處理方法如水浴、晾曬等方式，可以抑制果蔬中霉菌的生長以及減少真菌毒素的含量。如吳秀[38]研究發(fā)現(xiàn)，西藍花在55 ℃和85 ℃條件下水浴加熱10 min，能夠抑制A.alternata的菌絲生長和孢子萌發(fā)。在貯藏期間，當霉菌進入果蔬內(nèi)部后：可采用化學控制法如臭氧技術(shù)，通過強氧化作用改變真菌毒素的分子結(jié)構(gòu),導(dǎo)致其生物活性的改變,從而起到解毒作用[39]。如Young等[40]使用25 mg·kg-1的飽和臭氧水處理10 種單端孢霉烯族毒素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無毒素殘留。伍小紅等[41]使用1.17 mg·L-1的臭氧水清洗蘋果10 min，發(fā)現(xiàn)各項貯藏指標均優(yōu)于未處理的蘋果。也可采用生物控制法，如富集菌株(如枯草芽孢桿菌等)和次級代謝物通過拮抗、抑制以及微生物發(fā)酵等作用來抑制果蔬中霉菌的生長以及對產(chǎn)生的真菌毒素進行分解，Meca等[42]發(fā)現(xiàn)，葡萄在發(fā)酵過程中可以降低AFB1的產(chǎn)生；Farzaneh等[43]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌能夠降解開心果中的AFB1。

2.3 生產(chǎn)、加工、貯藏過程中管控

生產(chǎn)、加工過程中遵循良好農(nóng)業(yè)規(guī)范原則對果蔬及其制品進行良好的加工規(guī)范和貯藏規(guī)范，避免機械性損傷、鼠蟲侵害，從而降低真菌毒素的污染。然后根據(jù)果蔬類型的不同，在貯藏期間還要注意溫度、水分、pH值等因素，如間歇光照可減少貯藏過程中鏈格孢霉菌對芒果的污染[44]。但目前果蔬制品的生產(chǎn)、加工以中小型企業(yè)為主，生產(chǎn)工藝不規(guī)范，缺乏消除和檢測真菌毒素的技術(shù)手段等問題。因此，相關(guān)部門應(yīng)對果蔬的種植和加工人員進行技術(shù)指導(dǎo)以及開展講座，提高食品安全意識。

此外，在保證果蔬自身質(zhì)量、貯藏環(huán)境安全和規(guī)范加工技術(shù)等因素的前提下，還應(yīng)注意包裝材料的選擇，如低密度聚乙烯包裝材料具有良好的熱封性，但防潮、防氣性能差，極易為病原菌的生長繁殖提供有利條件[6]。如John等[45]研究了低密度聚乙烯、聚丙烯和聚乳酸-聚乙二醇共聚物3種包裝材料對病原菌在花生內(nèi)產(chǎn)生AFB1的影響，結(jié)果表明，聚乳酸-聚乙二醇共聚物包裝材料由于具有極佳的隔熱、隔氧性能，包裝后檢測到AFB1濃度最低，其次為聚丙烯包裝材料，最后在低密度聚乙烯包裝材料中檢測到AFB1濃度最高。

2.4 檢測技術(shù)開發(fā)

隨著科技的不斷進步，目前針對果蔬及其制品的檢測技術(shù)也十分繁多，主要分為兩大類：一類為精確定量檢測技術(shù)，包括高效液相色譜、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和高效氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等；另一類為快速檢測技術(shù)，包括酶聯(lián)免疫法、生物傳感器和免疫層析法等。

精確定量檢測技術(shù)具有靈敏度高、檢測限低、高通量、分離性能好和檢測真菌毒素種類多、范圍廣等特點，相較于快速檢測技術(shù)實驗結(jié)果擁有更高的準確度和精密度。真菌毒素檢測的難點主要體現(xiàn)在樣品基質(zhì)成分復(fù)雜，對目標化合物的信號響應(yīng)產(chǎn)生增強或抑制的作用，干擾實驗結(jié)果的準確性。因此，樣品在實際檢測前通常需要進行前處理，將目標化合物從樣品中提取出來，如Xing等[46]通過改良的QuEChERS方法進行前處理結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測混合果泥樣品中7種鏈格孢霉毒素，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鏈格孢霉毒素在0.5～200 μg·kg-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2大于 0.992 5，檢出限在0.18～0.53 μg·kg-1，在5、10、20 μg·kg-1三擋加標濃度下回收率范圍為79.5%～106.7%，相對標準偏差小于9.78%。

快速檢測技術(shù)具有操作簡單、檢測時間短和成本低等特點，相較于精確定量檢測技術(shù)能在果蔬及其制品在貯藏、加工、運輸和銷售等過程中及時而全面的監(jiān)控真菌毒素的污染狀況。目前快速檢測技術(shù)主要是以抗原和抗體結(jié)合的特異性為基礎(chǔ)進行開發(fā)研究，如在食品領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用的免疫層析試紙條、電化學免疫傳感器和膠體金檢測等，Taghdisi等[47]提出了一種基于非靶標觸發(fā)滾動循環(huán)擴增的電化學適配體傳感器測定葡萄汁中的OTA，加標回收率為92.0%～103.2%，相對標準偏差為3.15%～7.50%。此外，為提高快速檢測技術(shù)實驗結(jié)果的準確性，也在不斷地開發(fā)新型生物材料、檢測元件等物質(zhì)，如核酸適配體、模擬肽和分子印跡聚合物等，理論上這些物質(zhì)在未來快速檢測的應(yīng)用中不僅可以有效地避免實驗結(jié)果的假陽性現(xiàn)象，還具有綠色環(huán)保等特點。

2.5 風險研究和監(jiān)測預(yù)警

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展和食品安全意識的不斷提升，世界各國都開始針對食品中的真菌毒素開展風險研究，并在監(jiān)測預(yù)警工作中應(yīng)用。果蔬及其制品中真菌毒素種類多、含量低，主要對人體造成慢性危害。黃曲霉毒素、鏈格孢霉毒素、赭曲霉毒素、展青霉素和單端孢霉烯族毒素等都具有致癌性，而且廣泛分布在果蔬及其制品中，相較于食品添加劑、農(nóng)藥殘留等，真菌毒素的膳食風險程度更高。因此，我國的食品監(jiān)管部門及衛(wèi)生相關(guān)部門，必須加大對果蔬及其制品中真菌毒素的風險研究和監(jiān)測預(yù)警。

3 小結(jié)

果蔬及其制品在種植、加工、貯藏、運輸和銷售等過程中，存在諸多因素會造成病原菌的侵入和真菌毒素的生成，如溫度、濕度、光照時間、pH值、蟲害和機械性損傷等。任何過程的處理不當，都會造成真菌毒素在果蔬及其制品內(nèi)部的積累。真菌毒素對果蔬及其制品的污染，不僅對人體健康存在潛在危害，還會影響果蔬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，首先通過加強真菌毒素檢測手段研究，及時、全面的了解果蔬及其制品中污染情況，快速、高效的完成新型真菌毒素的排查和風險評估，確定引起真菌毒素的原因及對人體健康的危害水平，為相關(guān)部門的監(jiān)管和管控措施的實際應(yīng)用提供參考；其次通過規(guī)范工藝流程、合理控制貯藏條件、減少蟲害以及機械性損害等，降低真菌毒素的污染；最后通過種植、加工技術(shù)指導(dǎo)以及開展講座，提高種植戶和生產(chǎn)企業(yè)食品安全意識，進而綜合防控真菌毒素對果蔬及其制品的污染。